專利名稱：放線菌制劑及其在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵制品，尤其涉及一種放線菌制劑及其在殺滅或抑制植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用以及利用該放線菌制劑為活性成分制備的殺蟲劑，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
農(nóng)用殺蟲制劑要求具有較低毒性及低殘留性質(zhì)。農(nóng)用抗生素低毒低殘留，能夠抑制病原微生物的生長(zhǎng)和繁殖，或者能改變病原菌的形態(tài)而達(dá)到保護(hù)作物的效果。放線菌的突出特性就是能產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素，是產(chǎn)抗生素最多的一類微生物?？股氐纳飳W(xué)作用廣泛，多數(shù)抗生素都能不同程度的表現(xiàn)出抗菌活性，少數(shù)種類還具有抗病毒、抗其它病原體、抗腫瘤活性。如申請(qǐng)?zhí)枮?00610122277. 7的中國(guó)發(fā)明專利，公開了一種土壤放線菌發(fā)酵液的提取物及其制備方法和應(yīng)用。提取物的制備方法如下將高氏一號(hào)培養(yǎng)基制成試管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28°C培養(yǎng)7 10天；將斜面中成熟菌株制成孢子懸浮液，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為8 16%，通氣量為 1 0. 6 1. 2 V/Vmin,發(fā)酵溫度為沈 32°C，發(fā)酵培養(yǎng)周期為72 108小時(shí)，得到發(fā)酵液； 將發(fā)酵液離心分離，棄去上清液，保留菌絲，用體積百分比為60 80%丙酮浸泡菌絲8 M 小時(shí)，離心除去菌絲體，保留濾液；用大孔吸附樹脂對(duì)濾液進(jìn)行吸附，用丙酮洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，得到棕色油狀物，即為土壤放線菌發(fā)酵液的提取物；所述菌株為土壤放線菌 ⑶PPRA 3704，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏號(hào)為CCTCC No: M 2060670。小菜蛾和中華鰻對(duì)該提取物較敏感，較低濃度已具有殺滅作用，可望制成生物農(nóng)藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。然而，據(jù)申請(qǐng)人了解，關(guān)于放線菌制劑防治植物寄生性線蟲方面報(bào)道很少，而有明顯防治效果的更是鮮見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題，提供一種能夠殺滅或抑制植物寄生性線蟲的放線菌制劑。本發(fā)明所述的放線菌，拉丁學(xué)名為Micromonospora humi。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的
放線菌制劑，它是由以下方法制備的①對(duì)土壤樣本進(jìn)行放線菌的分離操作，獲得放線菌菌種；②對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在20 30°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)5 10d，得發(fā)酵液；③發(fā)酵完成后，加入多于發(fā)酵液體積的甲醇，然后攪拌、離心分離、取上清液，然后對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述土壤是紅樹林中的土壤。該土壤的選取方法如下，在離目標(biāo)樹種2 m內(nèi)的范圍內(nèi)，選擇表土下5 20厘米深度的土壤。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述培養(yǎng)基為，以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉1 5%，葡萄糖0. 5 3%，酵母膏0. 1 0. 2%,酪蛋白0. 15 0. 4%,牛肉膏0. 1 0. 2%,碳酸鈣 0. 1 0. 3%，余下為水。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述甲醇的加入量為所述發(fā)酵液體積的小于等于2 倍，對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮時(shí)，將上清液濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4 1/3。加入甲醇的目的，一是把發(fā)酵液中的某些成分溶解出來，包括存在于放線菌菌體內(nèi)的能夠殺滅或者抑制植物寄生性線蟲的物質(zhì)，二是使發(fā)酵液各成分更穩(wěn)定；在隨后的蒸發(fā)過程會(huì)把甲醇除去，然后獲得較為純凈的制劑。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，在所述發(fā)酵液中加入甲醇后，用磁力攪拌器攪拌過夜。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，在離心分離時(shí)，轉(zhuǎn)速3500 4500rpm，時(shí)間8 12min。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述甲醇的加入量為所述發(fā)酵液體積的小于等于2 倍，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后離心分離，得上清液，然后對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮的操作以除去甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4 1/3。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用拉丁學(xué)名為Micromonospora humi的放線菌制成的制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述任一放線菌制劑的在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供一種由上述任一放線菌制劑為活性成分的殺線蟲制劑。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明提供的一種放線菌制劑在處理植物寄生性線蟲時(shí)具有有效的殺滅或抑制作用。
