專利名稱：H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒核酸的檢測方法，尤其涉及一種檢測H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenza, Al)是由Al病毒(AIV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，通常只感染鳥類，少見情況會感染豬。禽流感病毒高度針對特定物種，但在罕有情況下會跨越物種障礙感染人。按病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的不同，可將禽流感病毒(Avian influenza vrius,AIV)分成16個H亞型和9個N亞型。由H5亞型禽流感病毒引起的高致病性禽流感(Highlypathogenic avian influenza,HPAI)近幾年愈演愈烈，馬來西亞、俄羅斯、中國、波黑、羅馬尼亞、法國、印度、埃及、德國、奧地利、伊朗、希臘、斯洛文尼亞、意大利等國相繼報道了禽流感疫情。目前，我國流行的禽流感病毒以H5亞型為主。因此，建立H5亞型禽流感病毒快速、靈敏、特異的鑒別診斷方法，可為我國禽流感的防控提供技術(shù)支持與保障?，F(xiàn)有禽流感病毒檢測方法主要分為抗體檢測及抗原檢測方法。抗體檢測方法包括血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition, HI)、瓊脂免疫擴散試驗(Agarosegel immunodiffusion, AGID)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay, ELISA)、補體結(jié)合試驗(Complement FixationAssays, CF)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(Neuraminidase inhibitor test, NIT)以及病毒中和試驗(Virusneutralization Test,VNT)等。抗體檢測方法因不能區(qū)分人工注射疫苗和病毒感染，故在實際中應(yīng)用價值不大，所以目前基于抗原檢測技術(shù)為AIV的主流檢測方法。針對AIV抗原檢測，經(jīng)典的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為雞胚病毒分離鑒定技術(shù)，該方法檢測周期長，操作步驟繁雜。常見的快速檢測方法包括ELISA和熒光RT-PCR。二者相比，ELISA檢測靈敏度較低，免疫試劑質(zhì)量穩(wěn)定性、批間重復(fù)性較差；而RT-PCR技術(shù)靈敏性高、特異性好，正越來越為人們所接受。然而，傳統(tǒng)的RT-PCR方法，一方面需經(jīng)過“高溫變性、中溫延伸、低溫退火”等溫度循環(huán)過程；另一方面，樣品處理所涉及的細胞裂解、核酸提取純化、擴增等步驟，需要在幾個獨立的檢測區(qū)，使用兒臺(套)設(shè)備才能實現(xiàn)，因此實際應(yīng)用中存在以下缺陷(I)檢測成本較高，基層單位難以應(yīng)用；(2)不能在養(yǎng)殖場、檢疫站和臨床等場所現(xiàn)場使用，須配備專門的實驗室，需使用具有熱循環(huán)功能的專用PCR儀；(3)操作繁瑣，檢測時間冗長(幾小時以上)，直接影響了疫情的及早發(fā)現(xiàn)與防控。進入21世紀(jì)，日本科學(xué)家Notomi等開發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)技術(shù),核酸鏈通過在等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴增實現(xiàn)對靶序列的放大，不需要PCR儀。LAMP的擴增效率是目前最高的一種，其靈敏度比傳統(tǒng)PCR高出約2-3個數(shù)量級。擴增產(chǎn)物的DNA數(shù)量比PCR產(chǎn)物高很多，能夠達到幾個微克。然而，由于該技術(shù)太過于靈敏和產(chǎn)物量的巨大，使得LAMP極其容易被污染。I個擴增的LAMP產(chǎn)物，往往又是同一片段的重復(fù)序列，因此，如果實驗室一旦遭到氣溶膠污染，假陽性率會很高而且難于去除。所以，有人認為，LAMP最終的應(yīng)用方向，應(yīng)該是不開蓋的檢測。1990年瑞士的Manz等提出微全分析O -TAS)概念,也稱之為芯片實驗室(Lab on a Chip)或微流控芯片(Microfluidic Chip)技術(shù),具有自動化、集成化、便攜化等優(yōu)勢。 因此，將LAMP與y -TAS進行系統(tǒng)集成，利用二者各自獨特的技術(shù)優(yōu)勢，恰恰可以解決上述問題，提供一種簡便、快速、敏感性高、特異性強、自動化程度高的禽流感病毒核酸分子檢測方法，在微全分析系統(tǒng)上實現(xiàn)樣本的細胞裂解、核酸提取純化、核酸擴增及檢測，全分析為程序化自動控制過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法。本發(fā)明是在微全分析系統(tǒng)上使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，能實現(xiàn)包括樣本處理在內(nèi)的全分析過程，如病毒裂解、核酸提取純化、等溫擴增等步驟的全部自動化，具有敏感度高、特異性好和快速等特點，且價格低廉，適用于現(xiàn)場快速檢測禽流感病毒，從而克服了目前核酸分析方法操作繁雜、費時、易于污染且須在幾個獨立的分區(qū)實驗室完成等問題。