專利名稱：：用氧結(jié)合蛋白提高多殺菌素產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明用于分子遺傳學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，其中可將基因整合至刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)的染色體中。一種代謝工程方法包括氧結(jié)合蛋白諸如血紅蛋白基因在染色體DNA區(qū)內(nèi)的整合和表達(dá)，所述整合和表達(dá)導(dǎo)致提聞的多殺菌素廣生，同時(shí)不對(duì)刺糖多孢菌的生長(zhǎng)或者其它期望代謝特征產(chǎn)生負(fù)面影響。
背景技術(shù)：
：·如美國(guó)專利5，362，634所披露，發(fā)酵產(chǎn)品A83543是由刺糖多孢菌產(chǎn)生的相關(guān)化合物的家族。該家族的已知成員已被稱為因子或組分，并且各自給予標(biāo)識(shí)字母代號(hào)。這些化合物在下文中稱為多殺菌素A、B等。多殺菌素化合物可用于控制蜘蛛、線蟲和昆蟲，具體為鱗翅目(Lepidoptera)和雙翅目(Diptera)物種。這些化合物被認(rèn)為是環(huán)境友好的，具有吸引人的毒理學(xué)概貌(toxicologicalprofile)。天然產(chǎn)生的多殺菌素化合物是由21碳四環(huán)內(nèi)酯組成的大環(huán)內(nèi)酯類，其包括兩個(gè)脫氧糖的附接中性糖(鼠李糖)和氨基糖(福樂(lè)糖胺)(參見(jiàn)Kirst等人，(1991)。若不存在所述氨基糖，則將所述化合物稱為假式元A、D(pseudoaglyconeofA,D)等；而若不存在所述中性糖，則將所述化合物稱為逆假式元A、D(reversepseudoaglyconeofA,D)等。更優(yōu)選的命名為將這些假甙元稱為多殺菌素A17-Psa、多殺菌素D17-Psa等，而將這些逆假甙元稱為多殺菌素A9-Psa、多殺菌素D9-Psa等。天然產(chǎn)生的多殺菌素化合物可經(jīng)發(fā)酵由刺糖多孢菌菌株NRRL18395,18537,18538，18539，18719，18720,18743和18823以及它們衍生物制備。這些培養(yǎng)物已經(jīng)進(jìn)行保藏，并成為美國(guó)北方農(nóng)業(yè)研究所保藏中心(theMidwestAreaNorthernRegionalResearchCenter,Agricultura丄ResearchService,UnitedStatesDepartmentofAgriculture,1815NorthUniversityStreet,Peoria,111.,61604)的原種培養(yǎng)物保藏的一部分。美國(guó)專利5，362，634及對(duì)應(yīng)的歐洲專利037531681涉及多殺菌素ム、8、(、0、￡、？、6、H和J。這些化合物據(jù)稱通過(guò)培養(yǎng)選自NRRL18395,NRRL18537,NRRL18538和NRRL18539的新型微生物刺糖多孢菌的菌株產(chǎn)生。WO93/09126涉及多殺菌素L、M、N、Q、R、S和T。其中還討論了兩種產(chǎn)生多殺菌素J的菌株NRRL18719和NRRL18720，以及產(chǎn)生多殺菌素Q，R，S和T的菌株NRRL18823。WO94/20518和美國(guó)專利5，6704，486涉及多殺菌素K、0、P、U、V、W和Y以及它們的衍生物。其中還討論了產(chǎn)生多殺菌素K的菌株NRRL18743。產(chǎn)生多殺菌素化合物的挑戰(zhàn)來(lái)自需要鑒定和驗(yàn)證刺糖多孢菌基因組內(nèi)的中性位點(diǎn)，其中含有基因表達(dá)盒的多核苷酸可進(jìn)行整合和穩(wěn)定表達(dá)。引入的基因表達(dá)盒可含有生物合成基因，該生物合成基因提供一種產(chǎn)生可具有不同的殺蟲活性譜的多殺菌素新型衍生物的方法，或者除了會(huì)賦予現(xiàn)有的多殺菌素產(chǎn)生菌株新的有益特性的其它基因表達(dá)盒之夕卜，還能提聞多殺菌素的滴度水平的基因表達(dá)盒。鑒定和引入導(dǎo)致多殺菌素化合物的產(chǎn)生提高的基因會(huì)是有利的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及將多核苷酸整合至可用于產(chǎn)生殺蟲劑的刺糖多孢菌菌種的染色體DNA中的方法，其整合體，以及該整合體的用途。本發(fā)明還提供含有多殺菌素增強(qiáng)基因的遺傳修飾的宿主細(xì)胞，所述多殺菌素增強(qiáng)基因整合至刺糖多孢菌基因組中，這導(dǎo)致多殺菌素產(chǎn)生的提高。如此，刺糖多孢菌滴度水平導(dǎo)致?lián)u瓶發(fā)酵中A/D產(chǎn)生或J/L產(chǎn)生的改善?！け景l(fā)明還提供用于將氧結(jié)合基因整合在刺糖多孢菌內(nèi)的方法。本發(fā)明的ー種具體實(shí)施方案利用VHb基因編碼的多殺菌素增強(qiáng)性質(zhì)，其中VHb基因表達(dá)盒攜帯在刺糖多孢菌的染色體上。VHb基因的表達(dá)導(dǎo)致改善和提高的多殺菌素產(chǎn)生。同樣，刺糖多孢菌的搖瓶發(fā)酵中的A/D多殺菌素產(chǎn)生得以提高。圖I描述包含977bp合成DNA片段和pJ201的質(zhì)粒pDAB109000。圖2描述將血紅蛋白基因表達(dá)盒克隆至PIJ773中得到的質(zhì)粒PDAB109001。具體實(shí)施例方式在刺糖多孢菌的染色體內(nèi)的整合基因存在多種用途。天然或異源的克隆基因可用于改善多殺菌素的產(chǎn)率以及產(chǎn)生新的多殺菌素。改善的產(chǎn)率可通過(guò)將在該菌株中任何限速的酶的基因的復(fù)制拷貝整合至該菌株的基因組中得到。在生物合成途徑在特定突變體菌株中由于缺乏所需的酶而阻斷的情形中，期望的多殺菌素的產(chǎn)生可通過(guò)整合所需基因的拷貝得到恢復(fù)。在生物合成途徑破壞的情形中，可生成不同的前體菌株。本申請(qǐng)示例說(shuō)明了在刺糖多孢菌中透明顫菌屬(Vitreoscilla)血紅蛋白基因序列(在下文中稱為“VHb”)的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致多殺菌素產(chǎn)生的提高。對(duì)于刺糖多孢菌菌株的改善，通過(guò)將基因表達(dá)盒整合至刺糖多孢菌的基因組中進(jìn)行多核苷酸的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化?；虻恼贤ㄟ^(guò)利用一部分染色體DNA和插入元件的同源重組完成?？蓪⑷旧wDNA插入刺糖多孢菌基因組中。基于該重組以及其應(yīng)用的結(jié)果，將aac(3)IV和VHb基因表達(dá)盒分別在遮蔽蛋白聚酮合成酶(obscurinpolyketidesynthase)(PKS)基因座處整合至刺糖多孢菌的染色體中，導(dǎo)致天然基因obsA的失活。本文中采用下面定義，這些定義應(yīng)該用于解釋權(quán)利要求和說(shuō)明書。本申請(qǐng)?jiān)诒景l(fā)明的要素或組分前所用的不定冠詞“ー個(gè)(a)”和“ー種(an)”意在關(guān)于該要素或組分的發(fā)生(即，出現(xiàn))次數(shù)而言是非限制性的。因此，〃ー個(gè)〃或〃ー種〃應(yīng)理解為包括一或者至少ー個(gè)(種)，并且所述要素或者組分的単數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)，除非數(shù)字明顯是指単數(shù)的。本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“包含”和“包括”是指存在如權(quán)利要求中所述的特性、整數(shù)、步驟或者組分，但是它并不排除存在或者加入一種或多種其它特性、整數(shù)、步驟、組分或它們的組。這意味著“包含”或“包括”一列要素的組合物、混合物、エ藝、方法、制品或者裝置不僅僅限于這些要素，而是可包括未清楚列出的或者其固有的其它要素。本申請(qǐng)所用的“或”是指兼取的和擇ー的“或者”。例如，下面任一種滿足A或B:A為是(或存在)而B為否(或不存在)，A為否(或不存在)而B為是(或存在)，以及A和B均為是(或存在)。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)"約"修飾本發(fā)明的或者所使用的成分或反應(yīng)物的數(shù)量，其是指，例如通過(guò)在現(xiàn)實(shí)世界中用于配制濃縮物或者使用溶液的典型的測(cè)量和液體處理步驟；通過(guò)這些操作中非故意的失誤；通過(guò)在用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞值闹圃?、?lái)源或純度中的差異；等等可出現(xiàn)的數(shù)量差異。術(shù)語(yǔ)〃約〃還涵蓋因由具體初始混合物得到的組合物的不同平衡條件引起的不同的量。不論被術(shù)語(yǔ)"約"修飾與否，權(quán)利要求都包括這些數(shù)量的等價(jià)物?！け旧暾?qǐng)所用術(shù)語(yǔ)"發(fā)明"或"本發(fā)明"是非限制性術(shù)語(yǔ)，其意在涵蓋所有如說(shuō)明書所描述和權(quán)利要求所述的可能的變體。本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)〃多肽〃和〃肽〃可互換使用，指兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接在一起的聚合物。一方面，該術(shù)語(yǔ)還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、こ?；?、磷酸化，等等。包括在該定義內(nèi)的是例如，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物或者標(biāo)記氨基酸的肽以及肽模擬物。肽可包含L-氨基酸。本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)〃感興趣的肽"、"P0I"、〃基因產(chǎn)物"、〃目標(biāo)基因產(chǎn)物〃和〃目標(biāo)編碼區(qū)基因產(chǎn)物〃是指通過(guò)重組表達(dá)的外源基因編碼的所期望的異源肽/蛋白質(zhì)產(chǎn)物。感興趣的肽可包括任何肽/蛋白質(zhì)產(chǎn)物，包括但不限于蛋白質(zhì)、融合蛋白、酶、肽、多肽和寡肽。感興趣的肽的大小為2398個(gè)氨基酸。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)〃遺傳構(gòu)建體〃是指可用于調(diào)節(jié)生物體的基因型或表型的一系列連續(xù)的核酸。遺傳構(gòu)建體的非限制性實(shí)例包括但不限于核酸分子，以及開放閱讀框架、基因、表達(dá)盒、載體、質(zhì)粒等。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)〃內(nèi)源基因〃是指在生物體的基因組中處于其天然位置的天然基因。