專利名稱:組織特異性表達的24-脫氫膽固醇還原酶編碼重組腺病毒的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及阿爾茨海默癥基因治療法與治療領域。更具體地,本發(fā)明涉及利用基因工程技術構建含有過^^沒基因的復制缺陷型重組腺病毒,以及這些腺病毒載體在將
匆基因轉(zhuǎn)移入細胞以及實現(xiàn)DHCR24蛋白在神經(jīng)細胞等細胞中特異性過表達的應用。制備的重組腺病毒有望在阿爾茨海默癥以及糖尿病等疾病的基因治療中獲得肯定的療效。
背景技術:
阿爾茨海默病(Alzheimer Disease,AD)是一種起病隱襲的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床上以記憶與認知功能障礙為特征,是老年癡呆病中最常見的類型。有關專家預言,至2025年全世界將有2200萬人口罹患AD ;另據(jù)估計,2012年該治療領域的市場價值可達200億美元。WHO已將老年癡呆癥定為21世紀五大重點疾病之一。尋找治療老年癡呆癥的·上還沒有一種療效確切的治療藥物。20世紀80年代以來出現(xiàn)的“ β淀粉樣蛋白(Αβ )學說”作為AD的治病病理學說被廣泛接受。該學說認為β淀粉樣蛋白(Αβ)在腦組織中的沉積可能是阿爾茨海默病發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。Αβ是淀粉樣前體蛋白(APP)的水解產(chǎn)物。Αβ的增加和聚集所形成的老年斑具有神經(jīng)毒性,可通過引起氧化應激或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致廣泛的神經(jīng)元變性或死亡。例如Αβ的蓄積能通過直接引發(fā)神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子的釋放而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和神經(jīng)毒性。因此,凡能減少Αβ產(chǎn)生,加快其清除,或阻止其聚集,或?qū)笰 β的毒性引發(fā)的氧化應激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡的治療阿爾茨海默病的策略,已經(jīng)成為目前國際上研究最熱門的治療阿爾茨海默病藥物研發(fā)方向。但是目前該項研究尚未取得突破性進展,還沒有此類藥物進入市場。近年來,關于AD患者腦內(nèi)膽固醇代謝的特征及其與AD病程進展的關系的研究取得了很多進展。在腦組織中,膽固醇的作用尤為重要膽固醇對神經(jīng)軸突的信號傳遞、神經(jīng)生長、修復和重塑起重要作用,神經(jīng)元載體的功能及突觸的發(fā)生,成熟及可塑性的維持也都離不開膽固醇的參與。而神經(jīng)元培養(yǎng)研究顯示,膽固醇水平的減少會抑制樹突的延伸和突觸的生成,并認為這可能與tau蛋白(一種與AD發(fā)病有關的微管蛋白)的磷酸化有關。正常的腦功能需要恒定的膽固醇水平。腦膽固醇不能從血中攝取,只能由自身合成,其腦內(nèi)含量與血清膽固醇無關,只與其自身合成量和轉(zhuǎn)出量有關。膽固醇是細胞膜上超微結構脂質(zhì)後(Lipid raft)及細胞窖(caveolae)的主要構成成分,參與多數(shù)細胞信號轉(zhuǎn)導。研究顯示多種神經(jīng)營養(yǎng)因子作用如NGF、GDNF、EGF和FGF等都需要依賴其受體在脂質(zhì)筏中的定位而實現(xiàn)。大多數(shù)突觸生成需要的膽固醇主要來自星型膠質(zhì)細胞的大量合成,并由含載脂蛋白ApoE的脂蛋白運輸?shù)缴窠?jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)ApoE的基因結構具有明顯的遺傳多態(tài)性,其中ApoE4 (ApoE中HDL新生能及膽固醇供給能最小的基因型)是遲發(fā)性家族性老年性癡呆和散發(fā)性老年性癡呆的主要危險因子。ApoE4的基因敲除小鼠突觸細胞膜的膽固醇含量比正常組顯著增高。而DHCR24是膽固醇合成的最終階段鏈留醇desmonsterol還原為膽固醇過程的關鍵酶。腦內(nèi)膽固醇在24S-羥化酶(CYP46)的作用下降解為24S-羥膽固醇,通過血腦屏障,由LDL轉(zhuǎn)運至肝臟代謝。AD患者腦內(nèi)膽固醇代謝存在明顯異常。