專利名稱：新型抗cd98抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與來自癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體的CD98具有特異性結(jié)合能力的單克隆抗體、以及使用該抗體的腫瘤生長(zhǎng)抑制或癌癥治療的藥物用途。
背景技術(shù)：
癌癥(惡性腫瘤)在日本占死亡原因的第一位。其患者數(shù)目逐年增加，強(qiáng)烈需求有效性和安全性高的藥物或治療方法的開發(fā)。目前的抗癌藥常常是特異性殺死癌細(xì)胞的能力低，也作用于正常的細(xì)胞，引起較多的藥物有害反應(yīng)。近年來，以在癌細(xì)胞中高表達(dá)的分子(癌相關(guān)抗原)為靶的抗癌藥物的開發(fā)得到進(jìn)展，在白血病、乳癌、肺癌等中成為有效的治療手段。與在細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的癌相關(guān)抗原特異性結(jié)合的抗體經(jīng)由抗體依賴性細(xì)胞毒活性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(CDC)等介導(dǎo)的免疫反應(yīng)攻擊癌細(xì)胞，或者抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)傳遞，對(duì)癌癥治療有效。但是，抗體可在治療中涉及的癌癥種類僅限于乳癌、難治性慢性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病等的癌癥種類,另外,一種抗體可以應(yīng)用于多種癌癥種類治療的抗體尚未出現(xiàn)。因此，人們需求可以與多種癌細(xì)胞強(qiáng)烈結(jié)合、具有抗癌活性的抗體的獲得。⑶98 (4F2)是已知在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)的、含有529個(gè)氨基酸殘基、約80kDa的II型跨膜糖蛋白鏈。CD98通過二硫鍵與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的約40kDa的蛋白質(zhì)形成異源二聚體，在細(xì)胞膜上表達(dá)。作為可能與⑶98結(jié)合的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已知有6種。⑶98鑒定為淋巴細(xì)胞的活化抗原，與細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)傳遞、整聯(lián)蛋白的活化、細(xì)胞融合等很多生物學(xué)功能有關(guān)(Haynes B. F.等人.，J. Immunol.，(1981)，126，1409 1414 ;Lindsten T.等人 ，Mol. Cell Biol.，(1988)，8，3820 3826 ;Teixeira S.等人 ，Eur. J. Biochem.，(1991)，202,819 826 ;L. A. Diaz Jr.等人.，J Biol Regul Homeost Agents, (1998) 12, 25 32)。癌細(xì)胞為了確保生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)而具有各種機(jī)理。例如，癌細(xì)胞為了比周圍細(xì)胞優(yōu)先攝入生長(zhǎng)所必要的必需氨基酸而過量表達(dá)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即是其中一種。近年來，在癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(LATl)已得到克隆(Kanai 等人 ，J. Biol. Chem. (1998)，273，23629 23632)。LATl 與 CD98 形成復(fù)合體，鈉離子非依賴性地轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸等具有大型的支鏈的中性氨基酸。還已知LATl在除腦、胎盤、骨髓、睪丸之外的幾乎所有正常組織中雖然表達(dá)低或未見表達(dá)，但在結(jié)腸直腸癌、胃癌、乳癌、胰腺癌、腎癌、喉頭癌、食道癌、肺癌等人惡性腫瘤組織中與⑶98 —起表達(dá)允進(jìn)(Yanagida等人 ，Biochem. Biophys. Acta,(2001)，1514，291 302)。如果降低LATl的表達(dá)、抑制氨基酸的攝入，則可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，這在癌癥移植小鼠模型中有報(bào)道(日本特開2000-157286號(hào)公報(bào))，可以認(rèn)為抑制LATl的活性有望作為癌癥的治療方法。關(guān)于人⑶98的抗體，報(bào)道的有通過將人⑶98表達(dá)細(xì)胞株免疫小鼠等非人哺乳 動(dòng)物而制備的小鼠單克隆抗體(上述文獻(xiàn)Haynes等人，Masuko T.等人.，Cancer Res.,(1986)，46，1478 1484，以及 Freidman AW 等人.，Cell. Immunol.，(1994)，154,253 263)。但是，這些抗⑶98抗體是否抑制LATl的氨基酸攝取則尚未所知。并且，LATl的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的抗體雖已獲得，但是可以與活細(xì)胞膜上的LATl結(jié)合的抗體尚未見報(bào)道。因此，如果可以獲得與在癌細(xì)胞膜上表達(dá)的CD98或LATl結(jié)合、抑制LATl的氨基酸攝取的抗體，則可以得到廣范圍的癌癥的優(yōu)異的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等成功地獲得了與CD98具有特異性結(jié)合能力的抗體，該CD98來自癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。該抗體具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，因此利用該性質(zhì)，可用作藥物組合物的有效成分，更具體地說，可用作腫瘤的預(yù)防或治療藥的有效成分。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)完成。本發(fā)明的目的在于提供與CD98具有特異性結(jié)合能力的人抗體及其功能性片段，其中，該CD98來自癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。