本申請(qǐng)所用〃外源基因〃是指通常不見(jiàn)于宿主生物體中的基因，但是其通過(guò)基因轉(zhuǎn)移引入宿主生物體中。外源基因可包括插入非天然生物體中的天然基因，或者嵌合基因。本申請(qǐng)?jiān)诰唧w的生物體/基因組中針對(duì)序列的術(shù)語(yǔ)"異源"表示該序列源于外源物種，或者若源于相同的物種則通過(guò)故意的人工干預(yù)從其天然形式進(jìn)行了組成和/或基因組基因座的實(shí)質(zhì)性修飾。因此，例如，異源基因表達(dá)是指來(lái)自ー種生物體/基因組的基因通過(guò)將其置于不同的生物體/基因組的基因組中進(jìn)行表達(dá)的過(guò)程。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)〃重組體〃是指人工組合兩種本來(lái)是分開的(otherwiseseparated)序列片段，例如，通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)用遺傳工程技術(shù)對(duì)分離的核酸片段進(jìn)行操作。"重組體"還涉及通過(guò)引入異源核酸進(jìn)行修飾的細(xì)胞或載體，或者如此修飾的細(xì)胞衍生得到的細(xì)胞，但是不涵蓋因自然發(fā)生事件(例如，自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化、天然轉(zhuǎn)導(dǎo)、天然轉(zhuǎn)座)而改變的細(xì)胞或載體，諸如那些未經(jīng)故意的人為干預(yù)而發(fā)生改變的細(xì)胞或載體。術(shù)語(yǔ)〃遺傳工程(化)的〃或者〃遺傳改變的〃是指在活的生物體中的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改變。它涉及產(chǎn)生和使用重組體DNA。更具體而言，它用于描述從天然存在的生物體區(qū)分的遺傳工程化或修飾的生物體。遺傳工程化可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)諸如例如基因置換，基因擴(kuò)增，基因破壞，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化使用質(zhì)粒、病毒或其它載體實(shí)現(xiàn)。遺傳修飾的生物體例如遺傳修飾的微生物也常常稱之為重組生物，例如重組微生物。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“破壞的”或“破壞”在涉及基因時(shí)是指經(jīng)遺傳工程化或者經(jīng)改變基因活性的天然原因而經(jīng)過(guò)操作或改變。所述基因活性可提高或降低。此外，所述破壞可消除蛋白質(zhì)的功能。為了促進(jìn)這樣的下降，可減少基因拷貝數(shù)，例如通過(guò)基因的表達(dá)不足或破壞。如果所述基因的轉(zhuǎn)錄水平與野生型基因相比下降，那么該基因被認(rèn)為是〃表達(dá)不足的〃。這可通過(guò)例如Northern印跡分析(其對(duì)作為基因表達(dá)指標(biāo)的mRNA進(jìn)行定量)測(cè)量。如本申請(qǐng)中所使用的，若與野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量相比產(chǎn)生的mRNA的量下降了至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過(guò)500%，則基因是表達(dá)不足的?；蛘?，弱的啟動(dòng)子可用于引導(dǎo)多核苷酸的表達(dá)。在另ー實(shí)施方案中，該基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)節(jié)區(qū)和/或啟動(dòng)子可發(fā)生改變以實(shí)現(xiàn)降低的表達(dá)。所述表達(dá)也可通過(guò)縮短信使RNA的相對(duì)半壽期而降低。在另ー實(shí)施方案中，多肽本身的活性可通過(guò)利用多肽氨基酸序列中·的一個(gè)或多個(gè)降低活性的突變得到降低。例如，改變多肽對(duì)其相應(yīng)底物的親和カ可導(dǎo)致降低的活性。同樣地，可縮短多肽的相對(duì)半壽期。無(wú)論是基因表達(dá)降低還是活性降低的任一情形中，所述降低可通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或培養(yǎng)所用方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本申請(qǐng)所用的"降低的表達(dá)"或"降低的活性"是指與野生型蛋白質(zhì)、多核苷酸、基因；或者在多核苷酸或多肽減少之前存在的蛋白質(zhì)的活性和/或濃度相比，減少至少5%、10%、25%、50%、75%、100%,200%或者甚至超過(guò)500%。VHb蛋白的活性也可通過(guò)使該蛋白與其活性的特異性或一般性抑制劑接觸來(lái)降低。術(shù)語(yǔ)"降低的活性"、"減少或消除的活性"在本申請(qǐng)中可互換使用。在另ー實(shí)施方案中，該基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)節(jié)區(qū)和/或啟動(dòng)子可發(fā)生改變以實(shí)現(xiàn)提高的表達(dá)。過(guò)表達(dá)也可通過(guò)增加信使RNA的相對(duì)半壽期而降低。在另ー實(shí)施方案中，多肽本身的活性可通過(guò)利用多肽氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)提高活性的突變來(lái)提高。例如，改變多肽對(duì)其相應(yīng)底物的親和カ可導(dǎo)致活性提高。同樣地，可增加多肽的相對(duì)半壽期。在基因過(guò)表達(dá)或活性提高的任一情形中，所述提高可通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或培養(yǎng)所用的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本申請(qǐng)所用的"過(guò)表達(dá)"或"提高的活性"是指與野生型蛋白質(zhì)、多核苷酸、基因；或者在多核苷酸或多肽減少之前存在的蛋白質(zhì)的活性和/或濃度相比，提高至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過(guò)500%。VHb蛋白的活性也可通過(guò)使該蛋白與其活性的特異性或一般性抑制劑接觸來(lái)提高。術(shù)語(yǔ)〃過(guò)表達(dá)〃和〃提高的活性〃在本申請(qǐng)中可互換使用。表述〃調(diào)控序列〃通指啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)域、增強(qiáng)子，等等，它們共同提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。并不需要所有的這些調(diào)控序列總是存在于重組體載體中，只要所期望的基因能轉(zhuǎn)錄和翻譯即可。〃重組〃是指在兩個(gè)DNA或RNA分子之間DNA或RNA序列片段的再分配(reassortment)。〃同源重組〃發(fā)生在依靠各自DNA分子中存在的同源或互補(bǔ)核苷酸序列雜交的兩個(gè)DNA分子之間。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"或者"在嚴(yán)格條件下雜交"是指在該條件下探針會(huì)優(yōu)先與其靶亞序列雜交，而較少程度或者根本不與其它序列雜交。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)例如Southern雜交和Northern雜交的上下文中，〃嚴(yán)格雜交〃和〃嚴(yán)格雜交洗滌條件〃是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見(jiàn)Tssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbespartIchapter2Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,Elsevier,NewYork。一般而言，高嚴(yán)格雜交和洗漆條件選擇為比特異性序列在指定的離子強(qiáng)度和PH下的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低約5°C。Tm是在指定的離子強(qiáng)度和PH下50%的靶序列雜交至完美匹配的探針的溫度。非常嚴(yán)格條件選擇為等于針對(duì)具體探針的Tm。在Southern或Northern印跡中在濾紙上具有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的雜交的嚴(yán)格雜交條件的ー個(gè)實(shí)例是50%甲酰胺與Img肝素在42°C，其中雜交進(jìn)行過(guò)夜。高嚴(yán)格洗滌條件的ー個(gè)實(shí)例是0.15MNaCl，在72°C達(dá)約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的ー個(gè)實(shí)例是在65。C用0.2xSSC洗滌持續(xù)15分鐘(參見(jiàn)Sambrook等人，(1989)MolecularCloning—ALaboratoryManual(2nded.)Vol.1-3,ColdSpringHarbor·Laboratory,ColdSpringHarborPress,NY,就SSC緩沖液描述而言)。常常，在高嚴(yán)格洗滌之前進(jìn)行低嚴(yán)格洗滌以除去背景探針信號(hào)。用于例如超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體的中等嚴(yán)格洗滌的ー個(gè)實(shí)例是在45°C用IxSSC持續(xù)15分鐘。用于例如超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格洗滌的ー個(gè)實(shí)例是在40°C用4-6xSSC持續(xù)15分鐘。一般而言，在具體的雜交測(cè)定中觀察到相對(duì)于不相關(guān)探針的2x(或更高)的信噪比表明檢測(cè)到特異性雜交。如果核酸編碼的多肽是基本上相同的，那么在嚴(yán)格條件下未彼此雜交的核酸仍然是基本上相同的。這發(fā)生在例如，核酸的拷貝是使用遺傳編碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并產(chǎn)生的吋。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)格條件下，優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下，與本發(fā)明的多核苷酸雜交。