例如Heverin等指出24S-羥膽固醇的含量在全腦各區(qū)均下降,膽固醇/ 24S-羥膽固醇的比值與之類似,提示AD患者腦內(nèi)膽固醇含量的降低。盡管有一些證據(jù)表明血清膽固醇含量的增加可能增加寡聚Αβ (oligomeric Aβ )的產(chǎn)生和蓄積,但是這種Aβ蓄積反之也會引發(fā)膽固醇從神經(jīng)細胞膜的流失從而導致tau的過度磷酸化及突觸可塑性的損傷,提示膽固醇從神經(jīng)細胞膜的流失很可能是最終導致AD發(fā)病的重要因素。由此可見,膽固醇代謝異常幾乎與所有重要的AD發(fā)病機制有關。因此調(diào)節(jié)膽固醇代謝合成代謝過程中的某些靶點,將有可能突破AD藥物研究的瓶頸,促使新治療方法的誕生?;虔煼ㄊ侵笇⒔】岛驼5幕?,通過某種載體,導入人體細胞中有缺損或有變異基因的部份,以替代缺損或變異的基因,從而治療疾病的一種方法,10多年來,已經(jīng)不斷在新領域取得成功,預計到2010年或2020年,基因療法將成為一種普通的治療方法。目前市場上應用基因療法以治療AD的藥物還沒有出現(xiàn),正在試驗中的基因療法藥物也寥寥無幾,其根本原因在于AD發(fā)病機理的復雜性決定了很難用一種基因的補充達到治療AD的·目的。而本發(fā)明的基因療法的靶點24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24,則在近年來神經(jīng)細胞保護研究方面趨于熱點。DHCR24可以從多個方面發(fā)揮抗神經(jīng)細胞凋亡的神經(jīng)細胞保護作用,其理論依據(jù)闡述如下。DHCR24是一種具有膽固醇合成作用和抗細胞凋亡作用的多功能蛋白。Greeve等研究發(fā)現(xiàn)DHCR24的mRNA水平在AD患者腦部受影響區(qū)域(大腦顳葉)顯著降低,而且證明DHCR24過表達的神經(jīng)細胞對β -淀粉樣蛋白沉著引起的細胞凋亡有抑制作用(Greeve等人,J. Neurosci, 20: 7345,2000) ;Crameri A 等人利用 DHCR24 基因敲除小鼠證明 DHCR24的缺失通過破壞以膽固醇為主要組成成分的脂質(zhì)筏(lipid raft)的成分促進了淀粉樣前體蛋白(APP)降解為Αβ,反之DHCR24的過表達通過增加細胞膜膽固醇的含量減少了 Αβ的產(chǎn)生,提示hDHCR24依賴性膽固醇合成與維持神經(jīng)細胞內(nèi)Αβ的低水平相關(CrameriA等人,EMBO J,25: 432,2006);而包括我們自己在內(nèi)的幾個研究小組也在近期先后證明DHCR24可以通過清除過氧化氫或增加膽固醇含量等直接或間接的方式對抗神經(jīng)細胞的慢性及急性氧化應激(包括Αβ )導致的細胞凋亡(Lu等人,Endocrinology, 149: 3267,2008 ;Cecchi, C 等人,J Cell Mol Med, 2008 ; Kuehnle, K.等人,Mol Cell Biol, 28:539,2008);近年來,有研究者提出AD癥可以被稱為3型糖尿病的觀點,持這種觀點的研究小組發(fā)現(xiàn)AD患者存在胰島素抵抗的癥狀及相關的分子生物學病理基礎(Craft等人,Neurobiol Aging, 17: 123,1996 ;Steen, E.等人,J Alzheimers Dis, 7: 63,2005)。我們的研究證明胰島素樣生長因子受體的神經(jīng)細胞保護作用需要其受體在細胞窖中的存在(Lu等人,Exp Cell Res, 314: 342,2008),而且DHCR24通過維持細胞窖的正常結構在insulin-Akt-Bad 生存級聯(lián)中發(fā)揮重要作用(Lu 等人,Endocrinology, 147: 3123, 2006)。最新研究發(fā)現(xiàn)雌激素療法對AD病人具有的抗憂郁焦慮、擴張改善腦循環(huán)、調(diào)節(jié)炎性反應、恢復神經(jīng)元功能等神經(jīng)保護作用,與上調(diào)DHCR24表達有關(Benvenuti等人,J ClinEndocrinol Metab, 90: 1775,2005)。綜上,DHCR24 可以從減少 Αβ 產(chǎn)生、對抗由 Αβ 蓄積產(chǎn)生的細胞應激而誘導的神經(jīng)細胞凋亡、以及增敏神經(jīng)細胞的胰島素信號通路等多個方面發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用,從而使DHCR24基因成為AD治療的新的靶點。
發(fā)明內(nèi)容
