本發(fā)明涉及一種微生物及其在制藥領(lǐng)域中應(yīng)用，具體地說(shuō)是桔橙指孢囊菌通過(guò)調(diào)控微生物代謝獲得非達(dá)霉素的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：非達(dá)霉素(fidaxomicin，商品名dificid，曾用名opt-80，par-101)，是具有18元環(huán)結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可由桔橙指孢囊菌hamdenensis亞種(dactylosporangiumaurantiacumsubspeciehamdenensis)發(fā)酵而得，具體可由放線菌指孢囊菌nrrl18085產(chǎn)生。桔橙指孢囊菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物是一族與非達(dá)霉素結(jié)構(gòu)非常相近的產(chǎn)物，稱為臺(tái)勾霉素(tiacumicins)，按結(jié)構(gòu)不同，分別稱為臺(tái)勾霉素a、b、c、d、e和f。非達(dá)霉素為r構(gòu)型的臺(tái)勾霉素b，具有新型的作用機(jī)制(結(jié)構(gòu)式如下所示)。非達(dá)霉素于2011年5月獲美國(guó)fda批準(zhǔn)上市，用于治療艱難梭菌(難辨梭狀芽孢桿菌，clostridiumdifficile)感染相關(guān)性腹瀉(cdad)。這是fda近30年來(lái)批準(zhǔn)的首個(gè)治療cdad的藥物，歐盟2011年12月批準(zhǔn)上市。中國(guó)專利文獻(xiàn)03818016.2(發(fā)明名稱：臺(tái)勾霉素的制備)公開了制備臺(tái)勾霉素b的方法，所制備得到發(fā)酵產(chǎn)物中，含有較高的副產(chǎn)物、雜質(zhì)(見附圖1)。中國(guó)專利文獻(xiàn)201310208223.2(發(fā)明名稱：一種游動(dòng)放線菌菌株及其在制備非達(dá)霉素中的應(yīng)用)公開了其制備得到發(fā)酵產(chǎn)物的hplc分析圖(見附圖2)，圖中顯示發(fā)酵產(chǎn)物中含有較多的副產(chǎn)物和雜質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員均知道現(xiàn)有技術(shù)制備得的非達(dá)霉素發(fā)酵產(chǎn)物中含有較多的雜物、副產(chǎn)物，這些物質(zhì)的存在將對(duì)后續(xù)的提純帶來(lái)很大的難度，對(duì)于一些在提純環(huán)節(jié)中很難去除的雜質(zhì)，將嚴(yán)重影響最終藥品的質(zhì)量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種發(fā)酵穩(wěn)定、副產(chǎn)物少的非達(dá)霉素產(chǎn)生菌，同時(shí)提供該菌株在制備非達(dá)霉素中的應(yīng)用，以及具體的發(fā)酵制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種桔橙指孢囊菌，分類命名為dactylosporangiumaurantiacumfid1307，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(簡(jiǎn)稱cctcc)，保藏號(hào)為：cctccno：m2017311，保藏日期為：2017年6月7日。所述的保藏號(hào)為cctccno：m2017311的菌株的菌落特征：菌落近圓形，表面平整，菌落直徑1～2mm，中間隆起，無(wú)分泌物和可溶性色素產(chǎn)生。所述的保藏號(hào)為cctccno：m2017311菌株可應(yīng)用于發(fā)酵制備非達(dá)霉素。該制備方法包括下列步驟：a.菌株采用保藏編號(hào)為cctccno：m2017311的菌株；b.將按常規(guī)方法制備的30％甘油菌絲冷凍管，按搖瓶種子培養(yǎng)基體積的3～5％的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，220～260rpm，培養(yǎng)2～3天，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1～0.2％的接種量接種于種子罐，120～200rpm，培養(yǎng)3～4天，得罐種子液；將罐種子液按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積5～15％的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，150～200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)9～12天，收集發(fā)酵液中的樹脂；其中培養(yǎng)溫度均為26～30℃。