本發(fā)明的目的還在于提供以上述本發(fā)明的人抗體及其功能性片段作為有效成分的藥物組合物或腫瘤的預(yù)防或治療藥。本發(fā)明的人抗體及其功能性片段的特征在于與CD98具有特異性結(jié)合能力，其中，該CD98來自癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。本發(fā)明的藥物組合物或腫瘤的預(yù)防或治療藥含有上述本發(fā)明的人抗體或其功能性片段作為有效成分。附圖簡(jiǎn)述圖I是表示人抗⑶98單克隆抗體與表達(dá)人⑶98/人LATl的CT26細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖2A是表示人抗⑶98單克隆抗體與表達(dá)人⑶98的L929細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖2B是表示人抗⑶98單克隆抗體與表達(dá)人⑶98的L929細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖3是表示人抗⑶98單克隆抗體與經(jīng)衣霉素處理的K562人細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖4A是表示人抗⑶98單克隆抗體與表達(dá)各種小鼠、人嵌合體⑶98的L929細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖4B是表示人抗⑶98單克隆抗體與表達(dá)各種小鼠、人嵌合體⑶98的L929細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖5是表示人抗CD98單克隆抗體對(duì)抑制T24人膀胱癌細(xì)胞株的氨基酸攝取的活性的圖。圖6A是表示人抗CD98單克隆抗體與人末梢血T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞的結(jié)合性的圖。圖6B是表示人抗CD98單克隆抗體與人末梢血T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞的結(jié)合性的圖。圖7是表示人抗⑶98單克隆抗體與PHA活化人末梢血T細(xì)胞、B細(xì)胞的結(jié)合性的圖。圖8是表示人抗CD98單克隆抗體與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株(DLD-I)的結(jié)合性的圖。圖9A是表示人抗CD98單克隆抗體與各種癌細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖9B是表示人抗CD98單克隆抗體與各種癌細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖IOA是表示人抗CD98單克隆抗體與各種癌細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。圖IOB是表示人抗CD98單克隆抗體與各種癌細(xì)胞株的結(jié)合性的圖。

圖11是表示將人抗CD98單克隆抗體K3、3-69_6、C2IgGl給予移植了腫瘤細(xì)胞的裸小鼠時(shí)各小鼠中的腫瘤塊的大小的圖。圖12是表示對(duì)具有生長(zhǎng)至90mm3的腫瘤的擔(dān)癌小鼠以100 U g/小鼠個(gè)體隔日給予三次人抗CD98單克隆抗體C2IgGl時(shí)測(cè)定腫瘤大小的結(jié)果的圖。圖13是表示人抗CD98單克隆抗體K3、C2IgGl與猴細(xì)胞株C0S-7的交叉反應(yīng)性的圖。圖14是表示在移植了伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Ramos的擔(dān)癌小鼠中，在腫瘤生長(zhǎng)至30 140mm3之后分別以IOOmg/小鼠個(gè)體、以3次/周給予人抗⑶98單克隆抗體C2IgGl和利妥昔單抗時(shí)測(cè)定腫瘤大小的結(jié)果的圖。圖15是表示通過HPLC測(cè)定的、人抗⑶98單克隆抗體C2IgGlNS氨基酸修飾抗體的純化后的聚集物含有率的圖。圖16A是表示人抗CD98單克隆抗體K3和C2IgGl、以及C2IgGl的各氨基酸修飾抗體與強(qiáng)制表達(dá)人⑶98或人LATl的L929細(xì)胞的結(jié)合性的圖。圖16B是表示人抗CD98單克隆抗體K3和C2IgGl、C2IgGl的各氨基酸修飾抗體與人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株(DLD-I)、伯基特淋巴瘤細(xì)胞株(Ramos)、人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株(Colo205)和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)的結(jié)合性的圖。發(fā)明的具體說明 微牛物的保藏本發(fā)明提供的含有編碼人抗體可變區(qū)的核酸序列的質(zhì)粒載體C2IgGl/pCR4和K3/pCR4分別以FERM BP-10551 (用于識(shí)別的標(biāo)記為C2IgGl/pCR4)和FERM BP_10552(用于識(shí)別的標(biāo)記為K3/pCR4)于2006年3月14日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東I 丁目I番I中央第6)。
定義本說明書或附圖中，用于標(biāo)記氨基酸而使用的單一英文字母分別表示以下的氨基酸。(G)甘氨酸、(A)丙氨酸、(V)纈氨酸、(L)亮氨酸、(I)異亮氨酸、(S)絲氨酸、(T)蘇氨酸、⑶天冬氨酸、(E)谷氨酸、(N)天冬酰胺、(Q)谷氨酰胺、⑷賴氨酸、(R)精氨酸、(C)半胱氨酸、(M)甲硫氨酸、(F)苯丙氨酸、(Y)酪氨酸、(W)色氨酸、(H)組氨酸、(P)脯氨酸。用于標(biāo)記DNA的單一英文字母的含義分別如下。(A)腺嘌呤、(C)胞嘧唆、(G)鳥嘌呤、(T)胸腺嘧啶。CD98及其單克隆抗體與本發(fā)明的人單克隆抗體及其功能性片段(如無特別說明，以下在本說明書中簡(jiǎn)稱為“本發(fā)明的抗體”)具有特異性結(jié)合能力的CD98，如上所述，是含有529個(gè)氨基酸殘基的II型跨膜糖蛋白鏈，與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上形成異源二聚體。其中，具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)的優(yōu)選具體例子有LAT1。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，CD98為人CD98。