由于DHCR24是一個在體內(nèi)多種組織細胞中廣泛表達的基因,在考慮以DHCR24為靶點進行阿爾茨海默癥的治療時,為了避免DHCR24過表達在其他組織細胞中可能造成的膽固醇合成過多而產(chǎn)生的副作用,如果能夠?qū)崿F(xiàn)DHCR24在神經(jīng)細胞的特異性靶向表達,則為首選的治療策略。因此本發(fā)明的第一個目的,在于神經(jīng)細胞特異性表達啟動子驅(qū)動下至少含有一個編碼24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24的異源DNA片段的缺失重組腺病毒或其一種衍生物。其次,由于DHCR24在人體各個組織細胞中表達的廣泛性,隨著研究的深入,DHCR24將有可能被發(fā)現(xiàn)在除神經(jīng)細胞外的很多組織細胞類型中,通過其膽固醇合成作用以及其自身的活性氧清除作用,發(fā)揮重要的類似的細胞保護作用,這暗示了 DHCR24在未來治療以氧化應激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等細胞應激為共通分子機制的一些其他常見疾病中作為基因治療靶點的可能性。因此利用重組腺病毒為載體將DHCR24靶向性地實現(xiàn)組織細胞特異性表達,將有可能成為未來的治療策略。
在本發(fā)明的意義上,24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24的衍生物是指由DHCR24多肽衍生的保持DHCR24膽固醇還原酶功能和抗氧化活性的任何類似物、片段或者突變形式。不同的衍生物可以自然存在,這些衍生物可以是等位基因變異,其特征在于編碼DHCR24的結構基因的核苷酸序列的不同,或可以由不同剪接或翻譯后修飾得到。這些衍生物可以由一種或多種氨基酸殘基經(jīng)置換、缺失、插入和/或修飾得到。可以采用本領域技術人員已知的任何技術進行這些修飾。在本發(fā)明范圍內(nèi)產(chǎn)生的DHCR24蛋白或其衍生物可以是cDNA,基因組DNA (gDNA),或一種例如由其中被插入一個或多個內(nèi)含子的cDNA組成的雜合構建體,還可能涉及合成序列或者半合成序列。有力地,使用cDNA或gDNA序列。特別地,使用gDNA在人的細胞中能更好地表達。根據(jù)第一個實施方式,涉及人源的DHCR24的編碼cDNA序列,為本發(fā)明的優(yōu)選方式。用于本發(fā)明范圍內(nèi)的腺病毒是重組腺病毒,即含有異源DNA序列的腺病毒。有利地,涉及缺失重組腺病毒,即不能在靶細胞中自主復制的腺病毒。對于本發(fā)明腺病毒的構建體,可以是人源或者是動物源的。關于人源的腺病毒,優(yōu)選的可以列舉C組的腺病毒,特別是Ad2,Ad5,Ad7或Adl2類腺病毒。在動物源的不同腺病毒中,優(yōu)選地可以列舉犬源腺病毒,特別是所有CAV2腺病毒株(如曼哈頓株或A26/6KATCCVR-800))。腺病毒基因組特別地含有處在每個端部的末端反向重復序列(ITR)、衣殼化的序列,早期基因和晚期基因,主要的早期基因包含在El、E2、E3和E4區(qū)中,其中El區(qū)中所包含的基因?qū)τ诓《痉敝秤绕涫潜夭豢缮俚?。主要的晚期基因包含在LI至L5區(qū)中。Ad腺病毒基因組被完全測序,并且基于已知數(shù)據(jù)是可得到的(具體參見Genbank M73260)。同樣地,部分,甚至全部其他的腺病毒基因組(Ad2、Ad7、Adl2)也都被測序。正如前面所指出的,本發(fā)明的腺病毒存在缺陷,因此在靶細胞中是不能自主性被復制的。為此,曾制備出由腺病毒衍生的不同構建體,同時加入不同的治療基因。在每一種這種構建體中,該腺病毒被修飾,以便使其在感染細胞中不能復制。于是,在現(xiàn)有技術中描述的構建體是病毒復制必不可少的El區(qū)中缺損的腺病毒,異源DNA序列已插入該區(qū)中(Levrero 等人,基因(gene)雜志,101 (1991) 195 ;Gosh-Choudhury 等人,基因(gene)雜志,50 (1986) 161)。另外,為了改善載體的性質(zhì),曾提出在腺病毒基因組中產(chǎn)生其他缺失或修飾。于是,曾在tsl25突變體中導入熱敏點突變,這樣能夠使DNA鏈的72KDa的蛋白失活(DBP) (Van der Vlier 等人,病毒學雜志(J. Virol.,1975,15(2)348-354)。其他載體含有對復制和/或病毒繁殖必不可少的另一區(qū),E4區(qū)的缺失。