本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)〃雜交〃意在描述用于雜交和洗滌的條件，在該條件下彼此至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優(yōu)選至少約80%、甚至更優(yōu)選至少約85%90%、最優(yōu)選至少95%同源的核苷酸序列通常保持彼此雜交。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸是與本申請(qǐng)所示的核酸序列或其互補(bǔ)物至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源的。嚴(yán)格雜交條件的另ー個(gè)非限制性實(shí)例是在約45°C在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后在lxSSC，0.1%SDS中在50°C、優(yōu)選在55°C、更優(yōu)選在60°C且甚至更優(yōu)選在65°C進(jìn)行一次或多次洗漆。高嚴(yán)格條件可包括使用標(biāo)記的DNA探針諸如地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針，在42°C溫育幾天諸如24天的時(shí)間，然后進(jìn)行一次或多次在2xSSC，0.1%SDS中在室溫的洗滌以及一次或多次在0.5xSSC,0.1%SDS或者0.IxSSC,0.1%SDS中在65-68。C的洗滌。具體地，高嚴(yán)格條件包括例如2小時(shí)至4天的在42°C的溫育，其中使用DIG標(biāo)記的DNA探針(例如通過(guò)使用DIG標(biāo)記系統(tǒng)制備；RocheDiagnosticsGmbH,68298Mannheim,Germany),在溶液諸如包含或者不含100ug/ml鮭精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)，或者包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaClU5mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二烷基硫酸鈉、0.1%N_月桂酰肌氨酸和2%封閉劑的溶液(RocheDiagnosticsGmbH)中，然后在2xSSC和0.1%SDS中在室溫洗滌濾紙兩次持續(xù)515分鐘，接著在0.5xSSC和0.1%SDS或者0.IxSSC和0.1%SDS中在65-68°C洗滌兩次持續(xù)1530分鐘。在一些實(shí)施方案中，在高嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核苷酸序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子可對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。本申請(qǐng)所用的"天然存在的"核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列(例如，編碼天然蛋白質(zhì))的RNA或DNA分子。技術(shù)人員會(huì)知道就嚴(yán)格和高嚴(yán)格雜交條件而言適用什么條件。關(guān)于所述條件的另外指導(dǎo)在本領(lǐng)域中是易于得到的，例如在Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;以及Ausubel等人，(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(Johnffiley&Sons,N.Y.)中。常規(guī)命名在本申請(qǐng)中用于描述多核苷酸序列單鏈多核苷酸序列的左手端是5'·端，雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱為5'方向。5'到3'添加核苷酸至新生RNA轉(zhuǎn)錄物的方向稱為轉(zhuǎn)錄方向。具有與mRNA相同的序列的DNA鏈稱為〃編碼鏈〃；在DNA鏈上具有與由該DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA相同的序列的并且位于RNA轉(zhuǎn)錄物的5'端的5'的序列稱為〃上游序列〃；在DNA鏈上具有與RNA相同的序列的并且位于編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的3'端的3'的序列稱為〃下游序列"。包含用于多殺菌素生物合成酶的基因的DNA的克隆片段使編碼在產(chǎn)生多殺菌素中的限速酶的基因得以復(fù)制。這可在編碼活性中的一種限制期望的多殺菌素合成的任一情形中用于提高產(chǎn)量。在與多殺菌素聚酮合成酶連鎖的基因通過(guò)將包含其的粘粒整合至刺糖多孢菌中得以復(fù)制時(shí)，觀察到多殺菌素A/D的產(chǎn)量提高(Madduri等人，2001)。在另ー實(shí)例中，這種類型的產(chǎn)量提高在新霉素鏈霉菌(Streptomycesfradiae)發(fā)酵中通過(guò)復(fù)制編碼將大菌素(macrocin)轉(zhuǎn)化成泰樂(lè)菌素(tylosin)的限速甲基轉(zhuǎn)移酶的基因得以實(shí)現(xiàn)(Baltz等人，1997)。特異性中間體(或其天然衍生物)可通過(guò)其中編碼用于多殺菌素生物合成的酶的某些基因已經(jīng)被破壞的刺糖多孢菌突變菌株合成。所述菌株可通過(guò)經(jīng)同源重組整合包含目標(biāo)基因的內(nèi)在片段的誘變質(zhì)粒產(chǎn)生。在質(zhì)粒整合后，形成生物合成基因的兩個(gè)不完全拷貝，由此消除其編碼的酶功能。該酶的底物或其ー些天然衍生物應(yīng)在突變菌株發(fā)酵時(shí)積聚。這樣的策略有效地用于生成產(chǎn)生新型6-去氧紅霉素衍生物的紅色糖多孢菌(Saccfiaropolysporaerythraea；菌株(Weber&McAlpine,1992)。所述菌株可通過(guò)下面方法生成經(jīng)雙交換同源重組將目標(biāo)區(qū)與包含在目標(biāo)區(qū)兩側(cè)的未突變序列之間的新片段的誘變質(zhì)粒進(jìn)行對(duì)換。該雜交基因可產(chǎn)生具有改變功能(缺乏活性或者從事新的酶轉(zhuǎn)化)的蛋白質(zhì)。新的衍生物可在突變菌株的發(fā)酵時(shí)積聚。這樣的策略已用于生成產(chǎn)生新型脫水紅霉素衍生物的紅色糖多孢菌菌株(Donadio等人，1993)?？寺《鄽⒕厣锖铣苫蚣跋嚓P(guān)的0RF,并確定各自的DNA序列?？寺〉幕蚝蚈RF在下文中指定為spnA、spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnl、spnj、spnK、spnL、spnM、spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、0RFL15>0RFL16、0RFR1、0RFR2、刺糖多抱菌gtt、刺糖多孢菌gdh、刺糖多孢菌epi和刺糖多孢菌kre。刺糖多孢菌產(chǎn)生9種緊密相關(guān)的化合物的混合物，通稱為“多殺菌素”。在該混合物中，多殺菌素A和D(稱為多殺霉素(spinsoad))是主要組分并且對(duì)關(guān)鍵昆蟲目標(biāo)具有最聞活性。多殺菌素J和し(多殺菌素混合物中的兩種次要組分)是こ基多殺菌素(spinetoram)(第二代多殺菌素殺蟲劑)的前體。多殺菌素(Spinosad)是DowAgroSciences(Indianapolis,Ind.)生產(chǎn)的殺蟲劑，其主要包含約85%多殺菌素A和約15%多殺菌素D。多殺菌素A和D是刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，如美國(guó)專利5，362，634中所披露。多殺菌素是幾種可從DowAgroSciences商購(gòu)的殺蟲制劑的活性成分，所述殺蟲制劑包括TRACER、SUCCESS、SPINT0R和CONSERVE昆蟲控制產(chǎn)品。例如，TRACER產(chǎn)品由約449T約48%的多殺菌素(w/v)或者約4磅多殺菌素/加侖構(gòu)成。呈顆粒和液體制劑形式的多殺菌素化合物對(duì)于控制蜘蛛、線蟲和昆蟲(具體為鱗翅目、纓翅目(Thysanopetera)和雙翅目物種)具有確定的效用。多殺菌素A和D在本申請(qǐng)中也稱為多殺菌素A/D。こ基多殺菌素是5，6-ニ氫-3'-こ氧基多殺菌素J(主要組分)和3'-こ氧基多殺菌素L的混合物,其由DowAgroSciences生產(chǎn)。該混合物可通過(guò)下面方法制備こ氧基化多殺菌素J和多殺菌素L的混合物，然后氫化。多殺菌素J及其3'-こ氧基衍生·物的5，6雙鍵的氫化比多殺菌素L及其3'-こ氧基衍生物的5，6雙鍵的氫化容易得多，這是由于在多殺菌素L及其3'-こ氧基衍生物中C-5的甲基的空間位阻。參見(jiàn)美國(guó)專利6，001，981。多殺菌素J和L在本申請(qǐng)中也稱為多殺菌素J/L。在本申請(qǐng)中已經(jīng)證實(shí)VHb的過(guò)表達(dá)在刺糖多孢菌中導(dǎo)致多殺菌素產(chǎn)生的提高。氧載體蛋白VHb的表達(dá)導(dǎo)致在含氧量低的生長(zhǎng)條件下同ニ聚體血紅蛋白水平的升高(Zhang等人，2007)。在血紅蛋白中，VHb具有平均的氧結(jié)合速率常數(shù)和相當(dāng)高的氧解離速率常數(shù)(高于其它血紅蛋白數(shù)百倍)。這表明VHb能比所有其它血紅蛋白更容易地釋放結(jié)合的氧(Zhang等人，2007)。已有顯示，透明顫菌屬血紅蛋白基因在異源宿主中的表達(dá)常常在氧有限條件下提高細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生(Khosla&Bailey，1988；Khosla等人，1990)。VHb在幾種放線菌(Actinomyces)菌株中的表達(dá)導(dǎo)致抗生素產(chǎn)生的提高，包括金霉素、莫能菌素、紅霉素和放線菌紫素(Zhang等人,2007;Magnolo等人，1991)。表達(dá)VHb的重組天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)菌株在低DO水平下(D0低于空氣飽和度的5%)比野生型菌株多產(chǎn)生十倍的放線菌紫素(Magnolo等人，1991)。此外，由表達(dá)VHb的重組菌株進(jìn)行的放線菌紫素產(chǎn)生較少受通氣條件影響。盡管紅霉素產(chǎn)生一般不被認(rèn)為是DO水平敏感的(只要該DO水平高于生長(zhǎng)所需的最低水平即可)，但是VHb在エ業(yè)上生產(chǎn)紅霉素的菌株中的表達(dá)顯著地提高了紅霉素滴度(從4.25g/L至7.25g/L)同時(shí)在10-15升規(guī)模的分批補(bǔ)料生物反應(yīng)器發(fā)酵條件下降低了生物質(zhì)積聚(Briinker等人，1997；1998；Minas等人，1998)。本發(fā)明的實(shí)施方案提供遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其含有整合至刺糖多孢菌基因組中的多殺菌素增強(qiáng)基因。所述增強(qiáng)基因可編碼氧結(jié)合蛋白。