一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法，該用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物為SSR引物，所述SSR引物為BOE16、S119、S83，本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的方法。本發(fā)明的方法可將‘夏翠芥藍(lán)’雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開(kāi)來(lái)，快速檢測(cè)出雜交種子的純度，本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物 及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 種子質(zhì)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要元素，其質(zhì)量的優(yōu)劣程度直接影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和 產(chǎn)量。品種的純度和真?zhèn)舞b定是以形態(tài)學(xué)標(biāo)記為依據(jù)，這種鑒定方法從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度具有 穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，但從遺傳學(xué)角度看，品種的純度和真?zhèn)舞b定是實(shí)質(zhì)上是對(duì)品質(zhì)基因型的 鑒定，只有通過(guò)鑒定DNA分子本身才能準(zhǔn)確可靠的鑒定品種的基因型。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而發(fā)展起來(lái)的一種新型的鑒定方法。它具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特 點(diǎn)。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)包括AFLP，SRAP，SCAR，SSR等，SSR分子標(biāo)記分布廣泛，且具有 共顯性和高多態(tài)性等特征。加之甘藍(lán)(芥藍(lán)為甘藍(lán)的一個(gè)變種）已經(jīng)完成基因組測(cè)序，有足 夠的SSR標(biāo)記可以選擇。
[0003] 芥藍(lán)是起源于華南地區(qū)的一種特色葉菜，為甘藍(lán)的一個(gè)變種。有限的親本資源以 及雜交品種的不斷涌現(xiàn)，使得品種間尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來(lái)越小，蔬菜種子 的真實(shí)性與品種純度鑒定也越來(lái)越難，加之夏翠芥藍(lán)是利用自交不親和系配制而成的雜交 一代，在制種過(guò)程中母本有一定的自交結(jié)實(shí)率，常常會(huì)出現(xiàn)假雜種，導(dǎo)致種子遺傳純度下 降，給生產(chǎn)造成巨大損失。
[0004] "夏翠芥藍(lán)"是以L(fǎng)b07F為母本，Lb07M為父本育成的國(guó)內(nèi)首次通過(guò)品種審定的雜交 種。具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，產(chǎn)量高，抗病抗逆型強(qiáng)的特點(diǎn)。是華南地區(qū)推廣面積較多的早熟品種。為 了保證優(yōu)良品種產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，因此一種快速、準(zhǔn)確、有效的品種鑒定方法非常重 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法，旨在 解決目前在夏翠芥藍(lán)的雜交一代，在制種過(guò)程中母本的自交結(jié)實(shí)率，常常會(huì)出現(xiàn)假雜種，導(dǎo) 致種子遺傳純度下降，給生產(chǎn)造成巨大損失的問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，該用于夏翠 芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物為SSR引物，所述SSR引物為B0E16、S119、S83;
[0007] 所述B0E16引物序列為SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:1 序列為B0EI6-F: 5'-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3'，SEQ ID NO:2SB〇E16-R:5'-CAAACGTGGAAGGAGATTA。
[0008] 進(jìn)一步，SSR引物還采用S119引物，
[0009] 所述S119引物序列為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:3序列為S119-F: 5'-TTGCACACATACCAGATGCC-3'，SEQ ID N0:4序列為S119-R:5'-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC。
[0010] 進(jìn)一步，SSR引物還采用S83引物，
[0011] 所述S83引物序列為SEQIDN0:5和SEQIDN0:6，SEQIDN0:5序列為S83-F:5'- GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'，SEQ ID
[0012] 本發(fā)明另一目的在于提供一種夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定方法，該夏翠芥藍(lán)雜交 種子純度的鑒定方法包括如下步驟：
[0013] 1)提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA;
[0014] 2)以芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用SSR引物Β0Ε16、S119、S83進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0015] 3)對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
[0016] 4)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)具有親本特異性條帶的單株做為雜交種，缺少親本 特異性條帶中的任意一條帶記為假雜種，計(jì)算種子純度，計(jì)算方法為：
[0017] SSR鑒定雜交種比率（％ )=(雜交種帶數(shù)/總帶數(shù)）X 100%，