本發(fā)明的目的是提供一種自動化、快速、簡便、靈敏且經(jīng)濟的用于檢測人或動物的分泌物、血清、尿液、氣管試子、泄腹腔試子、糞便或者組織浸提液中禽流感病毒的核酸分子等溫擴增微全分析方法。本發(fā)明利用自動化程序控制的微全分析系統(tǒng)實現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，從待測試樣中提取核酸，利用所設(shè)計的引物進行擴增反應(yīng)，采用三種檢測方式(一)直接熒光目視法，在可見光下直接觀察反應(yīng)管中是否有明顯的熒光來判斷待測試樣是否含有禽流感病毒；(二)紫外光照射熒光目視法，在紫外光激發(fā)下觀察反應(yīng)管的熒光來判斷待測試樣是否含有禽流感病毒；(三)凝膠電泳法，檢測反應(yīng)產(chǎn)物是否含有特異性的梯狀條帶。本發(fā)明以人或動物的分泌物、血清、尿液、氣管試子、泄腹腔試子、糞便或者組織浸提液中核酸提取物為模板，選擇H5亞型禽流感病毒HA基因的一段高度保守片段作為靶序列，所使用的特異性6條特異性引物如表I。其中，LF和LB分別是位于FlC和F2之間，BIC和B2之間的環(huán)引物，其作用是提高擴增效率，加快反應(yīng)速率。表I H5亞型禽流感病毒RT-LAMP弓I物序列
權(quán)利要求
1.H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法所使用的特異性6條特異性引物，LF和LB分別是位于FlC和F2之間，BIC和B2之間的環(huán)引物，其引物序列為引物名稱引物序列 Primer nameSequence (5'-3') H5-F3GGGAATTTAATACTTAGAAAGGAGA H5-B3CTTCGAAAACAGCGTACC H5-FIPATGAGAACCAGAAGTTCAGCATTAT-TAGAGAATTTAAACAGAAGATGGGA H5-BIPTAGACTTTCATGACTCAATTGTCCA-TGGCATATCCTAAGGCGTA H5-LFGTCAGACATCTAGGAATCCGTCTH5-LB_GAACTTTACGACAGGTCCGAC_
2.如權(quán)利要求I所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法,其特征在于，待測人或動物的分泌物、血清、尿液、氣管試子、泄腹腔試子、糞便或者組織浸提液等試樣的預(yù)處理，包括細胞裂解、核酸提取純化、等溫擴增均集成在微全分析系統(tǒng)(見圖I)上自動完成，該微全分析系統(tǒng)由微膜片泵(閥)驅(qū)動，通過程序控制微膜片泵(閥)的開啟與閉合實現(xiàn)微流體樣品的驅(qū)動控制。
3.如權(quán)利要求2所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法，其特征在于，檢測方法包括1)直接熒光目視法，在擴增反應(yīng)前向體系中加入IU L鈣黃綠素作為熒光指示劑，可直接通過肉眼觀測結(jié)果，呈綠色的為陽性結(jié)果，呈較淺桔紅色的為陰性結(jié)果；2)紫外光照射熒光目視法，在紫外光下照射下，呈紅色熒光的為陽性結(jié)果，不顯色的為陰性結(jié)果；3)凝膠電泳法，有明顯梯形條帶者為陽性結(jié)果，反之為陰性結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法，其特征在于，擴增反應(yīng)的適宜時間為30-60min,優(yōu)選時間為60min。
5.如權(quán)利要求4所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法，其特征在于，擴增反應(yīng)的適宜溫度為60-65°C，優(yōu)選溫度為64°C。
6.如權(quán)利要求5所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法，其特征在于，擴增反應(yīng)所使用的甜菜堿濃度為甜菜堿濃度為5-15mmol/L，優(yōu)選濃度為lOmmol/L。
7.如權(quán)利要求6所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法，其特征在于，擴增反應(yīng)所使用的MgSO4溶液濃度為10-1 OOmmoI/L,優(yōu)選濃度為50mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測H5亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增微全分析方法，在微膜片泵(閥)驅(qū)動的微全分析系統(tǒng)(見

圖1)上，對試樣中H5亞型禽流感病毒進行自動化預(yù)處理和核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，步驟如下1)裂解；2)核酸提取及洗脫；3)核酸擴增。實現(xiàn)細胞裂解、核酸提取純化、等溫擴增等步驟均集成在微全分析系統(tǒng)上自動完成?？捎弥苯訜晒饽恳暦ā⒆贤夤庹丈錈晒饽恳暦澳z電泳法等進行結(jié)果判定。與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，本發(fā)明的方法檢測靈敏度可提高約103倍，檢測時間從4-5小時縮短至約1小時內(nèi)。
文檔編號C12Q1/68GK102618670SQ20121011373
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者薛強, 鄒明強 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院