而且，該氧結(jié)合蛋白可以是任何與氧結(jié)合的蛋白質(zhì)，具體是那些與氧可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)諸如珠蛋白。優(yōu)選的氧結(jié)合蛋白是那些能在刺糖多孢菌中提高多殺菌素產(chǎn)生的氧結(jié)合蛋白?？捎糜诒景l(fā)明的氧結(jié)合蛋白包括但不限于透明顫菌屬血紅蛋白(VHb)、富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)黃素血紅素蛋白(fIavohemoprotein)、馬心肌紅蛋白、大腸桿菌血紅素蛋白、枯草芽孢桿菌血紅素蛋白、酵母黃素血紅蛋白、大豆豆血紅蛋白、羽扇豆豆血紅蛋白和抹香鯨肌紅蛋白。如上所指出，所述氧結(jié)合蛋白也可以是對(duì)于產(chǎn)生多殺菌素的生物體而言內(nèi)源性的氧結(jié)合蛋白。編碼多種多樣的氧結(jié)合蛋白的基因已經(jīng)被克隆并且它們的序列得到確定。例如，已知的可用于本發(fā)明的珠蛋白的多核苷酸序列包括但不限于那些編碼藍(lán)細(xì)菌肌紅蛋白(Potts等人，1992，Science256:1690-1692)、不等殼毛酣(Scapharcainaequivalvis)血紅蛋白(Gambacurta等人，1993，F(xiàn)EBSLett.330:90-94)、AplysiaIimacina肌紅蛋白(Cutruzzola等人，1996，Biochem.J.314:83-90)、蛔蟲(Ascaris)血紅蛋白(Sherman等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11696-11700)、偽新地線蟲(Pseudoterranovadecipiens)血紅蛋白(Dixon等人，1991，Natl.Acad.Sci.USA88:5655-5659和Dixon等人，1992，J.Mol.Evol.35:131-136)、尾草履蟲(Parameciumcaudatum)血紅蛋白(Yamauchi等人，1992，Biochem.Biophvs.Res.Commun.182:195-200)、苜猜根瘤菌(Rhizobiummeliloti)血紅素蛋白(David等人，1988，Cell54:671-683)以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(Shimada等人，1989，J.Biochem.105:417-422)的多核苷酸序列。尤其適用于本發(fā)明的是那些具有相對(duì)高的I^ff速率的氧結(jié)合蛋白諸如·有相對(duì)低的氧親和力的氧結(jié)合蛋白諸如馬心肌紅蛋白(KD0.79iiM;Wittenberg等人，1985，innitrogenfixationresearchprogress.H.J.Evand等人，Eds.MartinusNijhoffPublishers,Dordrecht,p.354)。因此,優(yōu)選的氧結(jié)合蛋白可以是那些針對(duì)氧的kf速率大于IOs'更優(yōu)選大于IOOs-1的蛋白質(zhì)，或者針對(duì)氧的Kd大于0.5iiM的蛋白質(zhì)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解速率常數(shù)在這些參數(shù)之外的氧結(jié)合蛋白也是可用的。如前面所指出，那些優(yōu)選的氧結(jié)合蛋白包括珠蛋白諸如血紅蛋白、肌紅蛋白和豆血紅蛋白。許多種氧結(jié)合蛋白(包括珠蛋白)的性質(zhì)在文獻(xiàn)中已有披露。此外，確定蛋白質(zhì)諸如珠蛋白的氧結(jié)合性質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，且無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可進(jìn)行。如前面所指出，一種用于本發(fā)明的這樣的氧結(jié)合蛋白是VHb(如本申請(qǐng)中通過(guò)實(shí)施例描述)。VHb基因的完整序列描述在美國(guó)專利5，049，493中。與氧結(jié)合的VHb突變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。突變體包括但不限于〃功能多態(tài)性"，在本申請(qǐng)中使用的〃功能多態(tài)性〃是指基因的堿基對(duì)序列的變化，該變化導(dǎo)致由該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性的定性或定量變化(例如，活性特異性的變化；活性水平的變化)。術(shù)語(yǔ)"功能多態(tài)性"包括突變、缺失和插入。一般而言，檢測(cè)感興趣的多態(tài)性的步驟可通過(guò)如下方法進(jìn)行從來(lái)源收集包含DNA的生物樣品，然后確定在該生物樣品中包含所感興趣的多態(tài)性的DNA的存在或缺失。確定編碼具體突變的DNA的存在或缺失可借助用合適的可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸探針和/或通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(該擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物然后可用標(biāo)記的寡核苷酸探針或者多種其它技術(shù)檢測(cè))進(jìn)行。多種不同的寡核苷酸探針測(cè)定形式是已知的，其可用于實(shí)施本發(fā)明。參見(jiàn)例如，Wahl等人的美國(guó)專利4，302，204;Falkow等人的美國(guó)專利4，358，535；Ranki等人的美國(guó)專利4，563,419;以及Stavrianopoulos等人的美國(guó)專利4，994,373。擴(kuò)增選定或目標(biāo)核酸序列可通過(guò)任何適宜方式進(jìn)行?？傮w參見(jiàn)Kwoh等人，Am.Biotechnol.Lab.8，14-25(1990)。適宜的擴(kuò)增技術(shù)的實(shí)例包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增(總體參見(jiàn)G.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,392-396(1992);G.Walker等人，NucleicAcidsRes.20，1691-1696(1992))、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(參見(jiàn)D.Kwoh等人，Proc.Natl.AcadSci.USA86,1173-1177(1989))、自動(dòng)維持序列復(fù)制(或〃3SR〃)(參見(jiàn)J.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，1874-1878(1990))、復(fù)制酶系統(tǒng)(參見(jiàn)P.Lizardi等人，BioTechnology6，1197-1202(1988))、基于核酸序列的擴(kuò)增(或"NASBA")(參見(jiàn)R.Lewis,GeneticEngineeringNews12(9)，I(1992))、修復(fù)鏈反應(yīng)(或〃RCR〃)(參見(jiàn)R.Lewis,supra)以及自返式DNA擴(kuò)增(或"BDA")(參見(jiàn)R.Lewis,supra)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通常是優(yōu)選的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可根據(jù)已知的技術(shù)進(jìn)行。例如參見(jiàn)美國(guó)專利4，683，195；4，683，202;4，800，159和4，965，188。一般而言，PCR涉及，首先針對(duì)待檢測(cè)特異性序列的每條鏈用一種寡核苷酸引物在雜交條件下處理核酸樣品(例如，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶存在下)，從而合成與各核酸鏈互補(bǔ)的各引物的延伸產(chǎn)物，其中各引物和與其雜交的特異性序列的各鏈?zhǔn)浅浞只パa(bǔ)的，從而由各引物合成的延伸產(chǎn)物當(dāng)與其互補(bǔ)物分離時(shí)可用作其它引物的延伸產(chǎn)物的合成用模板，然后如果存在待檢測(cè)的序列，則在變性條件下處理樣品以將引物延伸產(chǎn)物與其模板分離。這些步驟循環(huán)重復(fù)直至達(dá)到所期望的擴(kuò)增度。擴(kuò)增序列的檢·測(cè)可通過(guò)如下方法進(jìn)行向反應(yīng)產(chǎn)物中加入能與該反應(yīng)產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針(例如，本發(fā)明的寡核苷酸探針)，該探針攜帯可檢測(cè)的標(biāo)記，然后根據(jù)已知技術(shù)或者通過(guò)直接在凝膠上顯影檢測(cè)該標(biāo)簽。所述探針可以是5飛00個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選5250個(gè)，更優(yōu)選5100個(gè)或550個(gè)核酸。當(dāng)PCR條件允許所有的等位基因類型的擴(kuò)增時(shí)，所述類型可通過(guò)用等位基因特異性探針進(jìn)行雜交、通過(guò)限制內(nèi)切核酸酶消化、通過(guò)在變性梯度凝膠上電泳或者其它技術(shù)來(lái)區(qū)分。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)也可根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行。例如，參見(jiàn)R.Weiss,Science254，1292(1991)。一般而言,該反應(yīng)用兩對(duì)寡核苷酸探針進(jìn)行ー對(duì)與待檢測(cè)序列的一條鏈結(jié)合；另ー對(duì)與待檢測(cè)序列的另一條鏈結(jié)合。每對(duì)一起與其對(duì)應(yīng)的鏈完全重疊。該反應(yīng)如下進(jìn)行首先，變性(例如，分開)待檢測(cè)序列的各鏈，然后使各鏈與兩對(duì)寡核苷酸探針在熱穩(wěn)定的連接酶存在下反應(yīng)從而使各對(duì)寡核苷酸探針連接在一起，而后分離反應(yīng)產(chǎn)物，接著循環(huán)重復(fù)該過(guò)程直至序列擴(kuò)增至所期望的程度。然后檢測(cè)可與上面針對(duì)PCR描述類似的方式進(jìn)行。DNA擴(kuò)增技術(shù)諸如前述技術(shù)可涉及使用一個(gè)探針、一對(duì)探針或者兩對(duì)探針，所述探針與包含功能多態(tài)性的DNA特異性結(jié)合，但是不與不含功能多態(tài)性的DNA特異性結(jié)合。