人CD98的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是公知的(SEQ ID NO. 66 ；GenBank/EMBL/DDBJ accession No. AB018010)，人 LATl 的蛋白質(zhì)也是公知的(SEQ ID NO. 68 ；GenBank/EMBL/DDBJ accession No. AB018009)。本發(fā)明的抗體與來自癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體的CD98具有特異性結(jié)合能力，而不與人正常細(xì)胞例如正常人血管內(nèi)皮細(xì)胞、正常人末梢血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞結(jié)合。具有結(jié)合能力的癌細(xì)胞的例子有構(gòu)成結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、腦腫瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、白血病、T細(xì)胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮細(xì)胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛癌、咽癌、喉癌、胸膜腫瘤、男性細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜異位癥、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、橫紋肌瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌瘤、甲狀腺肉瘤或腎母細(xì)胞瘤等的癌細(xì)胞，更具體地說，例如有結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株(DLD-l、Colo205、SW480、SW620、LOVO, LS180和HT29)、肺癌細(xì)胞株(H226)、前列腺癌細(xì)胞株(DU145)、黑素瘤細(xì)胞株(G361、SKMEL28和CRL1579)、非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株(Ramos)、膀胱癌細(xì)胞株(T24)、乳腺癌細(xì)胞株(MCF和MDA-MB-231)、胰腺癌細(xì)胞株(HS766T)、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(頂9)、成紅細(xì)胞白血病細(xì)胞株(K562)。本發(fā)明的抗體與上述各種各樣的癌細(xì)胞具有結(jié)合能力，因此有利。本發(fā)明的抗體與癌細(xì)胞的特異性結(jié)合能力使得本發(fā)明的抗體的有效性高。S卩，如后所述，本發(fā)明的優(yōu)選方案的抗體顯著抑制氨基酸攝入到經(jīng)由LATl介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)，因此只與癌細(xì)胞結(jié)合，較為有利，還可以將本發(fā)明的抗體與其它藥物結(jié)合，有利地用作將藥物傳遞至癌細(xì)胞的靶向藥物。本發(fā)明的抗體具有抗腫瘤活性。本發(fā)明的優(yōu)選方案的抗體具有顯著抑制氨基酸攝入到經(jīng)由LATl介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)。因此,本發(fā)明的抗體的抗腫瘤活性除通過ADCC和⑶C的使用免疫系統(tǒng)進(jìn)行特異性毒性之外，通過抑制上述氨基酸的攝取也可帶來該活性。根據(jù)本發(fā)明的具體方案，本發(fā)明的抗體顯著抑制膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞的氨基酸攝入。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明的抗體具有后述(a) SEQ ID NO. 29和31、(b) SEQID NO. 41和47、以及(c)SEQ ID NO. 43和47中的任意一對(duì)序列作為重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。并且，根據(jù)另一方案，本發(fā)明的抗體具有含在質(zhì)粒載體K3/pCR4(FERM BP-10552)或C2IgGl/pCR4(FERM BP-10551)中的、由來自載體pCR4的序列以外的序列編碼的序列作為可變區(qū)。該方案的抗體可變區(qū)的氨基酸序列是由從上述任意的質(zhì)粒載體中得到的、不含有來自載體PCR4的序列的BglII-BsiWI片段(輕鏈可變區(qū))和SlI-NheI片段(重鏈可變區(qū))所編碼。本發(fā)明的抗體的功能性片段是指與本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合的抗原可特異性結(jié)合的抗體的片段。更具體地說，有F (ab，)2、Fab’、Fab、Fv、二硫鍵抗體(disulphide-linkedFV, dsFV)、單鏈 FV (Single-Chain FV, scFV)以及它們的聚合物等(D. J. King.,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies. ,1998, T. J. International、Ltd)。上述抗體片段可通過常用方法例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶進(jìn)行抗體分子的消化或通過公知的遺傳工程方法獲得。本發(fā)明中，“人抗體”是指作為來自人的抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體。如后所述，人抗體可通過對(duì)具有導(dǎo)入人抗體基因座、生產(chǎn)來自人的抗體的能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給予抗原獲得。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如有小鼠，可生產(chǎn)人抗體的小鼠的制備方法例如如國(guó)際公開W002/43478號(hào)公報(bào)中所記載。本發(fā)明的抗體也包含下述單克隆抗體由具有在構(gòu)成抗體的重鏈和/或輕鏈的各氨基酸序列中有一或多個(gè)氨基酸缺失、置換或附加所得到的氨基酸序列的重鏈和/或輕鏈形成。上述氨基酸的部分修飾(缺失、置換、插入、附加)可通過將編碼該氨基酸序列的核苷酸序列部分修飾而導(dǎo)入到本發(fā)明的抗體的氨基酸序列中。