其中所述的搖瓶種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為：每100ml培養(yǎng)基中，碳源1～4.5g，氮源4～7.7g，無(wú)機(jī)鹽0.1～0.4g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為：每100ml培養(yǎng)基中，碳源1.5～6g，氮源5～9g，無(wú)機(jī)鹽0.2～0.6g，其余為水；發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為：每100ml培養(yǎng)基中，碳源4.5～10g，氮源1.7～5g，無(wú)機(jī)鹽0.8～1.8g，樹脂3～6g，其余為水；其中所述的培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中比例，搖瓶種子培養(yǎng)基優(yōu)選比例為：每100ml培養(yǎng)基中，碳源2～3g，氮源5～7g，無(wú)機(jī)鹽0.2～0.3g，其余為水；種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的優(yōu)選比例為：每100ml培養(yǎng)基中，碳源2～4g，氮源6～8g，無(wú)機(jī)鹽0.3～0.5g，其余為水；發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的優(yōu)選比例為：每100ml培養(yǎng)基中，碳源5～8g，氮源2～4g，無(wú)機(jī)鹽0.8～1.2g，樹脂4～5g，其余為水。其中所述的碳源選自蔗糖、葡萄糖、燕麥粉、d-木糖、d-核糖、半乳糖、麥芽糖、麥芽糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米糊精、甘油中的一種或幾種；氮源選自酸水解酪蛋白、牛肉浸膏、酵母膏、酵母浸出粉、麥芽浸出粉、酵母粉、大豆蛋白胨、蛋白胨、麩質(zhì)粉、棉籽粉、黃豆餅粉、玉米漿粉、玉米蛋白粉、尿素中的一種或幾種；無(wú)機(jī)鹽選自檸檬酸鹽、硝酸鉀、caco3、k2hpo4、mnso4.7h2o、nacl、mgso4.7h2o、feso4.7h2o、kh2po4中的一種或幾種；樹脂選自hz818、pad900、hb60中的任一種。其中所述的培養(yǎng)基優(yōu)選為：碳源為葡萄糖、玉米淀粉中的一種或幾種；氮源為牛肉浸膏、酵母粉、黃豆餅粉、大豆蛋白胨、玉米蛋白粉、棉籽粉的一種或幾種；無(wú)機(jī)鹽為k2hpo4、kh2po4、caco3的一種或幾種；樹脂為hz818或pad900。本發(fā)明所述的保藏號(hào)為cctccno：m2017311的菌株是目前可用于大規(guī)模生產(chǎn)的菌株。發(fā)酵過(guò)程是非達(dá)霉素生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)，本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵和10噸發(fā)酵罐試驗(yàn)，其生產(chǎn)能力穩(wěn)定。經(jīng)檢測(cè)，用本發(fā)明提供的菌株及發(fā)酵培養(yǎng)可獲得發(fā)酵效價(jià)較高的非達(dá)霉素，同時(shí)發(fā)酵副產(chǎn)物較少、產(chǎn)物組分單一、同系物雜峰較少，經(jīng)hplc檢測(cè)，非達(dá)霉素歸一化含量40～43％。從而為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)，降低了后續(xù)提取的難度，從而有利于高品質(zhì)的非達(dá)霉素的獲得，在工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。以本發(fā)明的菌種制備得到的發(fā)酵液與中國(guó)專利文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)酵液經(jīng)hplc對(duì)比，很明顯本發(fā)明的發(fā)酵液雜質(zhì)少，有效物質(zhì)濃度較高，有利于大生產(chǎn)。菌株保藏情況：保藏于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno：m2017311。保藏日期為2017年6月7日。附圖說(shuō)明圖1為中國(guó)專利文獻(xiàn)03818016.2中的發(fā)酵液hplc圖圖2為中國(guó)專利文獻(xiàn)201310208223.2中的發(fā)酵液hplc圖圖3為本發(fā)明實(shí)施例2發(fā)酵液hplc圖圖4為本發(fā)明實(shí)施例3發(fā)酵液hplc圖圖5為本發(fā)明實(shí)施例4發(fā)酵液hplc圖圖6為本發(fā)明實(shí)施例5發(fā)酵液hplc圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例為本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術(shù)參數(shù)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1：保藏號(hào)為cctccno：m2017311菌株的培養(yǎng)及生理生化特征和碳源利用情況1、保藏號(hào)為cctccno：m2017311菌株培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征將保藏號(hào)為cctccno：m2017311菌株接種于isp2(酵母膏麥芽浸出粉瓊脂)培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)10～14天，觀察菌落的形態(tài)特征并進(jìn)行描述。