或者，所述探針或者探針對(duì)既可與包含又可與不包含功能多態(tài)性的DNA結(jié)合，但是產(chǎn)生或者擴(kuò)增其中可檢測(cè)差異可得到確定的產(chǎn)物(例如，延伸產(chǎn)物)(例如，較短產(chǎn)物，其中功能多態(tài)性是缺失突變)。所述探針可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由與VHb連鎖的基因中的或與所述基因相關(guān)的已知DNA序列或者由可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由所述基因產(chǎn)生的序列得到。會(huì)理解的是本申請(qǐng)所描述的檢測(cè)步驟可以直接或間接地進(jìn)行。間接測(cè)定等位基因類型的其它方式包括測(cè)量與具體的功能多態(tài)性相關(guān)聯(lián)的多態(tài)標(biāo)志，如VNTR(數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù))所示例說(shuō)明的。分子生物學(xué)包括分析核酸和蛋白質(zhì)序列的廣泛多樣的技術(shù)。這些技術(shù)和方法中的許多種構(gòu)成臨床診斷測(cè)定和試驗(yàn)的基礎(chǔ)。這些技術(shù)包括核酸雜交分析、限制酶分析、遺傳序列分析以及核酸和蛋白質(zhì)的分離和純化(參見(jiàn)，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2Ed.,ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)。這些技術(shù)中的大多數(shù)涉及對(duì)大量樣品進(jìn)行多個(gè)操作(例如，移液、離心和電泳)。它們常常是復(fù)雜和耗時(shí)的，并且通常要求高度的準(zhǔn)確性。多種技術(shù)因缺乏靈敏度、特異性或重現(xiàn)性而限制了其應(yīng)用。核酸雜交分析通常涉及用過(guò)量探針DNA在相對(duì)大量的復(fù)雜非祀核酸中檢測(cè)非常少量的特異性靶核酸(DNA或RNA)。樣品中核酸復(fù)雜性的降低有助于檢測(cè)低拷貝數(shù)(即10,000^100,000)的核酸靶標(biāo)。DNA復(fù)雜性的降低通過(guò)擴(kuò)增靶核酸序列在某種程度上得以實(shí)現(xiàn)。(參見(jiàn)M.A.Innis等人，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress,1990，Spargo等人，1996，Molecular&CellularProbes,關(guān)于SDA擴(kuò)增)。這是因?yàn)榘泻怂岬臄U(kuò)增導(dǎo)致靶核酸序列相對(duì)于非靶序列的巨大數(shù)量，從而改善后續(xù)的靶雜交步驟?！るs交步驟涉及將制備的DNA樣品與特異性報(bào)道探針在設(shè)定的對(duì)于靶DNA序列和探針之間發(fā)生雜交最優(yōu)的條件下接觸。雜交可以以多種形式中的任ー種進(jìn)行。例如，多祥品核酸雜交分析已經(jīng)以多種濾紙和固體支持物形式進(jìn)行(參見(jiàn)Beltz等人，MethodsinEnzymo丄ogy,Vol.100，Part等人，Eds.，AcademicPress,NewYorK,Chapter19，pp.266-308，1985)。ー種形式(所謂的“點(diǎn)印跡”雜交)涉及將靶DNA非共價(jià)連接至濾紙，然后后續(xù)雜交至放射性同位素標(biāo)記的探針。在過(guò)去二十年，"點(diǎn)印跡〃雜交得到廣泛應(yīng)用，在這段時(shí)間開發(fā)了多種版本(參見(jiàn)AndersonandYoung,inNucleicAcidHybridization-APracticalApproacn,HamesandHiggins,Eds.,IRLPress,Washington,D.C.Chapter4,pp.73-111，1985)。例如，點(diǎn)印跡方法得到發(fā)展用于基因組突變的多重分析(Nanibhushan等人的EPA0228075)以及用于檢測(cè)重疊克隆和構(gòu)建基因組圖譜(Evans的美國(guó)專利5，219，726)。進(jìn)行多祥品核酸雜交分析的另外技術(shù)包括微形式化多路或者矩陣裝置(例如，DNA芯片)(參見(jiàn)M.Barinaga,253Science,pp.1489，1991；ff.Bains,IOBio/Technology,pp.757-758，1992)。這些方法通常將特異性DNA序列連接到固體支持物的非常小的特異性區(qū)，諸如DNA芯片的微孔。這些雜交形式是常規(guī)的〃點(diǎn)印跡〃和〃夾心〃雜交系統(tǒng)的微量版。微形式化雜交可用于進(jìn)行〃通過(guò)雜交測(cè)序〃(SBH)(參見(jiàn)M.Barinaga,253Science,pp.1489，1991；ff.Bains,lOBio/Technology,pp.757-758，1992)。SBH使用所有可能的n_核苷酸寡聚物(n-聚體)來(lái)鑒定未知DNA樣品中的n-聚體，隨后通過(guò)算法分析進(jìn)行比對(duì)排列來(lái)產(chǎn)生DNA序列(參見(jiàn)Drmanac美國(guó)專利5，202，231)。存在兩種進(jìn)行SBH的形式。第一形式涉及在支持物上生成所有可能的n-聚體的陣列，其隨后用所有靶序列進(jìn)行雜交。第二種形式涉及將靶序列連接至支持物上，其隨后用可能的n_聚體探査。Southern(英國(guó)專利申請(qǐng)GB8810400,1988;E.M.Southern等人，13Genomics1008,1992)提議使用第一形式來(lái)分析或者測(cè)序DNAt5Southern使用PCR擴(kuò)增的基因組DNA鑒定出已知的單點(diǎn)突變。Southern還描述在用于SBH的固體支持物上合成寡核苷酸陣列的方法。Drmanac等人(260Science1649-1652,1993)使用第二形式來(lái)對(duì)幾種短的(116bp)DNA序列測(cè)序。將靶DNA與膜支持物連接(〃點(diǎn)印跡〃形式)。各濾紙用272標(biāo)記的10聚體和I聚體寡核苷酸順序地雜交。范圍廣泛的嚴(yán)格條件用于實(shí)現(xiàn)針對(duì)各種n-聚體探針的特異性雜交。使用0°(Tl6°C的溫度，洗滌時(shí)間從5分鐘至過(guò)夜不等。大多數(shù)探針需要在16°C的3小時(shí)的洗滌。濾紙必須暴露218小時(shí)以檢測(cè)雜交信號(hào)。一般而言，多種方法可用于檢測(cè)和分析雜交事件。取決于用于標(biāo)記DNA探針的報(bào)道基團(tuán)(熒光團(tuán)、酶、放射性同位素等)，檢測(cè)和分析以熒光、量熱、或放射自顯影方式進(jìn)行。通過(guò)觀察和測(cè)量發(fā)出的輻射諸如熒光輻射或顆粒發(fā)射，可得到關(guān)于雜交事件的信息。即使當(dāng)檢測(cè)方法具有非常高的固有靈敏度時(shí)，雜交事件的檢測(cè)由于非特異性結(jié)合物質(zhì)的背景存在而是困難的。因此，雜交事件的檢測(cè)依賴于如何能夠進(jìn)行特異性和靈敏性雜交。關(guān)于遺傳分析，已經(jīng)開發(fā)了幾種試圖提高特異性和靈敏度的方法。遺傳分析的ー種形式是以說(shuō)明單核酸多態(tài)性或("SNPs")為中心的分析。偏好使用SNP的因素是它們?cè)谌嘶蚪M中的高豐度(尤其與短串聯(lián)重復(fù)(STR)相比)，它們常常位于基因的編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)(其可影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者表達(dá)水平)，以及它們?cè)趶囊淮鷤鳌ぶ料乱淮鷷r(shí)的穩(wěn)定性(Landegren等人，GenomeResearch,Vol.8,pp.769-776，1998)。SNP定義為存在于兩個(gè)變體中并且最常見(jiàn)變體出現(xiàn)的機(jī)會(huì)小于99%的基因組中的任意位置。為了將SNP用作廣泛的遺傳標(biāo)志，能容易、快速、準(zhǔn)確、劃算地對(duì)它們進(jìn)行基因分型是關(guān)鍵。目前有多種技術(shù)可用于分型SNP(對(duì)于綜述,參見(jiàn)Landegren等人,GenomeResearch,Vol.8,pp.769-776,(1998)，所有這些都需要靶擴(kuò)增。它們包括直接測(cè)序(Carothers等人，BioTechniques,Vol.7,pp.494-499，1989)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Orita等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86，pp.2766-2770，1989)、等位基因特異性擴(kuò)增(Newton等人，NucleicAcidResearch,Vol.17,pp.2503-2516,1989)、限制消化(DayandHumphries,AnalyticalBiochemistry,Vol.222,pp.389-395，1994)、以及雜交測(cè)定。在其最基礎(chǔ)的形式中，雜交測(cè)定通過(guò)相對(duì)于匹配和錯(cuò)配的靶甄別短的寡核苷酸報(bào)道子而發(fā)揮作用。已經(jīng)開發(fā)了多種針對(duì)基礎(chǔ)方案的改編。這些包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(WuandWallace,Gene,Vol.76,pp.245-254，1989)和迷你測(cè)序(Syvanen等人，Genomics,Vol.8，pp.684-692，1990)。其它提高包括使用TaqDNA聚合酶的5’-核酸酶活性(Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88，pp.7276-7280，1991)、分子信標(biāo)(TyagiandKramer,NatureBiotechnology,Vol.14,pp.303-308,1996)、熱變性曲線(Howell等人，NatureBiotechnology,Vol.17,pp87-88，1999)和DNA"芯片〃(Wang等人，Science,Vol.280，pp.1077-1082，1998)?？捎糜趨^(qū)別SNP的另ー現(xiàn)象是源自多靶特異性探針與單一靶的雜交的核酸相互作用能或者喊基堆積能(參見(jiàn)R.Ornstein等人，〃AnOptimizedPotentialFunctionfortheCalculationofNucleicAcidInteractionEnergies,Biopolymers,Vol.17,2341-2360(1978)；J.NorbergandL.Nilsson,BiophysicalJournal,Vol.74,pp.394-402,(1998);以及J.Pieters等人，NucleicAcidResearch,Vol.17,no.12,pp.4551-4565(1989))。