事實上在調(diào)節(jié)晚期基因表達,在晚期核RNA的穩(wěn)定性、在消除宿主細胞蛋白表達中和在病毒DNA復制的效率方面都涉及E4區(qū)。其中El和E4區(qū)缺失的腺病毒載體因此具有非常低的轉(zhuǎn)錄水平和病毒基因表達。這樣一些載體是現(xiàn)在通用的腺病毒載體。在一個本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中,重組腺病毒是C組的人腺病毒。更優(yōu)選地,涉及Ad2或者Ad5腺病毒。有利地,本發(fā)明范圍內(nèi)使用的重組腺病毒包含在其基因組的El區(qū)中的一處缺失。更優(yōu)選地,它包含Ela和Elb區(qū)的一處缺失。作為實例,可以列舉影響核苷酸454-3328、386-3446,459-3510 或 357-4020 (對于 Ad5 基因組)的缺失。·例如可以涉及所述的第三代重組腺病毒,即全部或部分El或者E4區(qū),以及任選地E3區(qū)是缺損的。本發(fā)明特定的變化方式由使用帶有影響全部或部分下述功能區(qū)的缺失的腺病毒構成
-EUE4 和 E3 區(qū),
-EUE4 和 E2 區(qū),
-E1、E4、E2 和 E3 區(qū),
-上述區(qū)以及腺病毒(L1-L5)晚期功能的編碼基因的全部或部分,或 -全部病毒編碼區(qū)。對于同時不具備晚期功能的腺病毒(最小載體)或全部編碼區(qū)(沒有生氣的載體),例如Parks等人在PNAS雜志93 (1996),第13565頁和Lieber等人在病毒學雜志(J. Virol. ) 70 (1996),第8944頁中描述過他們的構建。包含DHCR24的DNA序列及其上游的神經(jīng)特異性表達啟動子序列(表達盒)可以插入到重組體基因組的不同位點。該盒可以插入E1,E3或E4區(qū),置換缺失的序列或添加。該盒還可以順式插入在產(chǎn)生病毒必不可少的序列(ITR序列和衣殼化序列)之外的任何其他部位。在本發(fā)明的意義上,術語表達盒應當理解為是核酸,其可以被插入載體中特定限制性位點的DNA片段;DNA片段還含有編碼RNA或目標多肽的核苷酸序列,表達所述有意義序列必需的序列(增強子、啟動子、聚腺苷酸化序列)??梢栽O想DNA片段和限制性位點來保證在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的適當可讀框內(nèi)插入所述片段。在衣殼化細胞系中,即能夠在重組腺病毒基因組中反式互補一個或多個不足功能的細胞系,產(chǎn)生這些重組腺病毒。在本領域技術人員已知的衣殼化的細胞系中,可以列舉293細胞系,其中一部分腺病毒基因組被整合。更確切地說,293細胞系是含有血清型5腺病毒基因組(Ad5)左端(約11-12%)的腎的人胚細胞系,包含左ITR區(qū)、衣殼化區(qū)、其中包括Ela和Elb的El區(qū),pIX蛋白編碼區(qū)和一部分pIVa蛋白編碼區(qū),這種細胞系能夠與El區(qū)缺損,即沒有全部或部分的El區(qū)缺損重組腺病毒反式互補,還能夠產(chǎn)生具有高效價的病毒原種。特別地基于A549人的肺癌細胞(WO 94/28152),或基于人的眼癌(人基因治療(Hum. Gen.Ther. ) (1996)215),描述了能夠與El區(qū)互補的其他細胞系。另外,也描述了能夠反式互補多個腺病毒功能的細胞系。特別地,可以列舉El和E4區(qū)互補的細胞系等(Yeh等人,病毒學雜志(J. Virol.),第 70 卷(1996),第 559-565 頁)。和 El 與 E2 互補的細胞系(W094/28152,WO 95/02697)或適用于生產(chǎn)最小腺病毒的細胞系得到的細胞系,其原因尤其在于他們還表現(xiàn)在這樣病毒構建體中涉及的特異性位點重組酶的活性。這些重組腺病毒通常是通過在衣殼化的細胞系中導入病毒DNA,接著在約2-3天后溶解細胞得到的(腺病毒循環(huán)動力學是24-48小時)。為了實施該方法,導入的病毒DNA可以是完全的重組病毒基因組,該基因組任選地在細菌中或在酵母中構建,在細胞中感染。還可能涉及感染衣殼化細胞系所使用的重組腺病毒。病毒DNA還能夠以每個都帶一部分重組腺病毒基因組和一個同源區(qū)的片段形式導入,在導入衣殼化細胞中之后,他們能夠通過在不同片段之間的同源重組重新構建重組病毒基因組。在溶解細胞之后,重組腺病毒顆??梢圆捎萌魏我阎募夹g進行分離,例如氯化 銫梯度離心法分離或色譜法或市售腺病毒提取試劑盒進行分離。組織特異性表達調(diào)節(jié)序列。