觀察發(fā)現(xiàn)該菌落生長(zhǎng)豐富，14天直徑1～2mm；培養(yǎng)前期菌落近圓形，培養(yǎng)后期邊緣不規(guī)則突起，中心凹陷；菌絲顏色淺橘色至淡粉紅色，無(wú)分泌物和可溶性色素產(chǎn)生。2、保藏號(hào)為cctccno：m2017311菌株生理生化培養(yǎng)特征菌株在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征列見下表1所示。表1cctccno：m2017311菌株培養(yǎng)特征培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況菌苔顏色可溶性色素isp2酵母膏麥芽浸出粉瓊脂培養(yǎng)基+++淺橘色-isp3燕麥粉瓊脂++藕色-isp4無(wú)機(jī)鹽－淀粉瓊脂++淺藕色-isp5甘油天門冬素瓊脂+-淺藕色-isp6蛋白胨酵母膏浸汁鐵瓊脂++淺黃色-isp7酪氨酸瓊脂+-淺藕色-+：生長(zhǎng)一般；++：生長(zhǎng)中等；+++：生長(zhǎng)豐富；—：缺乏在isp2培養(yǎng)基中基絲少，短，不規(guī)則分枝，無(wú)氣絲，在某些瓊脂培養(yǎng)基的表面形成指狀孢子囊。此次試驗(yàn)以蛋白胨-磷酸鹽為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，定期進(jìn)行觀察。結(jié)果如下表2所示，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能同化蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、d-木糖、甘油、半乳糖、d-核糖等，不能利用d-阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、d-果糖、乳糖、山梨糖等。表2cctccno：m2017311的碳源利用情況碳源生長(zhǎng)情況蔗糖+葡萄糖+麥芽糖+d-木糖+甘油+半乳糖+d-核糖+肌醇±棉籽糖±d-阿拉伯糖-鼠李糖-甘露糖-d-果糖-乳糖-山梨糖-+：陽(yáng)或利用；-：陰或不利用；±：弱陽(yáng)性或不確定實(shí)施例2：發(fā)酵培養(yǎng)制備非達(dá)霉素采用保藏號(hào)為cctccno：m2017311的菌株。1、菌種培養(yǎng)及保存固體培養(yǎng)基：葡萄糖1g，可溶性淀粉2g，酵母浸出粉1g，酸水解酪蛋白0.5g，瓊脂2g，加水到100ml，ph調(diào)7.0。固體培養(yǎng)方法：菌株接種于固體培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)8～10天。固體培養(yǎng)結(jié)束后，斜面放置4～10℃冷藏備用。2、搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖1g，玉米淀粉0.5g，馬鈴薯淀粉0.5g，酵母粉1g，大豆蛋白胨1.5g，牛肉浸膏2g，黃豆餅粉0.5g，caco30.4g，加水到100ml，ph7.0。裝液量：500ml三角瓶里裝100ml培養(yǎng)基，121℃滅菌30min。接種量：5％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管培養(yǎng)溫度：30℃培養(yǎng)時(shí)間：3天搖床轉(zhuǎn)速：260rpm搖瓶種子培養(yǎng)方法：將30％甘油菌絲冷凍管解凍后按照接種量5％(v/v)接搖瓶種子培養(yǎng)基中，待菌絲長(zhǎng)起，有明顯掛壁現(xiàn)象且菌濃為12％以上，將1l搖瓶種子培養(yǎng)液，接入1000l種子罐中。30％甘油菌絲冷凍管的制作：在無(wú)菌狀態(tài)下，將滅菌后的甘油約30ml加入生長(zhǎng)好的種瓶里，搖勻制成約30％甘油菌絲懸浮液，然后分裝至小試管中(5ml/支)，放置-20℃低溫冰箱冷藏備用。3、種子罐種子培養(yǎng)基種子罐種子培養(yǎng)基比例與搖瓶種子培養(yǎng)基比例一致，加水至500l，ph調(diào)7.0。裝量：1000l種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基500l，121℃滅菌30min。種子罐培養(yǎng)方法：培養(yǎng)好的1l搖瓶種子液接入種子罐中，30℃，4天。培養(yǎng)過(guò)程中控制罐壓：0.04mpa，攪拌速度120rpm，通氣量1：1(v/v)。培養(yǎng)后，鏡檢菌絲粗壯，染色深，無(wú)染菌，菌濃≥12％。4、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為：每100ml培養(yǎng)基中含葡萄糖1g，麥芽糖5g，玉米淀粉4g，黃豆餅粉1.5g，酵母膏2g，大豆蛋白胨1.5g，硝酸鉀0.5g，nacl0.1g，caco30.2g，hz8186g，泡敵0.15％，其余為水，ph7.0。裝量：10噸發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基6噸發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：培養(yǎng)好的500l罐上種子液接入發(fā)酵罐中，30℃，12天。培養(yǎng)過(guò)程中控制罐壓：0.04mpa，攪拌速度160rpm，通氣量1：1.3(v/v)。