[0018] 其中，SSR引物B0E16產(chǎn)生458bp的母本特異標(biāo)記和產(chǎn)生485bp的父本特異標(biāo)記。 [0019]提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA包括以下步驟：
[0020]①用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時(shí)迅速加入ΙΟΟΟμΙ 2% CTAB提取緩沖液，混勻后置于65°C水浴中溫浴50min，每隔5min搖動(dòng)一次；
[0021] ②靜置至室溫后在4°C下12000rpm離心10min，將上清（約800μ1)轉(zhuǎn)移到新的2ml離 心管；
[0022]③加入等體積的酚：氯仿：異戊醇=25 : 24:1，顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4°C下 12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中；
[0023]④加2/3體積340μ1預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，緩慢顛倒20次，置于一20°C下培養(yǎng) 30min；
[0024] ⑤在4°C下13000rpm離心10min，棄上清，加入200-300μ1預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA 沉淀兩次，微干；
[0025] ⑥加入100μ1無(wú)菌水溶解。
[0026] 進(jìn)一步，PCR擴(kuò)增的20μ1 反應(yīng)體系為：基因組DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTP 0.2mmol · L-SSSR引物0.25mmol · L-STaq酶0.2U。
[0027] 進(jìn)一步，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸40s，35個(gè)循環(huán)后，72 °C保持7min，然后置于4°C保存待檢測(cè)。
[0028] 進(jìn)一步，所述凝膠電泳為擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠 上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個(gè)小時(shí)，電泳結(jié)束后進(jìn)行0.1%AgN0 3銀染15min;銀染后用2%Na0H、 0.4%甲醛、0.04%Na2C03顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0029] 本發(fā)明的方法可將'夏翠芥藍(lán)'雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開(kāi)來(lái)，快速檢測(cè) 出雜交種子的純度，現(xiàn)在鑒定純度的方法是將雜交種子種植在田間，苗長(zhǎng)大后肉眼進(jìn)行觀 察哪些是雜交種，哪些是假雜種，這種方法時(shí)間長(zhǎng)，占地大，還要非常有經(jīng)驗(yàn)的一線(xiàn)工作人 員才能鑒定出，準(zhǔn)確率因人而異，而利用SSR引物進(jìn)行鑒定可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確、有效的特 點(diǎn)，節(jié)省人力、物力、財(cái)力;本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能夠替代傳統(tǒng) 雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定方法流程圖；
[0031] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物B0E16夏翠芥藍(lán)種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺 凝膠電泳圖譜一；
[0032]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物B0E16夏翠芥藍(lán)種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺 凝膠電泳圖譜二；
[0033] 圖中；P1:母本A-2;P2:父本C_8:F1為雜交一代種子。
[0034] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物S119夏盛芥藍(lán)種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺 凝膠電泳圖譜一；
[0035] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物S119夏盛芥藍(lán)種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺 凝膠電泳圖譜二；
[0036] 圖中：P1:母本A-2;P2:父本C_8:F1為雜交一代種子。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0038] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0039] -種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，該用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定 的引物為SSR引物，所述SSR引物為B0E16、S119、S83;
[0040] 所述B0E16引物序列為SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:1 序列為B0EI6-F: 5'-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3'，SEQ ID NO:2SB〇E16-R:5'-CAAACGTGGAAGGAGATTA;
[0041 ]所述S119引物序列為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:3序列為S119-F: 5'-TTGCACACATACCAGATGCC-3'，SEQ ID N0:4序列為S119-R:5'-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC;
[0042] 所述S83引物序列為SEQIDN0:5和SEQIDN0:6，SEQIDN0:5序列為S83-F:5'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'，SEQ ID