在本發(fā)明中以獨(dú)特形式使用該堿基堆積現(xiàn)象來(lái)提供高度敏感的Tm差異，從而允許直接檢測(cè)核酸樣品中的SNP。其它方法也已經(jīng)用于區(qū)分相關(guān)生物體中的核酸序列或者用于測(cè)序DNA。例如，Hogan等人的美國(guó)專利5，030，557披露單鏈靶核酸的ニ級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)除了受到〃探針〃寡核苷酸的影響之外還可受到結(jié)合〃輔助〃寡核苷酸的影響，導(dǎo)致探針與靶核酸之間顯示較高的Tm。然而，該應(yīng)用在其方法上限制于將雜交能僅用于改變自退火RNA鏈的ニ級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，其若未改變則往往阻礙探針雜交至靶。關(guān)于DNA測(cè)序，例如K.Khrapko等人，F(xiàn)ederationofEuropeanBiochemicalSocietiesLetters,Vol.256，no.I,2,pp.118-122(1989)披露了連續(xù)堆積雜交導(dǎo)致雙鏈體穩(wěn)定化。此外，J.Kieleczawa等人，Science,Vol.258,pp.1787-1791(1992)披露了使用六聚體的連續(xù)串來(lái)引發(fā)DNA合成，其中該連續(xù)串表現(xiàn)出使引發(fā)穩(wěn)定。類似地，L.Kotler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.90,pp.4241-4245,(1993)披露了在通過(guò)使用六聚體和五聚體寡核苷酸模塊的DNA測(cè)序反應(yīng)引發(fā)中的序列特異性。此外，S.Parinov等人，NucleicAcidResearch,Vol.24,no.15,pp.2998-3004,(1996)披露了將喊基堆積寡聚物用于與被動(dòng)DNA測(cè)序微芯片相關(guān)的DNA測(cè)序。此外，G.Yershov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93，pp.4913-4918(1996)披露了SBH中的堿基堆積能在被動(dòng)微芯片上的應(yīng)用。在Yershov的示例中，10-聚體DNA探針錨定在微芯片的表面上，并雜交至與另外的短探針結(jié)合的靶序列，其組合似乎穩(wěn)定了探針的結(jié)合。在該形式中，核酸序列的短片段可針對(duì)DNA測(cè)序得到闡明。Yershov還注意到在它們的系統(tǒng)中錯(cuò)配的去穩(wěn)定化作用因使用較短的探針·(例如，5-聚體)而提高。在DNA測(cè)序中使用上述短探針提供了沿著探査中的序列辨別錯(cuò)配存在的能力，而不是僅僅辨別在探針/靶雜交復(fù)合體的ー個(gè)具體位置處的單一錯(cuò)配的能力。使用較長(zhǎng)探針(例如，8-聚體、10-聚體和13-聚體寡聚物)就上述目的而言是較不實(shí)用的。在核酸分析中使用堿基堆積的方法學(xué)的其它實(shí)例包括Lane等人的美國(guó)專利5，770，365，其中披露了一種捕獲核酸的方法，該方法使用具有單鏈環(huán)和雙鏈區(qū)的單分子捕獲探針，所述探針與結(jié)合靶一起發(fā)揮作用從而通過(guò)堆積能穩(wěn)定化雙鏈體形成。核苷酸序列可便利地通過(guò)根據(jù)常規(guī)方法的位點(diǎn)定向誘變進(jìn)行修飾?；蛘撸塑账嵝蛄锌赏ㄟ^(guò)化學(xué)合成制備，包括但不限于通過(guò)使用寡核苷酸合成儀，其中寡核苷酸是基于期望的多肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)的，并且優(yōu)選地選擇那些在將生成該重組多肽的宿主細(xì)胞中偏好的密碼子。新型多殺菌素也可在產(chǎn)生多殺菌素的生物體中通過(guò)克隆基因的誘變以及突變基因取代其未突變的對(duì)應(yīng)物來(lái)產(chǎn)生。誘變可包括，例如1)酮還原酶、脫水酶或烯酰還原酶(KR、DH或ER)域的缺失或失活，從而將這些功能中的一種或多種阻斷并且該菌株產(chǎn)生具有帶雙鍵、輕基或麗基的內(nèi)酷核的多殺菌素(雙鍵、輕基或麗基不存在于多殺菌素A的核中)(參見(jiàn)Donadio等人，1993)；2)置換AT域從而將不同的羧酸引入內(nèi)酯核中(參見(jiàn)Ruan等人，1997)；3)將KR、DH或ER域加入現(xiàn)有的PKS模塊中，從而該菌株產(chǎn)生帶飽和鍵、羥基或雙鍵的內(nèi)酷核的多殺菌素(所述飽和鍵、輕基或雙鍵不存在于多殺菌素A的核中)；或者4)增加或減去完整的PKS模塊，從而該環(huán)狀內(nèi)酷核具有較多或較少的碳原子數(shù)。雜交PKS可通過(guò)用異源PKS裝載代替多殺菌素PKS裝載來(lái)生成。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利7，626，010。進(jìn)ー步注意到多殺菌素經(jīng)由修飾與多殺菌素內(nèi)酯主鏈相連的糖類，可包括鼠李糖和/或福樂(lè)糖胺部分的修飾或不同脫氧糖類的連接。西班牙的Salas小組證實(shí)了新型聚酮化合物可通過(guò)用不同糖分子取代現(xiàn)有的糖分子來(lái)產(chǎn)生。Rodriguez等人,J.Mol.MicrobiolBiotechnol.2000Jul;2(3):271-6。本申請(qǐng)下文中的實(shí)施例有助于示例說(shuō)明誘變用于產(chǎn)生具有修飾官能度的多殺菌素的用途。來(lái)自多殺菌素基因簇區(qū)的DNA可用作鑒定同源序列的雜交探針。因此，此處克隆的DNA可用于從刺糖多孢菌基因文庫(kù)中定位其它質(zhì)粒，其與此處描述的區(qū)重疊并且還包括來(lái)自刺糖多孢菌的基因組中相鄰區(qū)的先前未克隆DNA。此外，來(lái)自在此克隆的區(qū)的DNA可用于在其它生物體中鑒定不同但類似的序列。雜交探針通常是至少約20個(gè)堿基長(zhǎng)并且是經(jīng)標(biāo)記的以允許檢測(cè)。出于多種目的，可在本發(fā)明中使用多種誘變。它們包括但不限于定位誘變、隨機(jī)點(diǎn)誘變、同源重組、DNA改組或者其他遞歸突變方法、嵌合構(gòu)建、使用含尿嘧啶的模板的誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用帶缺ロ的雙鏈體DNA的誘變，等等，或者它們的任意組合。其他合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、使用修復(fù)缺失型宿主菌株的誘變、限制-選擇和限制-純化、缺失誘變、通過(guò)全基因合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)，等等。包括但不限于涉及嵌合構(gòu)建的誘變也包括在本發(fā)明中。在一種實(shí)施方案中，誘變可通過(guò)天然存在的分子或者改變或突變的天然存在分子的已知信息指導(dǎo)，包括但不限于測(cè)序、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)，等等。本申請(qǐng)中存在的文本和實(shí)例描述了這些方法。補(bǔ)充信息可參見(jiàn)·下面的出版物以及其中引用的參考文獻(xiàn)Ling等人，ApproachestoDNAmutagenesis:anoverview,AnalBiochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人，01igonucleotide-directedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethod,MethodsMol.Biol.57:369-374(1996);Smith，Invitromutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategiesandapplicationsofinvitromutagenesis,Science229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,Theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis,inNucleicAcids和MolecularBiology(Eckstein,F.andLilley,D.M.J.eds.,SpringerVerlag,Berlin)(1987);Kunkel，Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985)；Kunkel等人，Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection,MethodsinEnzymol.154,367-382(1987)；Bass等人，MutantTrprepressorswithnewDNA-bindingspecificities,Science242:240-245(1988)；MethodsinEnzymol.100:468-500(1983)；MethodsinEnzymol.154:329-350(1987)；ZolIer和Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesisusingM13_derivedvectors:anefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragment,NucleicAcidsRes.10:6487-6500(1982)；ZolIer和Smith，Oligonucleotide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包括質(zhì)粒，諸如，但不限于那些常用于放線菌屬中DNA操作的質(zhì)粒(例如pSET152、p0J260、pIJlOl、pJVUpSG5、pHJL302、pSAM2、pKC1250)。所述質(zhì)粒在Kieser等人，(“PracticalStreptomycesGeneics”，2000)中有披露。其他適宜的載體可包括質(zhì)粒，諸如那些能在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒(例如pBR322、ColEl、pSClOl、PACYC184、itVX、pRSET、pBAD(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)等)。所述質(zhì)粒被Sambrook披露(參見(jiàn)"MolecularCloning:ALaboratoryManual,果ニte,編者Sambrook,Fritsch,&Maniatis,ColdSpringHarborLaboratory,(1989)),并且許多這樣的載體是可商購(gòu)的。芽孢桿菌屬(Bacillus)質(zhì)粒包括pC194、pC221、pT127等，并被Gryczan披露(參見(jiàn):TheMolecularBiologyoftheBacilli,AcademicPress,NY(1982)，pp.307-329)。