該核苷酸序列的部分修飾可采用已知的位點(diǎn)特異性誘變法、按照常規(guī)方法導(dǎo)入(Proc Natl Acsd Sci USA.，1984，8 卷，15662 ;Sambrook 等人.，Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989) Secondedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明的抗體是輕鏈第117號(hào)的異亮氨酸被置換為其它氨基酸殘基，例如甲硫氨酸、天冬酰胺、亮氨酸或半胱氨酸。上述抗體的優(yōu)選例子有具有(d)SEQ ID NO. 43 和 77、(e) SEQ ID NO. 43 和 79、(f) SEQ ID NO. 43 和 81、以及(g) SEQ IDNO. 43和83的任意一對(duì)序列作為重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗體也包含具有任意免疫球蛋白類和亞類的抗體，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，是具有人免疫球蛋白類和亞類的抗體，優(yōu)選的類、亞類有免疫球蛋白G(IgG)，特別是IgGl，優(yōu)選的輕鏈?zhǔn)荎。本發(fā)明的抗體也包含通過本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的基因工程修飾(例如EP0314161號(hào)公報(bào))而變換為不同的亞類的抗體。即，使用編碼本發(fā)明的抗體可變區(qū)的DNA，通過基因工程方法，可獲得與原有的亞類不同亞類的抗體。ADCC是指經(jīng)由在巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等的表面表達(dá)的Fe受體介導(dǎo)，與抗體的恒定區(qū)結(jié)合，由此識(shí)別細(xì)胞，通過活化識(shí)別的細(xì)胞而誘導(dǎo)的細(xì)胞毒活性。而CDC是指通過抗體與抗原結(jié)合，由活化的補(bǔ)體系統(tǒng)引發(fā)的細(xì)胞毒活性，已經(jīng)了解這些活性根據(jù)抗體的亞類不同而活性強(qiáng)弱各異，并且這起因于抗體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)的不同(CharlesA.Janeway,等人.Immunobiology,1997, Current Biology Ltd/Garland PublishingInc.)。因此，例如將本發(fā)明的抗體的亞類變換為IgG2或IgG4，則可以獲得與Fe受體結(jié)合度低的抗體。相反，將本發(fā)明的抗體的亞類變換為IgGl或IgG3，則可以獲得與Fe受體結(jié)合度高的抗體。希望得到上述ADCC和⑶C活性時(shí)，優(yōu)選抗體亞類為IgGl。將不同的亞類抗體變換為IgGl時(shí)，例如可從抗體生成雜交瘤中只分離可變區(qū)，導(dǎo)入到含有人IgGl的恒定區(qū)的載體、例如N5KGl_ValLark載體(IDEC Pharmaceuticals,N5KG1 (美國(guó)專利6001358))中制備。通過將本發(fā)明的抗體恒定區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行基因工程修飾、或者與具有上述序列的恒定區(qū)序列結(jié)合，可以改變與Fe受體的結(jié)合度(參照J(rèn)aneway CA. Jr.和TraversP. (1997), Immunobiology, Third Edition, Current Biology Ltd. /Garland PublishingInc.)，或者可以改變與補(bǔ)體的結(jié)合度(參照Mi-Hua Tao，等人 ，1993，J. Exp. Med)。例如，將編碼重鏈恒定部分的EU編號(hào)系統(tǒng)(參照Sequences of proteins of immun ologicalinterest, NIH Publication No. 91 3242)的第 331 號(hào)腦氨酸(P)的序列 CCC 突變?yōu)?T 編碼絲氨酸(S)的TCC，將脯氨酸置換為絲氨酸，由此可以改變與補(bǔ)體的結(jié)合度。例如，假設(shè)本發(fā)明的抗體單獨(dú)沒有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性，則優(yōu)選具有經(jīng)Fe受體介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒活性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(CDC)產(chǎn)生的抗腫瘤活性的抗體，如果單獨(dú)的抗體具有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性，則更優(yōu)選與Fe受體的結(jié)合度低的抗體。考慮免疫抑制藥物時(shí)，優(yōu)選只對(duì)T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合有空間位阻時(shí)等、不具有ADCC活性或CDC活性的抗體。ADCC活性或CDC活性可能成為毒性的原因時(shí)，優(yōu)選通過突變Fe區(qū)域或變更亞類來避免成為毒性原因的活性的抗體?？紤]以上，如果需要，通過對(duì)不同的亞類進(jìn)行基因工程修飾，則可將本發(fā)明的抗體制成通過ADCC或CDC特異性傷害癌細(xì)胞的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選方案，本發(fā)明的抗體優(yōu)選識(shí)別由人CD98的氨基酸序列(SEQ ID NO. 66)中的連續(xù)或不連續(xù)的至少8個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的表位。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選方案，本發(fā)明的抗體優(yōu)選與人CD98的氨基酸序列中的第371 529號(hào)氨基酸的區(qū)域的一部分具有結(jié)合性，或者與第I 371號(hào)氨基酸的區(qū)域的一部分具有結(jié)合性。根據(jù)本發(fā)明的另一方案，提供具有與人CD98和猴CD98顯示交叉反應(yīng)的性質(zhì)的抗體作為本發(fā)明的抗體?？梢韵氲缴鲜隹贵w在人CD98和猴CD98中識(shí)別同一或極為類似的表位結(jié)構(gòu)，在對(duì)人進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)之前可以以猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)，因此具有優(yōu)勢(shì)。