[0043] 如圖1所示:一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定方法，該用于夏翠芥藍(lán)雜交種子 純度的鑒定方法包括如下步驟：
[0044] S101:提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA;
[0045] S102:以芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用SSR引物Β0Ε16、S119、S83進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0046] S103:對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
[0047] S104:對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)具有親本特異性條帶的單株做為雜交種，缺少親 本特異性條帶中的任意一條帶記為假雜種，計(jì)算種子純度，其中，SSR引物B0E16產(chǎn)生458bp 的母本特異標(biāo)記和產(chǎn)生485bp的父本特異標(biāo)記。
[0048] 進(jìn)一步，PCR擴(kuò)增的20μ1 反應(yīng)體系為：基因組DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTP 0.2mmol · L-SSSR引物0.25mmol · L-STaq酶0.2U。
[0049] 進(jìn)一步，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸40s，35個(gè)循環(huán)后，72 °C保持7min，然后置于4°C保存待檢測(cè)。
[0050] 進(jìn)一步，所述凝膠電泳為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0051 ] 實(shí)施例1
[0052] '夏翠芥藍(lán)'雜交種子純度檢測(cè)方法的建立。
[0053]篩選純度鑒定的SSR引物。
[0054]從所公布的甘藍(lán)SSR引物及EST-SSR引物在雙親間進(jìn)行篩選，選出共顯性差異標(biāo)記 條帶的三對(duì)引物序列如下所示：
[0064]三種標(biāo)記帶型清晰、重復(fù)性好。引物能產(chǎn)生的母本特異性標(biāo)記和的父本特異性標(biāo) 記。
[0065]利用上述特異性引物對(duì)'夏翠芥藍(lán)'雜交種子進(jìn)行純度鑒定。
[0066]鑒定方法：
[0067] (1)芥藍(lán)DNA的提?。?br>[0068]實(shí)驗(yàn)材料為'夏翠芥藍(lán)'商品種及其母本A-2、父本C-8幼小葉片DNA。步驟如下： [0069]①用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時(shí)迅速加入ΙΟΟΟμΙ 2% CTAB提取緩沖液，混勻后置于65°C水浴中溫浴50min(每隔5min搖動(dòng)一次）。
[0070] ②靜置至室溫后在4°C下12000rpm離心10min，將上清（約800μ1)轉(zhuǎn)移到新的2ml離 心管。
[0071 ]③加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24:1 )，顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4°C下 12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中。
[0072]④加2/3體積340μ1預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻（緩慢顛倒20次），置于一 20°C下培養(yǎng) 30min〇
[0073] ⑤在4°C下13000rpm離心10min，棄上清，加入200-300μ1預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA 沉淀(兩次），微干。
[0074] ⑥加入100μ1無(wú)菌水溶解。
[0075] (2)SSR_PCR 擴(kuò)增：
[0076] PCR 體系（20μ1)
[0077] DNA 模板：5ng
[0078] 引物_F:0·25mmol · L-1
[0079] 引物-R:〇.25mmol · L-1
[0080] dNTP:0.2mmol · L-1
[0081] Mg2+:0.15mmol · L-1
[0082] 10XPCR buffe：2.0yl
[0083] Taq酶：0.2U
[0084] ddH20 補(bǔ)足至 20μ1
[0085] PCR擴(kuò)增程序：
[0086] 94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸4〇8,35個(gè)循環(huán)后，72°〇 保持7min，然后置于4°C保存待檢測(cè)。
[0087] (3)凝膠電泳
[0088]擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8 %的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個(gè)小 時(shí)，電泳結(jié)束后進(jìn)行〇. 1 %AgN〇3銀染15min;銀染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2C〇3顯 色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0089] (4)擴(kuò)增結(jié)果
[0090] 三種引物在'夏翠芥藍(lán)'父母本及雜交一代種子分別能擴(kuò)增出兩條特異帶；其中 B0E16引物母本pi擴(kuò)增出的a條帶，母本p2號(hào)擴(kuò)增出b的條帶;見(jiàn)圖2和圖3。
[0091] 引物S116母本擴(kuò)增出c條帶，父本擴(kuò)增出d條帶，見(jiàn)圖4和圖5。
[0092]回收特異條帶，送生物工程有限公司測(cè)序。條帶的序列如SEQ ID N0:1-2所示，雜 交種子中與父本、母本擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相符。
[0093] 實(shí)施例2
[0094]采用實(shí)施例1的方法對(duì)從白云基地的種子純度鑒定田取的50株'夏翠芥藍(lán)'，對(duì)其 單株編號(hào)，提取單株DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果兩個(gè)引物檢測(cè)結(jié)果一致，種子純度為98%，與田 間調(diào)查結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為100 %。