在任何組織特異性表達調(diào)節(jié)序列例如像啟動子或啟動子/增強子的控制下,DHCR24的編碼基因發(fā)揮功能,提供在特異性的組織細胞中靶向表達。本發(fā)明中列舉的神經(jīng)特異性表達調(diào)節(jié)序列,是指能夠使驅(qū)動的靶基因在神經(jīng)細胞及神經(jīng)組織中優(yōu)勢表達的調(diào)節(jié)序列。在可被用于本發(fā)明范圍內(nèi)的啟動子中,可以列舉神經(jīng)組織特異性啟動子,選自神經(jīng)元特異性烯醇化酶Neuron-specific enolase (NSE)的調(diào)節(jié)序列(Adrian E. Morelli 等人,Journal of General Virology (1999), 80, 571-583)以及突觸蛋白 I synapsin I (SYNl)的調(diào)節(jié)序列(Sherif Boulosa 等人,· brain research,2006)。但是本發(fā)明不限于神經(jīng)細胞特異性表達DHCR24重組腺病毒的構建,其他組織特異性啟動子或調(diào)節(jié)序列和DHCR24的DNA序列組成的表達盒都在本發(fā)明的限定之列。如在胰島β細胞中是胰島素基因調(diào)節(jié)序列(Hanahan,1985,自然,315:115-122),淋巴樣細胞中是免疫球蛋白的表達調(diào)節(jié)序列(Grosschedl等人,1984,細胞,38:647-658),在肝臟中是活性的白蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Pinkert等人,1987,基因和進展,1:268-276)、活性的甲胎蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Krumlauf等人,1985,分子細胞生物學,5:1639-1648)、活性的al-抗胰蛋白酶基因調(diào)節(jié)序列(Kerlsey等人,1987,基因和進展,1:161-171 ),在骨髓細胞中是活性的b_球蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Mogram等人,1985,自然,315:338-340),在腦少突膠質(zhì)細胞中是活性的堿性髓磷脂基因調(diào)節(jié)序列(Readhead等人,1987,細胞,48:703-712),在骨骼肌內(nèi)是活性的肌球蛋白輕鏈2基因的調(diào)節(jié)序列(Sani,1985,自然,314 :283_286),和在下丘腦中是活性的促性腺激素釋放激素的基因的調(diào)節(jié)序列(Masonden等,1986,科學,234:1372-1378)。在本發(fā)明的特別實施方式中,優(yōu)選地選自突觸蛋白I synapsin I (SYN)的調(diào)節(jié)序列的控制下,使用DHCR24編碼基因的缺損重組腺病毒。
圖la,是含有PSYNl調(diào)節(jié)序列與DHCR24cDNA序列的表達盒的構建圖中,圖左側(cè)含有DHCR24 cDNA序列的pcDNA3. IA myc his質(zhì)粒載體為申請者之前構建,詳細信息參見申請者發(fā)表于美國內(nèi)分泌學雜志的(Endocrinology,149: 3267,2008)中所描述的。其連入的外源基因DHCR24cDNA序列的N端多克隆位點部位含有KpnI和BstXI酶切位點。圖右側(cè)的人源SYNl的啟動子調(diào)節(jié)序列PSYNl來源于人的HEK293細胞的基因組DNA經(jīng)PCR擴增得到。得到的PCR片段經(jīng)TA克隆、測序,確定陽性克隆后,所得T載體再行擴增、提取后得到。圖Ib,是由圖Ia所得的含有神經(jīng)特異性啟動子表達盒的質(zhì)粒載體經(jīng)Kpn及PmeI酶切后連接入經(jīng)KpnI與ECOR V雙酶切的pshuttle穿梭載體中的構建 圖中,PmeI酶切位點與EcoR V的連接為平末端連接。所得含有DHCR24表達盒的穿梭載體再經(jīng)線性化、電轉(zhuǎn)、挑選陽性克隆后,經(jīng)由293細胞包裝獲得最后的重組腺病毒。有關線性化以及電轉(zhuǎn)等詳細過程見圖2。圖2,是所得pShuttle-PSYNl_DHCR24穿梭載體經(jīng)PacI酶切線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化與預先負荷了腺病毒5型基因組骨架的大腸桿菌中,進行同源重組構建圖; 圖中,該腺病毒骨架為El區(qū)與E3區(qū)同時缺損型。轉(zhuǎn)化后的克隆經(jīng)酶切鑒定為陽性的克隆,進一步擴增,并提純其含有插入了外源基因表達盒的重組腺病毒基因組骨架質(zhì)粒。該質(zhì)粒再經(jīng)PacI酶切線性化,所得質(zhì)粒部分提純后轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行腺病毒包裝。圖3,是神經(jīng)特異性過表達DHCR24的重組腺病毒在各細胞類型中誘導DHCR24表達情況;