⑶98抗體的制備本發(fā)明的抗體例如可通過以下所述方法制備。將細(xì)胞表面大量表達(dá)人⑶98/人LATl或其一部分、或?yàn)樘岣呖乖目乖远c適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)(例如牛血清白蛋白等)的綴合物、或人CD98/人LATl的細(xì)胞根據(jù)需要與免疫刺激劑(弗氏佐劑等)等一起免疫小鼠、兔、山羊、馬等非人哺乳動(dòng)物，或者將整合了人⑶98/人LATl的表達(dá)載體給予非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫致敏。本發(fā)明的抗體如下獲得從由免疫致敏動(dòng)物得到的抗體生成細(xì)胞和沒有自身抗體生成能力的骨髓瘤系細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)中制備雜交瘤，將雜交瘤克隆，選擇可生成與免疫中使用的抗原顯示特異性親和性的單克隆抗體的克隆。以下進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的抗體的制備方法進(jìn)行詳述，抗體的制備方法并不限于此，例如可以使用脾細(xì)胞以外的抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。抗原可以將編碼⑶98的DNA整合到動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體中，將該表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，使用獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株本身。
⑶98在很多癌細(xì)胞表面上與LATl形成異源二聚體，因此將編碼LATl的DNA同樣整合到表達(dá)載體中，使用⑶98和LATl共表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株作為抗原，由此，有望獲得抑制LATl的氨基酸攝入的抗體。動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體例如可使用pEGF-Nl (Becton Dickinson BioscienceClontech公司制備)等載體，用適當(dāng)?shù)南拗泼甘共迦胛稽c(diǎn)切斷，將用同一酶切斷的人CD98或人LATl連接，由此可以制備用于導(dǎo)入目標(biāo)基因的載體。通過將制備的表達(dá)載體例如導(dǎo)入到作為宿主的 L929 細(xì)胞(American Type Culture Collection No. CCL-1)中，可以制備高表達(dá)人⑶98和人LATl的細(xì)胞。將基因?qū)胨拗鞯姆椒ㄊ枪?，例如有任意的方?例如使用鈣離子的方法、電穿孔法、原生質(zhì)球法、乙酸鋰法、磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法等)。這樣制備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以作為制備⑶98抗體的免疫原。還可以將表達(dá)載體本身作為免疫原。人CD98可根據(jù)公知的核苷酸序列或氨基酸序列，除基因重組技術(shù)之外，還可適當(dāng)使用化學(xué)合成法、細(xì)胞培養(yǎng)方法等的技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法制備?？梢砸赃@樣得到的人CD98蛋白質(zhì)作為抗原制備CD98抗體。人CD98的部分序列可按照在后述的技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法，通過基因重組技術(shù)或化學(xué)合成法制備，還可以使用蛋白分解酶等將人CD98適當(dāng)切斷來制備。上述得到的抗原如下進(jìn)行免疫。即，將制備的抗原與用于提高抗原性的適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)(例如牛血清白蛋白等)、以及根據(jù)需要與免疫刺激劑(弗氏完全或不完全佐劑等)一起混合，對(duì)小鼠、兔、山羊、馬等非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。優(yōu)選保持未重新排序的人抗體基因，使用通過免疫致敏、生成對(duì)該免疫原為特異性的人抗體的非人動(dòng)物，則本發(fā)明的抗體也可以是人抗體。此時(shí)，生成人抗體的動(dòng)物例如有富塚等人的文獻(xiàn)[Tomizuka等人.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA，2000，97卷722]中記載的生成人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。分泌單克隆抗體的雜交瘤的制備可按照Kohler和Milstein的方法(Nature,1975，256卷495 497)以及與其相近的方法進(jìn)行。即，將從如上所述的免疫致敏的動(dòng)物中獲得的脾臟、淋巴結(jié)、骨髓或扁桃體等、優(yōu)選淋巴結(jié)或脾臟中所含的抗體生成細(xì)胞，和優(yōu)選來自小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔或人等哺乳動(dòng)物的沒有自身抗體生成能力的骨髓瘤細(xì)胞通過細(xì)胞融合來制備。細(xì)胞融合例如可在聚乙二醇(例如分子量1500 6000)等高濃度的聚合物溶液中、在通常約30 40°C下，將抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合、進(jìn)行約I 10分鐘。生成單克隆抗體的雜交瘤克隆的篩選可如下進(jìn)行將雜交瘤例如在微量滴定板中培養(yǎng)，例如采用ELISA等酶聯(lián)免疫測(cè)定法、放射免疫、熒光抗體法等免疫學(xué)方法測(cè)定在可見到生長(zhǎng)的孔中的培養(yǎng)上清對(duì)免疫抗原的反應(yīng)性。由雜交瘤制備單克隆抗體時(shí)，可以將雜交瘤進(jìn)行體外培養(yǎng)，由培養(yǎng)上清中分離。還可以在小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠或兔等腹水中等進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)，從腹水中分離。