適宜的鏈霉菌屬(Streptomyces)質(zhì)粒包括plilOl(Kendall等人，J.Bacteriol.169:4177-4183，1987)，并且鏈霉菌卩遼菌體包括但不限于諸如VC31(Chater等人，參見(jiàn)SixthInternationalsymposiumonActmomycetalesBiology,AkademiaiKaido,Budapest,Hungary(I986),pp.45-54)。假單胞菌屬(Pseudomonas)質(zhì)粒由John等人綜述(Rev.Infect.Dis.8:693-704，1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33:729-742，1978)。特定基因表達(dá)的抑制對(duì)于研究以及對(duì)于開發(fā)更適于具體目的的遺傳工程化生物體是ー種重要的手段?；虺聊扇缦聦?shí)現(xiàn)引入對(duì)應(yīng)于感興趣基因的轉(zhuǎn)基因，以相對(duì)于其啟動(dòng)子的反義方向(參見(jiàn)，例如，Sheehy等人，Proc.Nat'IAcad.Sci.USA85:88058808(1988);Smith等人，Nature334:724726(1988))，或者以相對(duì)于其啟動(dòng)子的·正義方向(Napoli等人，PlantCell2:279289(1990)；vanderKrol等人，PlantCell2:291299(1990);美國(guó)專利5，034，323;美國(guó)專利5，231，020以及美國(guó)專利5，283，184)，這二者都導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因以及內(nèi)源基因的表達(dá)降低。轉(zhuǎn)錄后基因沉默已經(jīng)被報(bào)道伴隨著反義RNA的小(2(T25個(gè)核苷酸)片段的積聚，其可由RA模板合成并代表該過(guò)程的特異性和移動(dòng)性決定子(Hamilton&Baulcombe,Science286:950952(1999))。已經(jīng)變得清楚的是，在一定范圍的生物體中引入dsRNA(雙鏈RNA)是導(dǎo)致基因沉默的重要組分(Fire等人，Nature391:806811(1998)；Timmons&Fire,Nature395:854(1998)；W099/32619；Kennerdell&Carthew,Cell95:10171026(1998)；Ngo等人，Proc.Nat'IAcad.Sci.USA95:1468714692(1998);Waterhouse等人，Proc.Nat'IAcad.Sci.USA95:1395913964(1998)；W099/53050；Cogoni&Macino,Nature399:166169(1999)；Lohmann等人，Dev.Biol.214:211214(1999)；Sanchez-Alvarado&Newmark,Proc.Nat;IAcad.Sci.USA96:50495054(1999))。在細(xì)菌中，受抑制的基因無(wú)需是內(nèi)源細(xì)菌基因，因?yàn)閳?bào)道轉(zhuǎn)基因和病毒基因二者均受到引入的轉(zhuǎn)基因造成的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(English等人，PlantCell8:179188(1996);Waterhouse等人，同上)。然而，在所有的上述情形中，在引入的轉(zhuǎn)基因與受到抑制的基因之間一定的序列相似性可能是優(yōu)選的。下面闡述實(shí)施例以示例說(shuō)明本發(fā)明，并且不理解為對(duì)其的限制。實(shí)施例構(gòu)建血紅蛋白基因表達(dá)盒血紅蛋白基因表達(dá)盒設(shè)計(jì)為包含下述關(guān)鍵特征i)在刺糖多孢菌中有功能的阿泊拉霉素耐受基因(最初來(lái)自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae),GenBank登記號(hào)X99313;KieSer等人，2001)啟動(dòng)子(aac3(IV)啟動(dòng)子)；ii)密碼子優(yōu)化的透明顫菌屬血紅蛋白基因VHb(表I)，其使用刺糖多孢菌密碼子優(yōu)選表和GeneDesigner軟件(DNA2.0,MenloPark,California)設(shè)計(jì)；以及iii)aph轉(zhuǎn)錄終止子序列(Pulido和Jimenez,1987)。這些基因元件的選擇和排列確保穩(wěn)定的VHb轉(zhuǎn)錄和最優(yōu)的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而提供血紅蛋白的魯棒表達(dá)。血紅蛋白基因表達(dá)盒(SEQIDNO:I)由DNA2.O(MenloPark,CA)合成。將所得的977bp合成的側(cè)翼為HinDIII的片段克隆至pJ201載體(圖I)中，由DNA2.0測(cè)序以在出貨之前確認(rèn)序列準(zhǔn)確性。得到的質(zhì)粒指定為pDAB109000。表I:對(duì)于在刺糖多孢菌中的最優(yōu)表達(dá)，比較透明顫菌屬血紅蛋白基因(VHb)密碼子與合成血紅蛋白基因優(yōu)選密碼子。合成VHb密碼子在刺糖多孢菌中是優(yōu)選的，并選擇其用于代替來(lái)自透明顫菌屬血紅蛋白基因的優(yōu)選密碼子，其中使用GeneDesigner軟件。氨基酸LeuAr^ThrHeLysAlaVaIProHis透明顫菌屬VHh密碼子TTACGTACCATTAAAGCCGTTCCTCATTTGCGCACT__GCTGTACCA一GCAGTC·----------合成VHb密碼子CTGCGGACGATCAAGGCGGTGCCGCAC氨基酸AspGlySerAsnCysPheGlnGluTyr透明顫菌屬VHb密碼子GATGGTTCTAATTGTTTTCAAGAATAT合成VHb密碼子GACGGCTCGAACTGCTTCCAGGAGTAC將血紅蛋白基因表達(dá)盒引入粘?？寺?E3中選擇遮蔽蛋白(obscurin)基因簇作為血紅蛋白基因表達(dá)盒整合的位點(diǎn)，因?yàn)檎诒蔚鞍谆蜃宓钠茐牟粶p少多殺菌素的廣生。將血紅蛋白基因表達(dá)盒克隆至粘粒1E3(其包含基因組DNA部分遮蔽蛋白基因簇)中。將該粘粒工程化以促進(jìn)血紅蛋白基因表達(dá)盒在刺糖多孢菌基因組的遮蔽蛋白基因簇中的穩(wěn)定整合。將血紅蛋白基因表達(dá)盒首先經(jīng)常規(guī)克隆方法克隆至載體pIJ773(JohnInnesCentre,Norwich,UK)中。除了阿泊拉霉素耐受基因和以FRT重組序列為側(cè)翼的oriT之外，然后還經(jīng)PCR尋靶將該表達(dá)盒克隆至粘粒1E3中(Gust等人，2002)。簡(jiǎn)而言之，血紅蛋白基因表達(dá)盒首先通過(guò)使用pDAB109000作為模板和如下引物即aac3-VHb正向(SEQIDN0:25’-CGCTGAAAAGCTTCTGACGCCG-3’)和aac3_VHb反向(SEQIDNO:35’-CAACCCGTACCACGGCCTCT-3’)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR片段用Hindi11/KpnI消化產(chǎn)生兩個(gè)片段864bpHindlll/Kpnl片段和83bpHindIII/KpnI片段。凝膠純化攜帶包括轉(zhuǎn)錄終止子的血紅蛋白基因表達(dá)盒的864bpHindlll/Kpnl片段，并將其克隆至已經(jīng)用HindIII/KpnI消化的載體pIJ773中。選擇生長(zhǎng)在含50ug/mL阿泊拉霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)上的總共38個(gè)轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一歩分析和確認(rèn)。在含有50i!g/mL阿泊拉霉素的液體LB中過(guò)夜生長(zhǎng)之后，通過(guò)在微量離心機(jī)中13，000RPM離心2分鐘收獲細(xì)胞。攜帶對(duì)照質(zhì)粒pDAB109000的細(xì)胞沉淀略帶紅色,這表明存在血紅蛋白。然而,重組克隆中僅7個(gè)產(chǎn)生可見(jiàn)的微紅色細(xì)胞沉淀，呈淺紅色至較深的紅色。選擇這7個(gè)克隆并推進(jìn)至下一歩，該步驟包括質(zhì)粒DNA分離和限制酶消化。基于使用下列酶Ndel、HindIII/KpnI和Ndel/Kpnl的限制酶分析，這7個(gè)克隆中的兩個(gè)(克隆22和克隆30)產(chǎn)生了期望的限制酶切樣式。對(duì)這兩個(gè)克隆的血紅蛋白基因區(qū)和攜帯該血紅蛋白基因表達(dá)盒的PCR片段進(jìn)行測(cè)序。對(duì)克隆22的血紅蛋白基因區(qū)和所述PCR片段進(jìn)行完全測(cè)序，序列數(shù)據(jù)確認(rèn)了所期望的合成血紅蛋白基因無(wú)任何錯(cuò)誤地得到擴(kuò)增并且克隆至pIJ773(圖2)中。所得的質(zhì)粒標(biāo)記為PDAB109001。將FRT::aac3(IV)基因表達(dá)盒oriT::FRT::合成血紅蛋白基因表達(dá)盒整合至粘粒克隆1E3中如所述那樣通過(guò)改進(jìn)的PCR尋靶方案進(jìn)行(Gust等人，2002)。將下述改進(jìn)引入該方案中i)用于引入攜帯血紅蛋白基因表達(dá)盒的重組粘粒克隆的宿主大腸桿菌是大腸桿菌BW25141/pKD78，其從耶魯大學(xué)的TheColiGeneticStockCenter(CGSC)獲得；ii)入紅色重組酶表達(dá)質(zhì)粒pKD78,其源于pKD46(DatsenkoandWanner,2000);以及iii)設(shè)計(jì)和使用了下面的PCR引物，即obsAInternalStr印莖環(huán)(SEQIDNO:45，-GAAGAAGGCGGCGTCGAACTGGTCGACCTCGGTGAGGAAGGTACCTCCGACCGCACGGC-3，)和obsA5，F(xiàn)RTaac3(SEQIDNO:55’-GGCAATGCGCAGAGTTCGTAGTGCGGGAGCCATTTGATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，)。所得的擴(kuò)增在粘?？寺?E3中產(chǎn)生了由(FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb)組成的2216bp片段。將在粘?？寺?E3內(nèi)的整合設(shè)計(jì)為發(fā)生在obsA的5’端，導(dǎo)致600bp的obsA編碼序列的除去。這確保了在遮蔽蛋白基因簇內(nèi)第一聚酮合成酶的完全破壞。一旦整合，則血·紅蛋白基因表達(dá)盒就以這樣的方式定向，即其編碼序列與obsA編碼序列的取向相反。該方向性避免了從推定的obsA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄通讀，所述轉(zhuǎn)錄通讀可能潛在地導(dǎo)致不期望的轉(zhuǎn)錄。