專利名稱：一種促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種基于培養(yǎng)基成分階段性變化促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法。
背景技術(shù)：
花生四烯酸(Arachidonicacid, ARA,即 5,8,11,14-二十碳四烯酸)屬于 n_6 系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)，是人體中含量最高、分布最廣和最活躍的一種必需 PUFAs (Lombardo Y B, Hein G, Chicco A. Lipids, 2007,42 (5) :427-437)。是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等衍生物的直接前體，具有多種生物活性，在促進(jìn)智力發(fā)育、提高人體視力、降低血脂、增強(qiáng)免疫力和抗癌等方面具有重要作用，在生物醫(yī)藥、化妝品、功能性食品和保健品等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。由于花生四烯酸在成年人體內(nèi)合成量極少，嬰幼兒體內(nèi)則無(wú)法合成，因此從食物中攝取額外的花生四烯酸對(duì)人體許多組織特別是腦組織的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。2009年衛(wèi)生部公布“花生四烯酸作為高級(jí)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑在嬰幼兒食品中的添加量擴(kuò)大到230mg/100g”?；ㄉ南┧岬膫鹘y(tǒng)來(lái)源是從動(dòng)物肝臟、豬腎上腺、蛋黃中提取(Gill I，Valivety R. Trends in biotechnology, 1997,15 (10) :401-409),但動(dòng)物組織中的花生四烯酸含量很低(約為0.2%)，來(lái)源少，且受季節(jié)限制，價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求(Chen
H,Chang C, Chen C. Journal of the American Oil Chemists1 Society,1997,74(5) 569-578)。利用微生物合成法替代傳統(tǒng)的花生四烯酸制備方成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)(Jin M J, Huang H, Xiao AH, et al. Bioprocess and Biosystems Engineering,2008,32(I) 117-122)。2011年衛(wèi)生部公布食品添加劑花生四烯酸油脂(發(fā)酵法)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，要求花生四烯酸含量以花生四烯酸甘油三酯計(jì)應(yīng)大于等于38%。目前，花生四烯酸油脂的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中存在著生產(chǎn)強(qiáng)度低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本居高不下，市場(chǎng)價(jià)格昂貴，僅能作為高端營(yíng)養(yǎng)保健品、化妝品等小規(guī)模使用。目前，花生四烯酸油脂生產(chǎn)過(guò)程中主要是采用分批發(fā)酵模式，通常只在分批發(fā)酵模式下考慮某一因素對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，如限氮(Koike Y Cai H J, Higashiyama K, et al. Journal of Bioscience and Bioengineering,2001,91 (4) :382-389),改變?nèi)苎?Higashiyama K, Murakami K, Tsujimura H, et al. (1999). Biotechnology and Bioengineering 63(4) :442-448),添加物質(zhì)(Higashiyama K, Yaguchi T, Akimoto K, et al. Journal of the American Oil Chemists1 Society, 1998, 75 (12) 1815-1819.);或是對(duì)分批發(fā)酵進(jìn)行一些后處理如老化工藝(黃和，金明杰，任璐靜等.花生四烯酸油脂的制備方法[P]. CN :101109015. 2008)等。雖然這些方法對(duì)花生四烯酸油脂的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程起到了一定的調(diào)控作用，但效果還很有限，在限氮，改變?nèi)苎?，添加物質(zhì)等條件下花生四烯酸生產(chǎn)強(qiáng)度低等問(wèn)題依然沒(méi)有得到很好的解決，在老化工藝中雖然花生四烯酸的生產(chǎn)強(qiáng)度得到提高，但生產(chǎn)周期太長(zhǎng)為276h左右，而且這些方法通常不易在工業(yè)化中應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)是基于微生物油脂的合成機(jī)制，在菌體增殖，油脂積累和花生四烯酸積累的各階段分別進(jìn)行精確調(diào)控，以提高各階段的反應(yīng)速率為目標(biāo)，相比于分批發(fā)酵工藝顯著提高了花生四烯酸油脂的生產(chǎn)強(qiáng)度，相比于老化工藝顯著縮短了生產(chǎn)周期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法,將高山被孢霉(Mortierella alpina) 菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，在碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上進(jìn)行菌體快速增殖培養(yǎng)，收集菌體，再在碳源豐富而其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上進(jìn)行油脂快速積累培養(yǎng)，收集菌體，最后在缺碳的培養(yǎng)基上進(jìn)行花生四烯酸快速積累培養(yǎng)，收集菌體。其中，所述的活化培養(yǎng)條件為將菌種接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，20_28°C下培養(yǎng) 120-192h，然后再將斜面上的菌絲體接入搖瓶種子活化培養(yǎng)基中，20-28°C、100-250rpm下活化培養(yǎng)18_24h ;其中，所述的搖瓶種子活化培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-60g/L，酵母膏 3-6g/L, KH2PO4 2-5g/L, NaNO3 2_5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 3-1. 