圖中,MIN6細胞培養(yǎng)基為含有10%FBS和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。N2A細胞培養(yǎng)基為含有10%FBS和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。使用Ad-PSYN1_DHCR24載體以20 moi (感染復數(shù),multiplicity of infection)感染細胞48小時后,收集細胞,提取細胞總蛋白。使用Ad-CMV-DHCR24做對照(以CMV泛表達啟動子驅(qū)動DHCR24表達的重組腺病毒,詳細信息見于Lu等發(fā)表于的文獻Endocrinology, 149: 3267,2008)。然后用蛋白西方印跡技術WesternBlotting檢測DHCR24蛋白的表達情況。一抗使用鼠源anti-myc抗體(Cell signaling,myc 為 DHCR24 蛋白 C 端標簽序列)。二抗使用 Anti-mouse IgG (Cell signaling)。圖4 Ad-PSYNl-DHCR24的神經(jīng)細胞保護作用 圖中,使用Ad-PSYN1-DHCR24載體以20 moi感染N2A神經(jīng)細胞,并且以重組腺病毒Ad-CMV-LacZ (LacZ,β -半乳糖苷酶,一種細菌蛋白)做對照。腺病毒感染48小時后,細胞被分別施加200 μΜ過氧化氫(氧化應激誘導劑),lPg/ml衣霉素(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑)以及 μΜ(阿爾茨海默癥典型病理因子可導致神經(jīng)細胞凋亡)刺激,48小時后細胞被分別
用相差顯微鏡照相并計數(shù),統(tǒng)計結果如圖所示。材料與方法 分子生物學的一般技術
分子生物學中使用的常規(guī)方法,例如DNA的制備提取,以氯化銫梯度表示的質(zhì)粒DNA離心分離,采用瓊脂糖或丙烯胺凝膠進行的電泳,采用電洗脫進行的DNA片段純化,用酚或酚-氯仿提取蛋白,用乙醇或異丙醇在鹽介質(zhì)中沉淀DNA,在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒等,都是本領域技術人員熟知的,并且文獻做了大量描述。關于連接,根據(jù)DNA片段的大小,采用瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分離這些DNA片段,用苯酚或苯酚、氯仿混合物提取,在乙醇中沉淀,然后根據(jù)供應商提供的DNA連接酶進行孵育連接。
根據(jù)生產(chǎn)者的說明書,使用PCR儀,采用所述的PCR技術進行DNA片段的酶促擴增獲取DNA片段。采用Sanger等人研制的方法,使用Amersham提供的試劑盒,確認核苷酸序列(測序)。
具體實施例方式實施例I :構建表達DHCR24的編碼基因(參見Genbank )的缺損腺病毒。該實施例描述構建帶有DHCR24編碼基因的缺損重組腺病毒載體,該基因以基因工程技術與SYN啟動子連接。首先以HEK293 genome DNA (ATCC CRL-1573)為模板,以 Kpn I 以及 BstX I 酶切位點加入到上下游引物后,經(jīng)巢式PCR兩步擴增得到長度為500bp的SYNl的啟動子序列(PSYNl)。hSYNl-Ex S: 5_gcctgtgtggatgtgggagactaat_3hSYNl-Ex AS: 5_tgcaggtctgtcatgtacccatttg_3hSYNl—In S-KpnI: 5_ggtacctgacgaccgaccccg_3hSYNl-In AS-BstXI: 5ccagtgtggtggggctgcgacttgggg_3