將攜帶所述(FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb)片段的推定重組克隆分離并通過(guò)限制分析確認(rèn)。用BamHI的限制消化表明與親代粘?？寺?E3相比，攜帯血紅蛋白基因盒的重組粘粒克隆具有不同的限制酶樣式。此外，意在再生合成血紅蛋白基因編碼序列的使用NdeI和ClaI的限制消化顯示，僅僅三個(gè)重組克隆產(chǎn)生了攜帯合成血紅蛋白基因的完整編碼區(qū)的444bp片段。將(FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb)基因表達(dá)盒接合至刺糖多孢菌菌株中完成了供體菌株大腸桿菌S17(其在粘粒1E3中包含F(xiàn)RT::aac3(IV)基因表達(dá)盒oriT::FRT::合成血紅蛋白基因表達(dá)盒)和多殺菌素產(chǎn)生菌株DAS-2之間的菌絲體接合。供體菌株和受體刺糖多孢菌菌株之間的菌絲體接合根據(jù)Matsushima等人，(1994)所述的方法進(jìn)行。將起初在接合培養(yǎng)基上鑒定為阿泊拉霉素和萘啶酸抗性的菌落貼至含50iig/mL阿泊拉霉素和25iig/mL萘唳酸的BrainHeartInfusion瓊脂培養(yǎng)基(BHI)上，以確認(rèn)菌落的抗生素抗性表型。將具有期望的抗生素抗性表型的菌落認(rèn)為是包含整合至遮蔽蛋白基因簇的obsA基因座內(nèi)的FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb盒。為了確認(rèn)存在阿泊拉霉素抗性基因aac3(IV)，使用PURELUTE細(xì)菌基因組試劑盒(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)根據(jù)制造商的說(shuō)明分離出推定轉(zhuǎn)接合子的基因組DNA。將該基因組DNA(gDNA)用作模板以供使用FAILSAFEPCR系統(tǒng)(EpicentreBiotechnologies,Madison,WI)的對(duì)785bpaac3(IV)DNA片段的PCR擴(kuò)增大小確認(rèn)。確認(rèn)在轉(zhuǎn)接合子中存在血紅蛋白基因?yàn)榱舜_認(rèn)合成血紅蛋白基因存在于轉(zhuǎn)接合子中，分離出選定數(shù)量的轉(zhuǎn)接合子的基因組DNA(通過(guò)PURELUTE細(xì)菌基因組試劑盒)并將其用作PCR擴(kuò)增血紅蛋白基因的模板(通過(guò)FAILSAFEPCR系統(tǒng))。重組菌株產(chǎn)生了395bp的PCR產(chǎn)物，對(duì)應(yīng)于意圖進(jìn)行擴(kuò)增的血紅蛋白基因編碼區(qū)的大小。將PCR片段純化和完成兩條鏈的DNA測(cè)序，從而進(jìn)一步確認(rèn)存在VHb基因。源于該P(yáng)CR片段的序列與由DNA2.0合成的合成血紅蛋白基因序列的比對(duì)表明這些重組菌株攜帯具有與設(shè)計(jì)的DNA序列相同的序列的血紅蛋白基因。在發(fā)酵條件下的血紅蛋白基因表達(dá)確定在發(fā)酵條件下合成血紅蛋白基因在攜帯所述血紅蛋白基因表達(dá)盒的重組菌株中的表達(dá)。將包含VHb表達(dá)盒的重組菌株在搖瓶發(fā)酵條件下培養(yǎng)，并將相應(yīng)的全RNA樣品通過(guò)RIB0PURE細(xì)菌試劑盒(Ambion，Austin,TX)分離并制備以供作為RT-PCR測(cè)定的模板使用。雙交換突變體的發(fā)酵在Burns等人，(W02003070908)所述條件下進(jìn)行。就多殺菌素因子的存在對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行的分析在Baltz等人(美國(guó)專利6，143，526)所述條件下進(jìn)行。為了確認(rèn)在上清液中存在多殺菌素因子，將發(fā)酵培養(yǎng)液的提取物在SpeedVac中過(guò)夜干燥沉降(drydown)，然后使殘余物在水和醚之間分配。醚層通過(guò)在N2流下蒸發(fā)干燥。然后將樣品溶于丙酮-d6中并轉(zhuǎn)移至NMR管用于ID質(zhì)子NMR采集。將NMR譜與多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)行比較。在根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行RNA提純之后,立即用DNaseI(Ambion,Austin,TX)·處理總RNA制備物。使用分離出的總RNA進(jìn)行的對(duì)合成血紅蛋白基因的RT-PCR，利用OneStepRT-PCR試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)根據(jù)制造商的指示進(jìn)行。用于擴(kuò)增合成血紅蛋白基因編碼區(qū)的引物為SynHemo正向(SEQIDN0:65’-CAGACGATCAACATCATCAAGGCG_3’)和SynHemo反向(SEQIDNO:75，-ACCTGGATGAACACGTCCGC-3’)。包含VHb表達(dá)盒的重組菌株產(chǎn)生了395bp的特異性片段，該片段對(duì)應(yīng)于意圖擴(kuò)增的血紅蛋白基因編碼區(qū)。在相同的測(cè)定中，從非重組體對(duì)照菌株中分離出的總RNA不產(chǎn)生在大小上對(duì)應(yīng)于合成血紅蛋白基因的PCR片段。這些結(jié)果確認(rèn)了合成血紅蛋白基因(其為阿泊拉霉素抗性基因啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng))在刺糖多孢菌中在發(fā)酵條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。血紅蛋白基因表達(dá)對(duì)多殺菌素產(chǎn)生的作用血紅蛋白基因表達(dá)對(duì)多殺菌素(A/D)產(chǎn)生的影響通過(guò)如上所述在搖瓶發(fā)酵條件下培養(yǎng)重組菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)。將發(fā)酵結(jié)果與在各自的親本菌株(其不攜帶血紅蛋白基因)中產(chǎn)生的多殺菌素A/D水平比較。選擇用于在搖瓶中進(jìn)行評(píng)價(jià)的重組菌株的數(shù)目基于可用于測(cè)試的轉(zhuǎn)接合子數(shù)以及獲得可確定合成血紅蛋白基因的表達(dá)是否導(dǎo)致多殺菌素A/D水平提高的數(shù)據(jù)的愿望。測(cè)試了七個(gè)源于DAS-2的重組菌株。所有這七個(gè)在多殺菌素產(chǎn)生方面都勝過(guò)親本菌株DAS-2。親本菌株在預(yù)期的范圍內(nèi)積聚多殺菌素。對(duì)于包含VHb基因的菌株，多殺菌素A/D產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)顯著提高在4.69^12.9%范圍內(nèi)(表2)。在搖瓶發(fā)酵條件下的多殺菌素產(chǎn)生中重組菌株之間在勝過(guò)對(duì)照菌株方面的一致性導(dǎo)致多殺菌素A/D滴度的顯著的百分比提聞。這種多殺菌素滴度的提聞表明由于在基因組中存在合成血紅蛋白基因，重組菌株在整體上獲得了增強(qiáng)的多殺菌素產(chǎn)生能力。合成血紅蛋白基因在搖瓶發(fā)酵條件下的表達(dá)表明血紅蛋白基因表達(dá)提聞了多殺菌素廣生。表2DAS-2和包含染色體整合的VHb基因的DAS_2VHb重組菌株在多殺菌素產(chǎn)生方面的比較。權(quán)利要求1.一種將多殺菌素滴度提高至少4.6%的方法，包括a)將氧結(jié)合蛋白整合至多殺菌素產(chǎn)生菌株中。2.權(quán)利要求I的方法，其中所述氧結(jié)合蛋白是透明顫菌血紅蛋白或其機(jī)能性多態(tài)。3.一種提高多殺菌素產(chǎn)生的方法，該方法包括a)在適于多殺菌素產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)多殺菌素產(chǎn)生生物，所述多殺菌素產(chǎn)生生物表達(dá)編碼氧結(jié)合蛋白的異源基因；以及b)從表達(dá)編碼氧結(jié)合蛋白的異源基因的多殺菌素產(chǎn)生生物的培養(yǎng)物中收集多殺菌素。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述異源基因是整合至細(xì)胞染色體中的。5.將氧結(jié)合蛋白整合至刺糖多孢菌菌種的菌株的染色體DNA中的方法，其包括下述步驟a)創(chuàng)建噬菌體文庫(kù)以鑒定基因組基因座；b)從所述基因組基因座中克隆兩個(gè)基因組DNA片段，其中將一個(gè)基因組片段克隆至多核苷酸的上游，第二基因組片段克隆至所述多核苷酸的下游；c)通過(guò)轉(zhuǎn)化將所述基因組片段引入刺糖多孢菌的菌株；d)得到轉(zhuǎn)接合子；以及e)對(duì)所述轉(zhuǎn)接合子就所述多核苷酸的存在進(jìn)行篩選。6.權(quán)利要求5的方法,其中所述多核苷酸含有基因表達(dá)盒。7.權(quán)利要求6的基因表達(dá)盒，其中所述基因表達(dá)盒含有抗生素選擇標(biāo)志。8.權(quán)利要求6的基因表達(dá)盒，其中所述基因表達(dá)盒含有多殺囷素增強(qiáng)基因表達(dá)盒。9.權(quán)利要求5的方法，其中選擇的染色體DNA是遮蔽蛋白聚酮合成酶簇。10.一種多殺菌素產(chǎn)生生物，其中所述生物還表達(dá)異源氧結(jié)合蛋白。11.權(quán)利要求1、3或10的方法或生物，其中所述生物是刺糖多孢菌。12.權(quán)利要求1、5或10的方法或生物，其中所述氧結(jié)合蛋白是珠蛋白。13.權(quán)利要求12的方法或生物，其中所述珠蛋白選自下組透明顫菌屬(Vitreoscilla)血紅蛋白、富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)黃素血紅蛋白、馬心肌紅蛋白、大腸桿菌血紅素蛋白、枯草芽孢桿菌血紅素蛋白、酵母黃素血紅蛋白、大豆豆血紅蛋白、羽扇豆豆血紅蛋白和抹香鯨肌紅蛋白，或者它們的功能等價(jià)物。14.權(quán)利要求1、5或10的方法或生物，其中所述多殺菌素選自下組多殺菌素A+D、多殺菌素J+L、多殺菌素A和多殺菌素J。15.權(quán)利要求12的方法或生物，其中所述珠蛋白是透明顫菌屬血紅蛋白或其功能多態(tài)性。全文摘要本發(fā)明涉及用氧結(jié)合蛋白提高多殺菌素產(chǎn)生。本發(fā)明描述了將多核苷酸整合至可用于產(chǎn)生殺蟲劑的刺糖多孢菌(S.spinosa)菌種的染色體DNA中，其整合體，以及該整合體的用途。本發(fā)明包括氧結(jié)合蛋白VHb的穩(wěn)定整合和表達(dá)，所述穩(wěn)定整合和表達(dá)導(dǎo)致提高的多殺菌素產(chǎn)生。文檔編號(hào)C12N15/29GK102787152SQ20121013542公開日2012年11月21日申請(qǐng)日期2012年5月3日優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日發(fā)明者N.芒塞,韓蕾申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司