5g/L，溶劑為水。其中，所述的碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基配方為葡萄糖40-80g/L，酵母膏 6-15g/L，KH2PO4 2-6g/L, NaNO3 2_6g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 5_1. 5g/L，泛酸鈣 O. l_2g/L，維生素0. 2-lg/L，溶劑為水；優(yōu)選配方為葡萄糖40-60g/L，酵母膏I lg/L，KH2PO4 3. 8g/L, NaNO3 3. 4g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，泛酸鈣 0. 5g/L，維生素 0. 2g/L，溶劑為水。其中，所述的菌體快速增殖培養(yǎng)條件為接種量5% -20% (v/v)，初始pH5. 5-7. 5， 溫度20-28°C，培養(yǎng)48-72h，轉(zhuǎn)速100_250rpm，通氣量O. 2_2vvm ;優(yōu)選的培養(yǎng)條件為接種量 10% (v/v)，初始 ρΗ5· 5-7. 5，溫度 25。。，培養(yǎng) 48 60h，轉(zhuǎn)速 125rpm。其中，所述的碳源豐富而其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基配方為葡萄糖濃度 20-60g/L,泛酸|丐O. Ι-lg/L,維生素O. l_lg/L,溶劑為水；優(yōu)選的培養(yǎng)基配方為葡萄糖濃度40-60g/L，泛酸鈣O. 25g/L，維生素O. lg/L，溶劑為水。其中，油脂快速積累培養(yǎng)條件為pH5-8，溫度20-28 °C，培養(yǎng)時(shí)間24_60h，轉(zhuǎn)速100-250rpm，通氣量O. 2_2vvm ;優(yōu)選的培養(yǎng)條件為ρΗ6· 0-6. 5，溫度25 °C，培養(yǎng)時(shí)間 48-60h，轉(zhuǎn)速 125rpm。其中，所述的缺碳的培養(yǎng)基配方為酵母膏l(xiāng)_4g/L，KH2PO4 O. 5-1. 5g/L， NaNO3O. 5-1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1-lg/L，泛酸鈣 0. 2-lg/L，維生素 0. 1-0. 5g/L，溶劑為水； 或NaCl O. 9-3g/L，泛酸鈣O. l_lg/L，維生素O. l_lg/L，溶劑為水。所述的培養(yǎng)基配方優(yōu)選 酵母膏 2. 5g/L，KH2PO4 O. 8g/L，NaNO3 O. 7g/L，MgSO4 · 7H20 0. 15g/L，泛酸鈣 0. 25g/L，維生素0. lg/L，溶劑為水；或似(1 0.9g/L，泛酸鈣O. 25g/L，維生素O. lg/L，溶劑為水。其中，所述的花生四烯酸快速積累培養(yǎng)條件為溫度15_25°C，培養(yǎng)時(shí)間12_60h， 轉(zhuǎn)速100-250rpm，通氣量O. 2_2vvm ;培養(yǎng)條件優(yōu)選溫度25 °C，培養(yǎng)時(shí)間36_60h，轉(zhuǎn)速 125rpm。其中，所述的收集菌體條件為發(fā)酵液離心后，用無(wú)菌生理鹽水洗滌、離心，重復(fù)洗滌、離心操作I 2次，收集菌體。將花生四烯酸快速積累培養(yǎng)后得到的菌體真空抽濾收集，烘干，稱重及提取油脂， GC-MS檢測(cè)花生四烯酸。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立一種基于培養(yǎng)基成分階段性變化促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，先在碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行菌體快速增殖，然后在碳源豐富而其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行油脂快速積累，最后在缺碳的培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行花生四烯酸的快速積累。實(shí)現(xiàn)對(duì)花生四烯酸油脂發(fā)酵過(guò)程各個(gè)階段的精確調(diào)控。本發(fā)明成功解決了老化工藝(黃和，金明杰，任璐靜等.花生四烯酸油脂的制備方法[P].CN: 101109015. 2008)中花生四烯酸生產(chǎn)周期太長(zhǎng)和分批發(fā)酵工藝中花生四烯酸生產(chǎn)強(qiáng)度太低的問(wèn)題。老化工藝中花生四烯酸生產(chǎn)周期276h，生產(chǎn)強(qiáng)度0.072g/(L*h);分批發(fā)酵工藝花生四烯酸生產(chǎn)周期180h，生產(chǎn)強(qiáng)度0.029g/(L*h);本發(fā)明花生四烯酸生產(chǎn)周期144h，生產(chǎn)強(qiáng)度O. 079g/(L · h)。具有操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，成本低等特點(diǎn)，易于在工業(yè)化中應(yīng)用。


圖I為本發(fā)明方法的工藝流程圖。圖2為不同糖濃度對(duì)油脂積累的影響。圖3為不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油脂積累的影響。圖4不同pH對(duì)油脂積累的影響。圖5為缺碳條件下脂肪酸GC-MS分布圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例使用的菌株為高山被孢霉(Mortierella alpina)(保藏編號(hào)為CCTCC NO M 207067)實(shí)施例I :菌種活化。菌種活化種子在PDA斜面培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)168h，斜面培養(yǎng)基由下列物質(zhì)制成 土豆200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水IOOOmLo種子活化將斜面上的菌絲體從斜面接入250mL種子搖瓶中進(jìn)行種子活化培養(yǎng)， 搖瓶裝液量為20% (v/v)，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH2P043g/L， NaNO3 3g/L, MgSO4 ·7Η20 O. 5g/L，溶劑為水；pH6. 0，培養(yǎng)條件為溫度 25。。，轉(zhuǎn)速 125rpm，培養(yǎng)時(shí)間20h。實(shí)施例2 :第一階段菌體快速增殖培養(yǎng)。