所得PSYNl的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆、測序,所得陽性克隆經(jīng)大腸桿菌擴增,DNA提取純化。純化后的pGEMT-easy-PSYNl質(zhì)粒經(jīng)KpnI及BstXI雙酶切后,所得PSYNl片段經(jīng)瓊脂糖膠提純備用。然后將含有人的dhcr24的基因序列的cDNA片段連同myc標簽序列以及組氨酸標簽序列從 pcDNA3. I myc his_DHCR24 質(zhì)粒(Lu 等人,Endocrinology, 149: 3267, 2008)中用Kpn I和BstXI雙酶切。得到的質(zhì)粒片段與上述所得PSYNl片段由T4連接酶連接,得到重組質(zhì)粒 pcDNA3. IA myc his-PSYNl~DHCR24 (如圖 Ia 所示)。將分別由pShuttle質(zhì)粒載體經(jīng)KpnI以及EcoRV雙酶切后所得質(zhì)粒片段以及將上述pcDNA3. IA myc his-PSYNl~DHCR24重組質(zhì)粒由Kpn I和Pme I雙酶切后所得外源基因片段經(jīng)T4連接酶連接,得到pshuttle-PSYNl-DHCR24重組穿梭載體(如圖Ib所示)。得到的穿梭質(zhì)粒pshuttle-PSYNl-hDHCR24在經(jīng)Pme I線性化后,電轉(zhuǎn)染至預先負荷了 pAdEasy-Ι腺病毒骨架的大腸桿菌(Agilent Technologies)中,實現(xiàn)同源重組,將帶有P SYNl神經(jīng)特異性啟動子和hDHCR24(帶有myc和his標簽)的表達盒重組到腺病毒的基因組骨架中,得到重組腺病毒骨架質(zhì)粒。該腺病毒骨架為Ad5型,El和E3區(qū)缺損。經(jīng)酶切驗證后,挑選陽性克隆,大腸桿菌擴增,DNA提純,得到的大量重組腺病毒骨架質(zhì)粒由PacI線性化后,在圖2中描述了這種構建的原理。由這種重組產(chǎn)生的pAd質(zhì)粒含有El和E3缺損5型腺病毒基因組,該基因組還含有PSYNl-DHCR24-myc-his表達盒(如圖2所示)。通過由293細胞系(ATCC CRL-1573)中被Pac I消化的pAd的DNA感染產(chǎn)生了Ad-PSYNl-hDHCR24腺病毒。得到的病毒顆粒然后在此同樣的細胞系中擴增,得到的病毒原種采用氯化銫雙梯度進行純化。這些病毒顆粒然后用于研究在神經(jīng)細胞以及其他細胞系中DHCR24的表達。實施例2 :在體外由Ad-DHCR24載體感染神經(jīng)細胞以及其他細胞系中DHCR24基因的表達。
對不同細胞系試驗了用Ad-PSYNl-hDHCR24載體感染細胞后DHCR24的表達情況神經(jīng)母細胞瘤細胞株(N2A)以及胰島β細胞株(ΜΙΝ6)。使用Ad-PSYN1_DHCR24載體以 20 moi(感染復數(shù),multiplicity of infection)感染細胞48小時后,收集細胞,提取細胞總蛋白。使用Ad-CMV-DHCR24做對照(以CMV泛表達啟動子驅(qū)動DHCR24表達的重組腺病毒,詳細信息見于Lu等發(fā)表于的文獻Endocrinology,149: 3267,2008)。然后用蛋白西方印跡技術Western Blotting檢測DHCR24蛋白的表達情況。抗體使用anti-myc抗體(myc為DHCR24蛋白C端標簽序列)。結果如圖3所示,在Ad-CMV-DHCR24轉(zhuǎn)染組,N2A神經(jīng)細胞以及MIN6胰島β細胞均顯現(xiàn)出過表達,而在Ad-PSYN1-DHCR24轉(zhuǎn)染組,只有N2A細胞顯示出過表達,MIN6胰島β細胞未檢測出特異性條帶,證明沒有外源DHCR24的過表達。我們的結果有力證明,重組腺病毒Ad-PSYN1-DHCR24的轉(zhuǎn)染能夠產(chǎn)生特異性地靶向神經(jīng)細胞的使DHCR24過量表達的作用。實施例3 Ad-PSYNl-DHCR24的神經(jīng)細胞保護作用研究。使用Ad-PSYN1-DHCR24載體以20 moi感染N2A神經(jīng)細胞,并且以重組腺病毒·Ad-CMV-LacZ (LacZ, β -半乳糖苷酶,一種細菌蛋白)做對照。腺病毒感染48小時后,細胞被分別施加200μΜ過氧化氫(氧化應激誘導劑), μδ /ml衣霉素(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑)以及 μΜ (阿爾茨海默癥典型病理因子可導致神經(jīng)細胞凋亡)刺激,48小時后細胞被分別用相差顯微鏡照相并計數(shù),統(tǒng)計結果如圖4所示。Ad-PSYN1-DHCR24轉(zhuǎn)染組細胞在三種刺激中,與對照組Ad-CMV-IacZ相比,均表現(xiàn)出較多的存活細胞數(shù),證明DHCR24具有顯著的神經(jīng)細胞保護作用。所有這些結果證明