具體實(shí)施例方式本具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的解釋，其并不是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對(duì)本實(shí)施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。實(shí)施例一 (一)菌種的制備 1 土壤樣品
于2008年6月，在海南省文昌清瀾港紅樹林保護(hù)區(qū)采集紅樹林植物的土壤。2培養(yǎng)基
麥芽汁一酵母膏瓊脂(YE)、淀粉酪素瓊脂(SC)、葡萄糖天冬氨酸瓊脂(GA ) 3采樣方法
土壤樣品是在離目的樹種1 2 m的范圍內(nèi)，選擇表土下5 20厘米深度的土壤，將土壤裝入滅菌的紙帶里，編號(hào)注明采土?xí)r間，地點(diǎn)，地表植被等。樣品采集后放入無菌塑料封口袋內(nèi)，冷藏，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并立即進(jìn)行樣品處理。4 步驟
1)稱取2g樣品到含有1. 5%苯酚或0. 05% SDS、6%酵母膏的20mL無菌海水中，30°C、 200r/min 下振蕩 30min ；
2)然后取1 ml按梯度稀釋法稀釋至10_3、10_4和10_5，各取0. 2 ml分別涂平板，平板培養(yǎng)基分別為麥芽汁一酵母膏瓊脂(YE)、淀粉酪素瓊脂(SC)、葡萄糖天冬氨酸瓊脂(GA )；
3)培養(yǎng)7 10d，挑菌；
4)待平板長(zhǎng)菌落出后，菌株用光電顯微鏡(型號(hào)XS-212-202)，在油鏡下觀察菌落形態(tài)；
5)挑菌落待平板長(zhǎng)出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種；對(duì)于已經(jīng)提純的菌種，轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基，用牛皮紙包好，置-20°C冰箱中保存。(二)發(fā)酵培養(yǎng)
對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在20°C溫度下， 200rpm震蕩培養(yǎng)5d，得發(fā)酵液；發(fā)酵完成后在發(fā)酵液中加入1倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后3500rpm，8min離心分離，取上清液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4，制得放線菌制劑。所述培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉1%，葡萄糖0. 5%，酵母膏0. 1%， 酪蛋白0. 15%，牛肉膏0. 1%，碳酸鈣0. 1%，余下為水，pH 7.0 9.0。實(shí)施例二
(一)菌種的制備
采用實(shí)施例一所得的菌種
(二)發(fā)酵培養(yǎng)
對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在22°C溫度下， 200rpm震蕩培養(yǎng)6d，得發(fā)酵液；發(fā)酵完成后在發(fā)酵液中加入1倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，9min離心分離，取上清液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4，制得放線菌制劑。所述培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉洲，葡萄糖1%，酵母膏0. 1%，酪蛋白0. 2%，牛肉膏0. 1%，碳酸鈣0. 1%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實(shí)施例三
(一)菌種的制備
采用實(shí)施例一所得的菌種
(二)發(fā)酵培養(yǎng)
對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在溫度下， 200rpm震蕩培養(yǎng)7d,得發(fā)酵液；發(fā)酵完成后在發(fā)酵液中加入1. 5倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，IOmin離心分離，取上清液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4，制得放線菌制劑。所述培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉3%，葡萄糖洲，酵母膏0. 15%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 1%，碳酸鈣0. 2%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實(shí)施例四
(一)菌種的制備
采用實(shí)施例一所得的菌種
(二)發(fā)酵培養(yǎng)
對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在26°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)8d，得發(fā)酵液；發(fā)酵完成后在發(fā)酵液中加入2倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，IOmin離心分離，取上清液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/3，制得放線菌制劑。所述培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉4%，葡萄糖2%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 2%，碳酸鈣0. 2%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實(shí)施例五
(一)菌種的制備
采用實(shí)施例一所得的菌種
(二)發(fā)酵培養(yǎng)