還可以從雜交瘤等的抗體生成細(xì)胞中克隆編碼單克隆抗體的基因，整合到適當(dāng)?shù)妮d體中，將其導(dǎo)入到宿 主(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞等哺乳類細(xì)胞株、大腸桿菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等)中，采用基因重組技術(shù)制備重組抗體(P.J. Delves. ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIALTECHNIQUES.，1997,WILEY,P. Shepherd和C. Dean. ,Monoclonal Antibodies. ,2000,OXFORDUNIVERSITY PRESS，J. W. Goding，Monoclonal Antibodies !principles and practice.,1993，ACADEMIC PRESS)。還可以采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)，制備目標(biāo)抗體基因整合到內(nèi)源性基因中所得的轉(zhuǎn)基因的牛、山羊、綿羊或豬，從該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中可大量獲得來自該抗體基因的單克隆抗體。將雜交瘤在體外培養(yǎng)時(shí)，配合培養(yǎng)的細(xì)胞種類的特性、實(shí)驗(yàn)研究的目的和培養(yǎng)方法等各種條件，可以使雜交瘤生長(zhǎng)、維持和保存，使用在培養(yǎng)上清中用于生成單克隆抗體的已知的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或由已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)制備的所有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基來實(shí)施。生成的單克隆抗 體可通過將本領(lǐng)域所周知的方法例如蛋白A柱的層析、離子交換層析、疏水層析、硫酸銨鹽析法、凝膠過濾、親和層析等適當(dāng)組合來制備。抗體的藥物用途本發(fā)明的抗體，首先，由于與來自該癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體的CD98的特異性結(jié)合能力，因此通過與治療用藥物綴合，可以形成可用于向癌細(xì)胞送達(dá)藥物或在可用于導(dǎo)彈療法等的治療目的復(fù)合體。對(duì)與抗體綴合的治療用藥物的例子沒有特別限定，例如有碘(m碘mI，125碘=125I)、釔(9° 釔=90Y)、銦(m 銦=111In)、锝(99m 锝99mTc)銦等放射核素(J. ff. Goding.Monoclonal Antibodies !principles and practice. , 1993,ACADEMIC PRESS),綠胺桿菌毒素(Pseudomonal toxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、蓖麻毒素(Ricin)等細(xì)菌毒素，以及甲氨喋呤(Methopterin)、絲裂霉素(mitomycin)、加利車霉素(calicheamicin)等化學(xué)療法藥物(D. J. King. , Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.,1998,T. J. International Ltd,M. L. Grossbard. ,Monoclonal Antibody-Based Therapy ofCancer. , 1998, Marcel Dekker Inc)等,更優(yōu)選誘導(dǎo)自由基生成的硒化合物?？贵w與治療用藥物的結(jié)合可以是共價(jià)或非共價(jià)鍵(例如離子鍵)的任意形式。例如，利用抗體分子中的反應(yīng)性基團(tuán)(例如氨基、羧基、羥基等)或配位性基團(tuán)，根據(jù)需要使反應(yīng)性的基團(tuán)結(jié)合或者變換為反應(yīng)性基團(tuán)，然后使具有可在可與該反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)形成絡(luò)合物的官能團(tuán)(為細(xì)菌毒素、化學(xué)療法藥物時(shí))或該配位性基團(tuán)之間形成絡(luò)合物的離子性基團(tuán)(為放射性核素時(shí))的治療用藥物與抗體接觸，可得到本發(fā)明的復(fù)合體?；蛘咴谛纬蓮?fù)合體時(shí)可利用生物素-親和素系統(tǒng)。治療用藥物為蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可通過基因工程的方法，以抗體與上述蛋白質(zhì)或與肽融合的蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)。另外，由于本發(fā)明的抗體具有抗腫瘤活性，因此可以將該本身作為抗腫瘤藥物使用。可進(jìn)一步用作藥物組合物、尤其是用作腫瘤的預(yù)防或治療藥的有效成分。因此，本發(fā)明的抗體或藥物組合物可適用具有起因于表達(dá)人⑶98/人LATl的細(xì)胞的可能性的各種疾病或癥狀的治療或預(yù)防。該疾病或癥狀例如有各種惡性腫瘤，腫瘤的例子有結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、腦腫瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、白血病、T細(xì)胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮細(xì)胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛癌、咽癌、喉癌、胸膜腫瘤、男性細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜異位癥、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、橫紋肌瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌瘤、甲狀腺肉瘤或腎母細(xì)胞瘤等，適用本發(fā)明的抗體時(shí)的腫瘤不限于一種，可以是多種腫瘤并發(fā)。另外，本發(fā)明的人單克隆抗體可適用于罹患了原發(fā)性局部癌的患者的壽命延長(zhǎng)。另外，對(duì)于表達(dá)⑶98的免疫活性細(xì)胞可以選擇性地使本發(fā)明的藥物組合物與其作用?！