專利名稱：海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及微生物學、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學等領域，具體涉及ー種低溫SOD海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該方法生產(chǎn)的低溫SOD作為生物體內(nèi)超氧陰離子自由基清潔齊U，主要應用于醫(yī)學、食品、化妝品等行業(yè)，尤其在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤、癌癥和自身免疫治療等方面顯示出獨特的優(yōu)越性。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, EC I. 15. I. 1，簡寫 S0D)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應生成過氧化氫和分子氧，從而清除生物體內(nèi)的氧自由基，起到保護生物體免受傷害作用(自俊青，大理師專學報，1998)。1969年Mccord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該酶生物催化活性并命名為超氧化物歧化酶(林慶斌，化學世界，2006)。按其結(jié)合的金屬元素種類不同，可將其分為三類ー類是藍綠色Cu，Zn-SOD，相對分子量約32000，主要存在于真核細胞的胞液和葉綠體中，是研究最多、最深入的ー類；第二類是紫紅色Mn，F(xiàn)e-SOD，相對分子量約40000，主要存在于原核生物細胞及線粒體的基質(zhì)中；第三類是黃褐色Fe-SOD，相對分子量約38700，主要存在于原核細胞及ー些植物中(陳惠芳，生命的化學，2003)。SOD作為生物酶制劑，醫(yī)療上主要用于輔助放療與化療，腎、肝、心臟等器官的保護和移植，消除輻射引起的副作用，以及作為某些疾病的探針等；食品エ業(yè)作為添加劑應用于飲料和啤酒等。近年來SOD被廣泛用于治療氧中毒、老年性白內(nèi)障、糖尿病、心血管疾病、各種炎癥等多種疾病(張博潤等，微生物學通報，1992);幾十年來SOD—直是國內(nèi)外研究熱點，起初階段多集中于從動物血液或植物組織中提取S0D，中期階段普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的研究開始起步并日漸增多，目前普通微生物生產(chǎn)SOD已然成為研究的主體。普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD最適作用溫度一般為45 55°C，而人體的生理溫度一般為36. 5 37°C，致使普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD不能充分發(fā)揮作用，出現(xiàn)治療效果差或沒有效果(曾胤新，微生物學雜志，2004)。海洋微生物(低溫、寡營養(yǎng)、低光照、高壓)發(fā)酵生產(chǎn)的SOD最適作用溫度一般為35 40°C，比較接近人體的生理溫度，應用于治療效果比較明顯。而海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD研究尚在起步階段，產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；Ｑ笪⑸锇l(fā)酵生產(chǎn)SOD還未見報道。鑒于動物SOD血液來源困難、安全性以及普通微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD應用最適作用溫度的局限性，利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫SOD具有很大的應用優(yōu)勢。海洋低溫SOD對熱反應極為敏感，且在自然環(huán)境溫度下具有高酶活力及高催化效率，經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，如果將SOD應用于食品エ業(yè)從而大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用，且不影響產(chǎn)品品質(zhì)(鄭洲等，極地研究，2007)，這將有助于低溫SOD的推廣和使用，從根本上擺脫繁瑣的提取エ藝及中溫酶的加熱、冷卻設備和流程。鑒于海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD在自然和生理溫度下的應用優(yōu)勢，海洋低溫SOD在醫(yī)療保健、食品、化 妝品等方面具有廣泛的應用前景和開發(fā)潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法，該發(fā)明主要是海洋微生物經(jīng)過定向馴化后，按常規(guī)方法液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫SOD活性可以達到180U/ml，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制齊U。該酶制劑最適作用溫度接近人體生理溫度，醫(yī)療效果顯著；在食品加工中應用操作簡單、方便、快捷、成本低，可以從根本上避免中溫酶的加熱、冷卻設備和エ藝。本發(fā)明所述的ー種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法具體包括以下步驟(I)將產(chǎn)生SOD的海洋微生物進行定向馴化，使其在自然條件下生長良好；(2)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌8 14°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子； (3)將液體一級種子或ニ級種子，按發(fā)酵液體積的4 10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在8 14°C培養(yǎng)60 96h時，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集的上清為SOD粗酶液；(6)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。SOD產(chǎn)生菌(CGMCC編號I. 3或I. 11)先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫S0D，馴化后的菌株在4°C中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. O 16. Og,牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自來水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米漿5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來水I. 0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生SOD的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；
(3)將⑵活化好的菌種進行定向馴化，使其在自然條件下生長良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌在8 14°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發(fā)酵液體積4 6%的接種量接入IOL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在8 10°C培養(yǎng)84 96h吋，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；
(8)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。實施例ニ (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基葡萄糖10. 0g，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. O 16. 0g，牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自來水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米漿5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生SOD的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種進行定向馴化，使其在常規(guī)壓力、鹽濃度條件下生長良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌在8 14°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發(fā)酵液體積6 8%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10 12°C培養(yǎng)72 84h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。實施例三
(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，瓊脂20. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. O 16. 0g，牛肉膏12. O 24. Og,蛋白胨4. O 12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L, pH 值 7. 0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8. O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 10. 0g，NaCl 5. O 10. 0g，自來水 I. 0L，pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15. O 25. 0g, (NH4) 2S043. O 10. 0g，玉米漿5. O 15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。(2)將產(chǎn)生SOD的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種進行定向馴化，使其在常規(guī)壓力、鹽濃度條件下生長良好；(4)按常規(guī)方法將定向馴化后的SOD產(chǎn)生菌在8 14°C培養(yǎng)24 36h，按5 8%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發(fā)酵液體積8 10%的接種量接入200L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在12 14°C培養(yǎng)60 72h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為SOD粗酶液；(8)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫SOD制劑。
權(quán)利要求
1.ー種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫SOD的方法，其包括以下步驟 (1)將產(chǎn)生超氧化物歧化酶的海洋微生物進行定向馴化，使其在自然條件下生長良好; (2)按常規(guī)方法將定向馴化后的超氧化物歧化酶產(chǎn)生菌在8 14°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和ニ級種子； (3)將液體一級種子或ニ級種子，按發(fā)酵液體積的4 10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在8 14°C培養(yǎng)60 96h吋，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為超氧化物歧化酶粗酶液； (6)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進ー步包括將步驟(6)得到的粗酶液進ー步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中菌種定向馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為 (1)菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8.O 16.0g，牛肉膏12. O 24. 0g，蛋白胨4. O .12. Og,酵母粉 2. O 8. 0g, NaCl 5. O 10. Og,瓊脂 15. O 30. Og,蒸餾水 I. 0L，p 值 7. 0，.121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(2)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖8.O 15. Og,牛肉膏8. O 16. Og,蛋白胨5. O 15. Og,酵母粉2. O 10. Og7NaCl 5. O 10. Og,自來水I. 0L，pH值7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖15.0 25.0g，(NH4)2S043.0 10. 0g，玉米漿5. O .15. 0g，酵母粉 2. O 8. OgjNaCl 5. O 10. 0g，CaCO3L O 6. 0g，MgSO4O. I 0. 9g,自來水I. 0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶的方法是將產(chǎn)生超氧化物歧化酶的海洋微生物進行定向馴化，使其在自然條件下生長良好；將定向馴化后的超氧化物歧化酶產(chǎn)生菌在8～14℃逐級擴大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的4～10％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在8～14℃培養(yǎng)60～96h時，即海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫超氧化物歧化酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集菌體，數(shù)次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm離心收集上清即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/08GK102653737SQ201210108710
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉, 馬莉 申請人:大連大學