1、腺病毒載體是一種對dhcr24基因特別有效的載體;
2、使用這樣的載體,在神經(jīng)特異性啟動子的驅(qū)動下,可以實現(xiàn)DHCR24蛋白在神經(jīng)細胞中的靶向性過表達。使用能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)特異性表達DHCR24的重組腺病毒具有顯著的神經(jīng)細胞保護作用。
權利要求
1.缺損重組腺病毒,其特征在于它含有編碼24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24的DNA序列,且所述的DNA序列被置于組織特異性啟動子的控制下;所述啟動子選自神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE的調(diào)節(jié)序列、突觸蛋白I synapsin I(SYN)的調(diào)節(jié)序列、胰島素基因的調(diào)節(jié)序列、彈性蛋白酶I的調(diào)節(jié)序列、免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、白蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、α -胎兒蛋白基因的調(diào)節(jié)序列、堿性髓磷脂基因的調(diào)節(jié)序列、肌球蛋白輕鏈2基因的調(diào)節(jié)序列和促性腺激素釋放激素的基因的調(diào)節(jié)序列。
2.根據(jù)權利要求I所述的腺病毒,其特征在于所述DNA序列為cDNA序列。
3.根據(jù)權利要求I所述的腺病毒,其特征在于所述DNA序列為gDNA序列。
4.根據(jù)權利要求I所述的腺病毒,其特征在于所述DNA序列編碼人的24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24。
5.根據(jù)權利要求I所述的腺病毒,其特征在于所述DNA序列編碼小鼠的24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24。
6.根據(jù)權利要求I所述的腺病毒,其特征在于所述DNA序列編碼大鼠的24-脫氫膽固醇還原酶DHCR24。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的腺病毒,其特征在于它包含El區(qū)的全部或部分缺失和E4區(qū)的全部或部分缺失中的至少一種。
8.根據(jù)權利要求7所述的腺病毒,其特征在于它包含E4區(qū)的全部或部分缺失。
9.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的腺病毒,其特征在于它涉及Ad2或Ad5類型人的腺病毒或CAV類型犬的腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織特異性表達的24-脫氫膽固醇還原酶編碼重組腺病毒。屬于阿爾茨海默癥基因治療法與治療領域。更具體地,本發(fā)明借助于基因腺病毒載體在神經(jīng)細胞中導入24-脫氫膽固醇還原酶(DHCR24)的編碼基因,上調(diào)24-脫氫膽固醇蛋白在神經(jīng)細胞的表達,以發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用。本發(fā)明還涉及用于含有神經(jīng)特異性表達dhcr24基因的復制的缺損重組腺病毒的構建以及這些載體在將dhcr24基因轉(zhuǎn)移入細胞以及實現(xiàn)DHCR24蛋白在神經(jīng)細胞特異性表達的應用。制備的重組腺病毒有望在阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行疾病或其他需要DHCR24補充療法的基因治療中獲得肯定的療效。
文檔編號C12N15/53GK102787101SQ20121011372
公開日2012年11月21日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權日2012年4月18日
發(fā)明者劉劍利, 蘆秀麗, 賈丹, 趙晨光, 高兵 申請人:遼寧大學