斜景l(fā)明的抗體或與治療用藥物結(jié)合的抗體的藥物優(yōu)選以藥物組合物的形式提供。上述藥物組合物含有治療上有效量的治療用藥物，可以制成口服、非口服給藥用的各種形式的制劑。這里，治療上有效量是指對(duì)于給予的癥狀或給予的計(jì)劃是可以獲得治療效果的量。本發(fā)明的組合物除抗體之外，可以含有生理學(xué)上可接受的制劑上的添加物，例如稀釋劑、防腐劑、溶解劑、乳化劑、佐劑、抗氧化劑、等滲劑、賦形劑和載體的一種或多種。還可以制成與其它抗體或抗生素等其它藥物的混合物。適當(dāng)?shù)妮d體中可以含有生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水葡萄糖液、以及緩沖生理鹽水，但并不限于此。也可以含有該領(lǐng)域中周知的氨基酸、糖類、表面活性劑等穩(wěn)定劑，防止與表面吸附的防吸附劑。制劑的形式可以根據(jù)治療目的、治療計(jì)劃選擇包含凍干制劑(這種情況下，可以通過添加上述緩沖水溶液重構(gòu)后使用)、緩釋制劑、腸溶性制劑、注射劑或輸液劑等的制劑。給藥途徑可適當(dāng)確定，例如可以是口服途徑、以及包含靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)注射或配藥的非腸道途徑?；蛘咭部梢允鞘贡景l(fā)明的組合物與患者的患部直接接觸的方法。給藥量根據(jù)使用動(dòng)物的試驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)的實(shí)施來適當(dāng)確定，但通常應(yīng)考慮患者的狀態(tài)或嚴(yán)重程度、年齡、體重、性別等。通常在口服給藥時(shí)，成人每天約為0. Olmg lOOOmg，可將其一次或分多次給藥。非口服給藥時(shí)，可以通過皮下注射、肌肉注射或靜脈注射每次給藥約 0. Olmg lOOOmg。本發(fā)明也包含使用本發(fā)明的抗體或藥物組合物進(jìn)行上述疾病的預(yù)防或治療的方法，本發(fā)明還包含本發(fā)明的抗體在上述疾病的預(yù)防或治療藥的制備中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明的抗體可以以溶解于水或除此之外的藥理學(xué)可接受的溶液而得到的無菌性溶液或懸浮液的安瓿劑的形式使用。還可以將無菌粉末制劑(優(yōu)選將本發(fā)明的分子冷凍干燥)填充到安瓿瓶中，在使用時(shí)用藥理學(xué)可接受的溶液稀釋。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例記載的方案的限定。實(shí)施例I :人CD98或人LATl表汰載體的制備以保有人 CD98(hCD98，GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018010 ；SEQ IDNO. 65)和人 LATl(hLATl，GenBank/EMBL/DDBJaccession no. ABO18009 ;SEQ ID NO. 67)的DNA的質(zhì)粒載體pcDNA3. l_hCD98和pcDNA3. 1-hLATl為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。為了在全長(zhǎng)人⑶98cDNA的5'末端附加EcoRI序列、在其3'末端附加NocI序列和終止密碼予，使用引物 5，-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3，(SEQID NO. 59)和5’-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAGCAG-3’ (SEQ ID NO. 60)，以 KOD-PlusDNA聚合酶(東洋紡公司制備)和 hCD98cDNA (約 20ng)為模板，進(jìn)行94°C 15秒、55°C 30秒和68°C I分30秒的30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。將經(jīng)修飾的h⑶98序列以EcoRI-NotI片段的形式分離，然后連接到用相同的酶切斷的pTracer-EF/Bsd載體(Invitrogen公司制備)上。以所得質(zhì)粒為模板，使用CD98v2U(5’ -AGT CTCTTG CAA TCG GCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG-3’ (SEQ ID NO. 61))引物和CD98v2L(5’-CAG MT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CM GAG ACT-3’ (SEQ IDNO. 62))引物，將hCD98DNA的第591和第594號(hào)(SEQ ID NO. 65中的第702號(hào)和第705號(hào))的A變?yōu)镚。由所得質(zhì)粒制備ECoRI-hCD98-NotI片段，與用相同的酶切斷的pEF6myC-His/Dsd(Invitrogen)載體連接。將所得質(zhì)粒命名為pEF6/hO)98。同樣，為了在全長(zhǎng)人LATIcDNA的5'末 端附加EcoRI序列、在其3'末端附加Kpnl序列，使用引物 5’ -CCG GAA TTC CCA CCA TGG CGG GTG CGG GCC CGA AGC GGC-3’ (SEQID NO. 63)和 5’ -CGG GGT ACC GTC TCC TGG GGG ACC ACC TGC ATG AGC TTC-3’ (SEQ IDNO. 64)，以 KOD-Plus DNA 聚合酶和 hLATlcDNA (約 20ng)為模板，進(jìn)行 94°C 15 秒、55°C 30秒和68 °C I分30秒的30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。將經(jīng)修飾的hLATl序列以EcoRI-KpnI片段的形式分離，然后連接到用相同的酶切斷的pEGFP-NKClontech公司制備)載體上。再將所得質(zhì)粒以EcoRI-NotI片段的形式分離，然后連接到用相同的酶切斷的pEFlV5His/Neo (Invitrogen公司制備)載體上。將所得質(zhì)粒命名為pEFl/hLATl-EGFP。實(shí)施例2 :hCD98/hLATl表汰細(xì)朐的制各hCD98/hLATl表達(dá)細(xì)胞的制備是使用Invitrogen公司制備的脂轉(zhuǎn)染試劑和Plus試劑，將實(shí)施例I中制備的表達(dá)載體pEF6/hCD98和pEF I/hLATl-EGFP (hLATl-E)導(dǎo)入到 Colon26 (CT26)細(xì)胞和 L929 細(xì)胞(American Type Culture Collection No. CCL-1)中?