[0095] 以上實(shí)施例表明，本發(fā)明的方法可將'夏翠芥藍(lán)'雜交種子與其父母本種子進(jìn)行有 效區(qū)分，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出種子純度。并且選取任何一個(gè)引物均能準(zhǔn)確鑒別。
[0096] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，其特征在于，該用于夏翠芥藍(lán)雜交種 子純度鑒定的引物為SSR引物，所述SSR引物為B0E16;所述B0E16序列為SEQ ID NO: 1和SEQ IDN0:2，SEQIDN0:1序列為B0E16-F:5'-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3'，SEQIDN0:2序列為 B0E16-R:5 '-CAAACGTGGAAGGAGATTA。2. 如權(quán)利要求1所述的用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，其特征在于，所述SSR 引物還采用S119,所述S119序列為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:3序列為5119_ F : 5 '-TTGCACACATACCAGATGCC-3 '，SEQ ID N 0 : 4 序列為 S 1 1 9 - R : 5 '-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC 〇3. 如權(quán)利要求1所述的用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，其特征在于，所述SSR 引物還采用S83,所述S83序列為SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:5序列為S83-F: S'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-S^SEQ ID N0:6序列為 5831:5: GAGCCAAGAAAGGACCTAAGAT 〇4. 一種利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行夏翠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于， 該夏翠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法包括如下步驟： 1) 提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA; 2) 以芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用SSR引物B0E16進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3) 對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳； 4) 對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)具有親本特異性條帶的單株做為雜交種，缺少親本特異 性條帶中的任意一條帶記為假雜種，計(jì)算種子純度，其中，SSR引物B0E16產(chǎn)生458bp的母本 特異標(biāo)記和產(chǎn)生485bp的父本特異標(biāo)記。5. 如權(quán)利要求4所述的夏翠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，提取芥藍(lán)幼苗 基因組DNA包括以下步驟： ① 用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時(shí)迅速加入ΙΟΟΟμΙ 2%CTAB 提取緩沖液，混勻后置于65°C水浴中溫浴50min，每隔5min搖動(dòng)一次； ② 靜置至室溫后在4°C下12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管； ③ 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇=25 :24:1，顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4°C下 12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中； ④ 加2/3體積340μ1預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，緩慢顛倒20次，置于一 20°C下培養(yǎng)30min; ⑤ 在4°C下13000rpm離心10min，棄上清，加入200-300μ1預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀 兩次，微干； ⑥ 加入100μΙ無(wú)菌水溶解。6. 如權(quán)利要求2所述的用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增 的 20μ1 反應(yīng)體系為：基因組 DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTPOJmmol · L-SSSR 引物 0.25mmol · L-STaq酶0.2U。7. 如權(quán)利要求2所述的用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增 的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35個(gè)循環(huán)后，72°C 保持7min，然后置于4°C保存待檢測(cè)。8. 如權(quán)利要求2所述的用于夏翠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，所述凝膠 電泳為擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個(gè)小 時(shí)，電泳結(jié)束后進(jìn)行ο. 1 %AgN〇3銀染15min;銀染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2C〇3顯 色，顯色后在燈箱上拍照分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969898SQ201610579106
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月21日
【發(fā)明人】李桂花, 陳漢才, 王亭亭, 黎庭耀, 張艷
【申請(qǐng)人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所