專利名稱：蘋果種質(zhì)資源改良tp-m13-ssr分子標記方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及果樹分子生物學技術(shù)，具體地說是蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標記方法。
背景技術(shù)：
蘋果屬(Mains Mill.)種質(zhì)資源豐富，品種類型多祥，包括大量的野生種、半野生種及栽培品種。蘋果種質(zhì)資源的準確鑒定是種質(zhì)資源保存和利用的前提，以往主要利用形態(tài)學觀察、同エ酶等方法進行鑒定。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，其在蘋果種質(zhì)資源的研究中也得到了越來越廣泛的應用。
自Litt和Luty首次將SSR技術(shù)(simple sequence repeat,即簡單序列重復又稱微衛(wèi)星)用于進行人類遺傳學研究以來，SSR技術(shù)因多態(tài)性高、分布廣、重復性好、共顯性以及成本較低等優(yōu)點而被廣泛應用，也因此而被應用到蘋果種質(zhì)資源的鑒定中。傳統(tǒng)的SSR分子標記PCR產(chǎn)物檢測采用的聚丙烯酰胺凝膠電泳技木，分析通量較低、擴增產(chǎn)物檢測流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄的工作量過大。而熒光測序技術(shù)即毛細管電泳技術(shù)在SSR-PCR擴增產(chǎn)物檢測上的應用，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和處理的自動化，克服了銀染法的不足。但其ー個重要限制因素即是其成本過高，一旦實驗需要增加另外的SSR位點時，又必須得重新合成新增位點的熒光引物，該技術(shù)也僅僅在少量材料和較少位點的研究中應用較多。TP-M13-SSR分子標記技術(shù)是將SSR分子標記技術(shù)、突光測序技術(shù)相結(jié)合的聞通量、低成本的高效、快速、準確的檢測方法，如何能將兩次PCR程序合并為一次，不同SSR分子標記引物合并到同一體系中，則可減少操作步驟，最大限度的減少人為實驗誤差，并且可以進一步的提聞實驗效率。

發(fā)明內(nèi)容
為了能夠?qū)P-M13-SSR分子標記技術(shù)中不同SSR分子標記引物合并到同一體系中，井能將兩次PCR程序合并為一次，盡可能地減少操作步驟，最大限度的減少人為實驗誤差，進ー步的提高實驗效率。本發(fā)明提出了蘋果種質(zhì)資源改良的TP-M13-SSR分子標記技術(shù)。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的方案是
I、提取蘋果基因組DNA，并稀釋到20 ng/yL。2、SSR突光標記反應
(I) TP-M13-SSR 反應體系
模板 DNA 2. Oul ；
Mg2+ (25mM) 1. 62ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 I =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 2 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 3 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；同一熒光標記的M13接頭1. 8 ul ；
Buffer(IOX) 2. 25ul ；dNTP (25 mM) :0. 18 ul ；
Taq (5u/ul) :0.24 ul ；ddH20 2. 95 ul ；
Total 15 ulο(2) PCR 程序
94°C預變性5min ;94°C變性30s，An. T退火30s，72°C延伸45s，30個循環(huán)；94°C變性308，53で退火308，72で延伸458，16個循環(huán)；72°C延伸10 min ;4°C保存。不同引物擴增所需要的An. T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過實驗確定在同一體系中的三對引物具有相同 的退火溫度。三對具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15 ul的反應體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應，在PCR儀上進行擴增，從而實現(xiàn)一次PCR反應三對TP-M13-SSR引物的PCR擴增及同一顏色的熒光標記。3、TP-M13-SSR標記的熒光檢測
TP-Ml3-SSR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化，不同熒光顏色標記的PCR擴增產(chǎn)物(最多四色)在毛細管電泳儀(如ABI3730)上進行毛細管電泳檢測。4、數(shù)據(jù)分析
電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genotyper兩套軟件進行分析，自動獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標記。積極效果不同SSR分子標記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為ー次，減少操作步驟，最大限度的減少人為實驗誤差，進ー步的提高實驗效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色熒光標記的PCR產(chǎn)物可同時在毛細管電泳儀上檢測，改良之前一次能夠檢測384X4共計1536個樣品，而現(xiàn)在一次最多可檢測384X3X4共計4608個樣品，一次可多檢測3072個樣品。進ー步地提高TP-M13-SSR熒光標記分析通量，并且減少了操作步驟，最大限度地減少了因檢測流程較多而造成的實驗誤差。
具體實施例方式利用毛細管電泳儀，將毛細管電泳技術(shù)和熒光標記技術(shù)相結(jié)合，不同SSR分子標記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，建立改良TP-M13-SSR分子標記方法，其實驗流程和具體的實驗步驟如下
I、提取蘋果基因組DNA，并稀釋到20 ng/yL。2、SSR突光標記反應
(I)TP-M13-SSR 反應體系
模板 DNA 2. Oul ；
Mg2+ (25mM) 1. 62ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 I =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