將實(shí)施例I活化后的種子以10% (v/v)的接種量接到7000mL裝有葡萄糖濃度分別為40、60、80和100g/L的碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為70% (v/v)，碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基除碳源外的營(yíng)養(yǎng)成分配方為酵母膏 I lg/L, ΚΗ2Ρ043· 8g/L，NaNO3 3. 4g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，泛酸鈣 0. 5g/L，維生素 0. 2g/ L，溶劑為水。培養(yǎng)條件為溫度25°C，轉(zhuǎn)速125rpm，培養(yǎng)時(shí)間以能把糖盡量耗完為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示?？梢?jiàn)在初糖60g/L時(shí)，在60h時(shí)葡萄糖耗完，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大為O. 47g/(L-h),菌體干重為27. 43g/L，在100g/L時(shí)菌體干重達(dá)到最大為33. 9g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度最低為 O. 20g/ (L · h),所以選擇初糖60g/L為最佳初糖濃度。表I不同初糖濃度對(duì)菌體增殖的影響
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，將高山被孢霉 (Mortierella alpina)菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，在碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上進(jìn)行菌體快速增殖培養(yǎng)，收集菌體，再在碳源豐富而其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上進(jìn)行油脂快速積累培養(yǎng)，收集菌體，最后在缺碳的培養(yǎng)基上進(jìn)行花生四烯酸快速積累培養(yǎng)，收集菌體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)條件為將菌種接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，20-28°C下培養(yǎng)120-192h，然后再將斜面上的菌絲體接入搖瓶種子活化培養(yǎng)基中，20-28°C、100-250rpm下活化培養(yǎng)18_24h ;其中，所述的搖瓶種子活化培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-60g/L，酵母膏3-6g/L，KH2PO4 2_5g/ L, NaNO3 2-5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3-1. 5g/L，溶劑為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基配方為葡萄糖40-80g/L，酵母膏6-15g/L，KH2PO4 2-6g/L，NaNO3 2_6g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5-1. 5g/L，泛酸鈣 0. l_2g/L，維生素 0. 2-lg/L，溶劑為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的菌體快速增殖培養(yǎng)條件為:接種量5% -20%卜八)，初始？?jī)?cè).5-7.5，溫度20-281，培養(yǎng) 48-72h，轉(zhuǎn)速 100-250rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的碳源豐富而其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基配方為葡萄糖濃度20-60g/L,泛酸|丐O. 1-lg/L, 維生素O. Ι-lg/L，溶劑為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，油脂快速積累培養(yǎng)條件為ΦΗ5-8，溫度20-28°C，培養(yǎng)時(shí)間24_60h，轉(zhuǎn)速100-250rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的缺碳的培養(yǎng)基配方為酵母膏 l_4g/L，KH2PO4 O. 5-1. 5g/L，NaNO3 O. 5-1. 5g/L，MgSO4 · 7H200.1-lg/L，泛酸鈣 0. 2-lg/L，維生素 0. 1-0. 5g/L，溶劑為水；或 NaCl O. 9_3g/L，泛酸鈣O.1-lg/L，維生素O. 1-lg/L，溶劑為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的花生四烯酸快速積累培養(yǎng)條件為溫度15-25°C，培養(yǎng)時(shí)間12-60h，轉(zhuǎn)速100_250rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的收集菌體條件為發(fā)酵液離心后，用無(wú)菌生理鹽水洗滌、離心，重復(fù)洗滌、離心操作I 2次， 收集菌體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法，將高山被孢霉(Mortierella alpina)菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，在碳源和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上進(jìn)行菌體快速增殖培養(yǎng)，收集菌體，再在碳源豐富而其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上進(jìn)行油脂快速積累培養(yǎng)，收集菌體，最后在缺碳的培養(yǎng)基上進(jìn)行花生四烯酸快速積累培養(yǎng)，收集菌體。本發(fā)明技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)花生四烯酸油脂發(fā)酵過(guò)程各個(gè)階段的精確調(diào)控，具有操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，花生四烯酸生產(chǎn)強(qiáng)度大，油脂品質(zhì)好等特點(diǎn)，易于在工業(yè)化中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102586351SQ20121005613
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者叢蕾蕾, 彭超, 紀(jì)曉俊, 聶志奎, 鄧中濤, 黃和, 黎志勇 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)