專(zhuān)利名稱(chēng)：立體選擇性α-羥酸脫氫酶的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及立體選擇性a -羥酸脫氫酶的篩選方法。
背景技術(shù)：
立體選擇性a -羥酸脫氫酶為一類(lèi)特殊的氧化還原酶，能立體選擇性催化外消旋a-羥羧酸類(lèi)化合物中的一種異構(gòu)體生成相應(yīng)的a -酮酸，反應(yīng)液中留下另外一種異構(gòu)體(見(jiàn)下式)，由于產(chǎn)物中光學(xué)活性的a-羥酸與酮酸的性質(zhì)差異較大，易于分離。利用該酶可以用于生產(chǎn)手性的a-羥酸和酮酸，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.ー種立體選擇性α -羥酸脫氫酶的篩選方法，所述方法包括 (1)取待測(cè)含α-羥酸脫氫酶的樣品溶于pH 6 9的緩沖液中，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示的α -羥酸手性單體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng);
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中呈現(xiàn)藍(lán)綠色時(shí)，所述方法進(jìn)ー步包括步驟⑶和⑷ (3)另取呈現(xiàn)藍(lán)綠色的待測(cè)樣品溶于pH為6 9的緩沖液中，添加立體構(gòu)型與步驟(I)相反的手性単體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)； (4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液按照步驟(2)方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)結(jié)束后，若呈現(xiàn)顏色均一的藍(lán)綠色，則表明待測(cè)樣品中含有的α-羥酸脫氫酶沒(méi)有立體選擇性；若呈現(xiàn)淡黃色，表明待測(cè)樣品中含有與步驟(I)底物的立體構(gòu)型一致的α-羥酸脫氫酶。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述α-羥酸為苯基乳酸或?qū)αu基苯基乳酸。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述pH6 9的緩沖液為pH7. 5 8. O的磷酸ニ氫鈉-磷酸氫ニ鈉緩沖液。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述待測(cè)樣品為微生物菌體，所述方法如下 (A)取微生物菌體均勻分散于pH6.O 9. O的磷酸鹽緩沖液中，制成0D_值為5 10的菌懸液，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示α-羥酸的外消旋體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進(jìn)行反應(yīng)，取轉(zhuǎn)化液10 μ L添加200 300 μ L的FeC13顯色劑溶液進(jìn)行反應(yīng)5 30min，反應(yīng)結(jié)束后，呈現(xiàn)藍(lán)緑色的為α -羥酸脫氫酶陽(yáng)性樣品，呈淡黃色的為α-羥酸脫氫酶陰性樣品； (B)另取脫氫酶陽(yáng)性樣品兩份，溶于ρΗ7.5 8. O的磷酸ニ氫鈉-磷酸氫ニ鈉緩沖液中，各自添加手性的結(jié)構(gòu)如式(I)所示的R-或S-α-羥酸單體作為底物至底物終濃度為I lOOmM，于20 50°C水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液10 μ L添加200 300 μ L的FeCl3顯色劑溶液進(jìn)行反應(yīng)5 30min，顯色反應(yīng)結(jié)束后，若僅有ー份呈現(xiàn)藍(lán)綠色，則表明樣品中所含的α-羥酸脫氫酶的光學(xué)選擇性與呈藍(lán)綠色樣品中添加的手性α-羥酸的立體構(gòu)型一致，若兩份轉(zhuǎn)化液均呈現(xiàn)藍(lán)綠色則表明樣品中所含的α-羥酸脫氫酶沒(méi)有光學(xué)選擇性； 所述FeCl3顯色劑溶液組成如下FeCl3*6H20 2mmol/L，ニ甲基亞砜400ml/L，冰醋酸 20ml/L，溶劑為水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種立體選擇性α-羥酸脫氫酶的篩選方法。所述方法包括(1)取待測(cè)含α-羥酸脫氫酶的樣品溶于pH 6～9的緩沖液中，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示的α-羥酸手性單體作為底物，于20～50℃水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(2)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液添加FeCl3顯色劑溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)5～30min，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)液呈現(xiàn)的顏色判斷結(jié)果；本發(fā)明方法不需要對(duì)擬篩選的底物進(jìn)行衍生化，能夠利用簡(jiǎn)單的比色法快速鑒定所篩選的微生物的脫氫酶活性及光學(xué)選擇性，具有篩選流程簡(jiǎn)單、速度快、設(shè)備要求低、通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為以外消旋的扁桃酸及其相關(guān)衍生物為底物來(lái)進(jìn)行生物酶法拆分獲得光學(xué)純的產(chǎn)品帶來(lái)了極大的便利。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK102660631SQ201210109290
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者沈寅初, 王威, 薛亞平, 鄭裕國(guó) 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)