TP-Ml3-SSR 引物 2 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；TP-Ml3-SSR 引物 3 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；
同一熒光標記的M13接頭1. 8 ul ；
Buffer(IOX) 2. 25ul ；dNTP (25 mM) :0. 18 ul ；
Taq (5u/ul) :0.24 ul ；ddH20 2. 95 ul ；
Total 15 ulο(2) PCR 程序
94°C預變性5min ;94°C變性30s，An. T退火30s，72°C延伸45s，30個循環(huán)；94°C變性308，53で退火308，72で延伸458，16個循環(huán)；72°C延伸10 min ;4°C保存。不同引物擴增所需要的An. T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過實驗確定在同一體系中的三對引物具有相同的退火溫度。三對具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15 ul的反應體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應，在PCR儀上進行擴增，從而實現(xiàn)一次PCR反應三對TP-M13-SSR引物的PCR擴增及同一顏色的熒光標記。3、TP-M13_SSR標記的熒光檢測
TP-Ml3-SSR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化，不同熒光顏色標記的PCR擴增產(chǎn)物在毛細管電泳儀上進行毛細管電泳檢測。4、數(shù)據(jù)分析
電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genotyper兩套軟件進行分析，自動獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標記。至此，一次毛細管電泳可檢測四次PCR擴增的產(chǎn)物，即可檢測4X3對TP-Ml3-SSR引物對384X 12共計4608個樣品進行擴增的熒光標記產(chǎn)物，減少操作步驟，最大限度的減少人為實驗誤差，進一步的提聞實驗效率。基本原理是把擴增產(chǎn)物片段長度相差較大、但具有相同退火溫度的三對TP-M13-SSR引物放到同一 PCR體系中，添加具有相同熒光顏色M13接頭，采用兩套具有不同退火溫度的循環(huán)一次PCR反應程序進行擴增，經(jīng)過PCR產(chǎn)物的純化，利用毛細管電泳儀對其進行熒光檢測，自動獲取PCR產(chǎn)物數(shù)據(jù)，同時實現(xiàn)蘋果種質(zhì)資源三對TP-M13-SSR引物的熒光標記和檢測。
權(quán)利要求
1.蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標記方法，利用毛細管電泳儀，將毛細管電泳技術(shù)和熒光標記技術(shù)相結(jié)合，不同SSR分子標記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，建立改良TP-M13-SSR分子標記方法，其特征是 實驗步驟 1)、提取蘋果基因組DNA，并稀釋到20ng/yL； 2)、SSR突光標記反應 (DTP-M13-SSR 反應體系 模板 DNA 2. Oul ； Mg2+ (25mM) 1. 62ul ；TP-Ml3-SSR 引物 I =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；TP-Ml3-SSR 引物 2 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ；TP-Ml3-SSR 引物 3 =P-Primer (2uM) :1.2 ul ；F-Primer (2uM) :0.12 ul ； 同一熒光標記的M13接頭1. 8 ul ；Buffer(IOX) :2. 25ul ；dNTP (25 mM) :0. 18 ul ；Taq (5u/ul) :0.24 ul ；ddH20 2. 95 ul ；Total 15 ul ； (2)PCR 程序 94°C預變性5min ;94°C變性30s，An. T退火30s，72°C延伸45s，30個循環(huán)；94°C變性308，53で退火308，72で延伸458，16個循環(huán)；72°C延伸10 min ;4°C保存；不同引物擴增所需要的An. T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過實驗確定在同一體系中的三對引物具有相同的退火溫度； 三對具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15 ul的反應體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應，在PCR儀上進行擴增，從而實現(xiàn)一次PCR反應三對TP-M13-SSR引物的PCR擴增及同一顏色的熒光標記； 3)、TP-M13-SSR標記的熒光檢測 TP-Ml3-SSR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化，不同熒光顏色標記的PCR擴增產(chǎn)物在毛細管電泳儀上進行毛細管電泳檢測； 4)、數(shù)據(jù)分析 電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genot yper兩套軟件進行分析，自動獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標記。
全文摘要
本發(fā)明提出的是蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標記方法。不同SSR分子標記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，減少操作步驟，最大限度的減少人為實驗誤差，進一步的提高實驗效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色熒光標記的PCR產(chǎn)物可同時在毛細管電泳儀上檢測，改良之前一次能夠檢測384×4共計1536個樣品，而現(xiàn)在一次最多可檢測384×3×4共計4608個樣品，一次可多檢測3072個樣品。進一步地提高TP-M13-SSR熒光標記分析通量，并且減少了操作步驟，最大限度地減少了因檢測流程較多而造成的實驗誤差。適宜作為蘋果種質(zhì)資源分類的試驗應用。
文檔編號C12Q1/68GK102653790SQ201210095250
公開日2012年9月5日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者劉鳳之, 劉立軍, 王大江, 王昆, 高源 , 龔欣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所