對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在溫度下， 200rpm震蕩培養(yǎng)9d，得發(fā)酵液；發(fā)酵完成后在發(fā)酵液中加入2倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，Ilmin離心分離，取上清液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/3，制得放線菌制劑。所述培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉4%，葡萄糖3%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 2%，碳酸鈣0. 2%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實(shí)施例六
(一)菌種的制備
采用實(shí)施例一所得的菌種
(二)發(fā)酵培養(yǎng)
對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在30°C溫度下， 200rpm震蕩培養(yǎng)10d，得發(fā)酵液；發(fā)酵完成后在發(fā)酵液中加入2倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4500rpm，12min離心分離，取上清液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/3，制得放線菌制劑。所述培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉5%，葡萄糖3%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 4%，牛肉膏0. 2%，碳酸鈣0. 3%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實(shí)施例二放線菌制劑殺根結(jié)線蟲活性測(cè)定 1.方法
①將土和沙按一定比例均與攪拌，裝入盆中；
②移栽10天的黃瓜苗一株；
③打入300ul的待試藥品；
④處理一天；
⑤打入3000個(gè)根結(jié)線蟲蟲卵；
⑥40天后觀察黃瓜苗根部情況。2.根結(jié)線蟲發(fā)病等級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)字0 10個(gè)；
M級(jí)10 20個(gè)； 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.放線菌制劑，它是由以下方法制備的①對(duì)土壤樣本進(jìn)行放線菌的分離操作，獲得放線菌菌種；②對(duì)所述放線菌菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體為將所述菌種接種至培養(yǎng)基，在 20 30°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)5 10d，得發(fā)酵液；③發(fā)酵完成后，加入多于發(fā)酵液體積的甲醇，然后攪拌、離心分離、取上清液，然后對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮以除去所述甲醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述土壤是紅樹林中的土壤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述培養(yǎng)基為，以重量百分比計(jì)，可溶性淀粉1 5%，葡萄糖0. 5 3%，酵母膏0. 1 0. 2%，酪蛋白0. 15 0. 4%，牛肉膏0. 1 0. 2%，碳酸鈣0. 1 0. 3%，余下為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述甲醇的加入量為所述發(fā)酵液體積的小于等于2倍，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮時(shí)，將上清液濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4 1/3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于在所述發(fā)酵液中加入甲醇后，用磁力攪拌器攪拌過夜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于在離心分離轉(zhuǎn)速3500 4500rpm，時(shí)間 8 12min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述甲醇的加入量為所述發(fā)酵液體積的小于等于2倍，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后離心分離，得上清液，然后對(duì)上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的操作以除去甲醇，濃縮至所述發(fā)酵液體積的1/4 1/3。
8.用拉丁學(xué)名為Micromonosporahumi的放線菌制成的制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-7任一所述的放線菌制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用。
10.一種殺線蟲制劑，其特征在于，它是由權(quán)利要求1-7任一所述的放線菌制劑為活性成分制備的。
全文摘要
本發(fā)明涉及放線菌制劑及其在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用。屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了用拉丁學(xué)名為Micromonosporahumi的放線菌制成的制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用，公開了一種放線菌制劑，公開了所述的放線菌制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應(yīng)用，也公開了由所述的放線菌制劑為活性成分制備的殺線蟲劑。本發(fā)明提供的一種放線菌制劑在處理植物寄生性線蟲時(shí)具有有效的殺滅或抑制作用。
文檔編號(hào)C12P1/06GK102533869SQ201210009989
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者張海風(fēng), 張莉, 張鵬, 徐玲娜, 洪葵, 高丙利 申請(qǐng)人:高丙利