發(fā)酵終點(diǎn)判斷：菌絲染色深，空泡較多，菌絲有斷裂、自溶現(xiàn)象。放罐過(guò)濾，得到hz818，經(jīng)常規(guī)方法浸泡，檢測(cè)，非達(dá)霉素hplc歸一化含量為40％(見附圖3)。實(shí)施例3：發(fā)酵培養(yǎng)制備非達(dá)霉素(1)發(fā)酵培養(yǎng)非達(dá)霉素采用保藏號(hào)為cctccno：m2017311的菌株。搖瓶種子培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含葡萄糖0.5g，玉米淀粉0.5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉0.2g，牛肉浸膏1.5g，黃豆餅粉1g，caco30.1g，其余為水，ph自然。接入5％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管，220rpm，28℃培養(yǎng)2天得種子液。種子罐培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含葡萄糖0.5g，酵母粉0.5g，玉米淀粉1g，大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏1.5％，棉籽粉1g，玉米漿粉1g，kh2po40.5g，caco30.1g，其余為水，ph自然。種子接種量0.1％(v/v)，150rpm，30℃培養(yǎng)4天。發(fā)酵罐培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含葡萄糖1g，麥芽糊精3g，酵母粉1g，麩質(zhì)粉1g，可溶性淀粉4g，kh2po40.3g，feso4.7h2o0.2g，硝酸鉀0.5g，hz8183g，泡敵0.1％，caco30.1g，其余為水，ph自然。種子接種量5％(v/v)，180rpm，30℃培養(yǎng)9天。放罐過(guò)濾，得到hz818，經(jīng)常規(guī)方法浸泡，檢測(cè)，非達(dá)霉素hplc歸一化含量為42％(見附圖4)。實(shí)施例4：發(fā)酵培養(yǎng)制備非達(dá)霉素(1)發(fā)酵培養(yǎng)非達(dá)霉素采用保藏編號(hào)為cctccno：m2017311的菌株搖瓶種子培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含蔗糖1g，可溶性淀粉2g，大豆蛋白胨0.5g，牛肉浸膏0.5g，麥芽浸出粉2g，黃豆餅粉1g，caco30.2g，其余為水，ph6.8。接入3％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管，250rpm，28℃，培養(yǎng)3天得種子液。種子罐培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含蔗糖1g，可溶性淀粉2g，大豆蛋白胨1g，牛肉浸膏1g，麥芽浸出粉2g，黃豆餅粉2g，caco30.2g，加水至500l，ph6.8。種子接種量0.2％(v/v),180rpm，26℃，培養(yǎng)4天。發(fā)酵罐培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基含葡萄糖2g，麥芽糊精1g，酵母粉1g，棉籽粉0.5g，玉米淀粉2g，k2hpo40.3g，feso4.7h2o0.2g，尿素0.2g，硝酸鈉0.5g,caco30.4g，hb604g，泡敵0.15％，其余為水，ph6.8。種子接種量8％(v/v)，150rpm，26℃培養(yǎng)10天。放罐過(guò)濾，得到hb60，經(jīng)常規(guī)方法浸泡，檢測(cè)，非達(dá)霉素hplc歸一化含量為43％(見附圖5)。實(shí)施例5：發(fā)酵培養(yǎng)制備非達(dá)霉素(1)發(fā)酵培養(yǎng)非達(dá)霉素采用保藏編號(hào)為cctccno：m2017311的菌株搖瓶種子培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含葡萄糖1.5g，玉米糊精3g，大豆蛋白胨3g，黃豆餅粉2g，酵母膏2g，caco30.3g，其余為水，ph自然。接入5％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管，240rpm，30℃培養(yǎng)2天得種子液。種子罐培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含葡萄糖2.0g，玉米淀粉4g，酵母粉2g，玉米蛋白粉3g，黃豆餅粉2g，酵母膏1g，caco30.3g，其余為水，ph自然。種子接種量0.1％(v/v)，200rpm,28℃培養(yǎng)3天。發(fā)酵罐培養(yǎng)：每100ml培養(yǎng)基中含甘油0.5g，麥芽糊精4g，酵母粉1g，玉米蛋白粉3g，kh2po40.5g，硝酸鈉1g，mgso4.7h2o0.2g，mnso4.7h2o0.1g，pad9005g，泡敵0.2％，caco30.3g，其余為水，ph7.0。種子接種量15％(v/v)，200rpm，30℃培養(yǎng)9天。放罐過(guò)濾，得到pad900，經(jīng)常規(guī)方法浸泡，檢測(cè)，非達(dá)霉素hplc歸一化含量為41％(見附圖6)。當(dāng)前第1頁(yè)12