；?qū)氚凑帐謨?cè)說明書的方法進(jìn)行。導(dǎo)入了基因的細(xì)胞使用細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔板，BectonDickinson公司制備)、在37°C、5% C02下培養(yǎng)24小時(shí)后，如果為CT26細(xì)胞株，則用含有5 u g/mL殺稻瘟素和500 u g/mL G418的培養(yǎng)基，如果為L(zhǎng)929細(xì)胞株，則用含有5 y g/mL殺稻瘟素和lmg/mL G418的培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)三天。接著，用RPE熒光標(biāo)記小鼠抗人CD98 抗體(Becton Dickinson 公司制備，Ca. No. 556076)的 FACS Vantage 分離 hLATl-E 和⑶98陽性細(xì)胞。用同樣的方法制備表達(dá)h⑶98的L929細(xì)胞或表達(dá)hLATl_E的L929細(xì)胞。實(shí)施例3 :生成人抗體的小鼠的制備免疫中使用的小鼠對(duì)于內(nèi)源性Ig重鏈和K輕鏈的破壞兩者均具有同型接合體的遺傳背景，并且同時(shí)保有含有人Ig重鏈基因座的14號(hào)染色體片段(SC20)和人IgK鏈轉(zhuǎn)基因(kCo5)。該小鼠是通過具有人Ig重鏈基因座的系統(tǒng)A的小鼠和具有人IgK鏈轉(zhuǎn)基因的系統(tǒng)B的小鼠的交配來制備。系統(tǒng)A對(duì)于內(nèi)源性Ig重鏈和K輕鏈的破壞兩者為同型接合體，是保有可進(jìn)行子代傳遞的14號(hào)染色體片段(SC20)的小鼠系統(tǒng)，例如記載于富塚的報(bào)告(Tomi zuka.等人 ，Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 卷722)中。另外，系統(tǒng) B 是對(duì)于內(nèi)源性Ig重鏈和K輕鏈的破壞兩者為同型接合體，是保有人IgK鏈轉(zhuǎn)基因(kCo5)的小鼠系統(tǒng)(轉(zhuǎn)基因小鼠)，例如記載于Fishwild的報(bào)告(Nat Biotechnol. ,1996,14卷845)。系統(tǒng)A的雄性小鼠和系統(tǒng)B的雌性小鼠、或系統(tǒng)A的雌性小鼠與系統(tǒng)B的雄性小鼠交配得到的子代小鼠用富塚的報(bào)告(Tomizuka等人.，Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97卷722)的方法進(jìn)行分析，篩選在血清中同時(shí)檢測(cè)出人Ig重鏈和K輕鏈的個(gè)體(生成人抗體的小鼠)(Ishida和 Lonberg, IBC&apos ;s Ilth Antibody Engineering,Abstract,2000 ；Ishida, I.等人 ，Cloning&Stem Cells 4，85 96 (2002))，用于以下的免疫實(shí)驗(yàn)。免疫實(shí)驗(yàn)也使用了使上述小鼠的遺傳背景改變的小鼠等(石田功(2002)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)20，6846851)。實(shí)施例4 :人單克隆抗體的制備人單 克隆抗體的制備是按照單克隆抗體實(shí)驗(yàn)操作入門(安東民衛(wèi)等人著作，講談社發(fā)行1991)等記載的一般方法進(jìn)行。作為免疫原的h⑶98/hLATl，使用實(shí)施例2制備的表達(dá)h⑶98/hLATl_E的CT26細(xì)胞和確認(rèn)有h⑶98表達(dá)的人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株Colo205細(xì)胞。被免疫動(dòng)物使用實(shí)施例3中制備的生產(chǎn)人免疫球蛋白的生成人抗體的小鼠。使用表達(dá)hCD98/hLATl-E的CT26細(xì)胞時(shí)，將5X IO6個(gè)細(xì)胞與IRBI佐劑(Corixa公司制備)混合，在腹腔內(nèi)初次免疫。自初次免疫后的第7、24天，腹腔內(nèi)追加免疫5X IO6個(gè)細(xì)胞/小鼠。并且在獲得下述的脾臟細(xì)胞之前3天時(shí)同樣地腹腔內(nèi)追加免疫5X IO6個(gè)細(xì)胞/小鼠。使用Colo205細(xì)胞時(shí)，腹腔內(nèi)初次免疫5X106個(gè)細(xì)胞。自初次免疫后的第14天，腹腔內(nèi)追加免疫5X IO6個(gè)細(xì)胞/小鼠，3天后獲得以下所述的脾臟細(xì)胞。由免疫的小鼠中外科取得脾臟，將回收的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0 (ATCCNo. CRL1581)按照5 I混合，使用聚乙二醇1500 (Roche公司制備)作為融合劑，進(jìn)行細(xì)胞融合，制備大量雜交瘤。雜交瘤的選擇通過在含有10%胎牛血清(FCS)和次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的含HAT的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司制備)中培養(yǎng)、進(jìn)行。再使用含有HT的DMEM培養(yǎng)基，通過極限稀釋法進(jìn)行單一克隆。培養(yǎng)是在96孔微量滴定板(Becton Dickinson公司制備)中進(jìn)行。生成目標(biāo)人單克隆抗體的雜交瘤的選擇(篩選)以及各雜交瘤所生成的人單克隆抗體的特征可通過后述的熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)測(cè)定來進(jìn)行。生成人單克隆抗體的雜交瘤的篩選如下進(jìn)行。即，通過下述FACS分析，獲得200個(gè)以上生成具有人免疫球蛋白U鏈(hlgiO、Y鏈(hlgY)和人免疫球蛋白輕鏈K (hlgK)、且與表達(dá)h⑶98/hLATl-E的CT26細(xì)胞具有特異性反應(yīng)性的人單克隆抗體的雜交瘤。需要說明的是，本說明書的實(shí)施例中，在表示結(jié)果的表或圖中，用符號(hào)對(duì)生成人單克隆抗體的雜交瘤克隆進(jìn)行命名。以下的雜交瘤克隆表示單一克隆4-35-14(C2)、4-32-9 (K3)，7-95-8，10-60-7，3-69-6，5-80-1 (以上克隆，免疫原是表達(dá) hCD98/hLATl_E 的CT26細(xì)胞)，1-40-1 (所述克隆，免疫原是Colo205細(xì)胞)。實(shí)施例5 :各單克降抗體的亞類的鑒定通過FACS分析，對(duì)實(shí)施例4中獲得的各單克隆抗體的亞類進(jìn)行鑒定。將2X IO6/mL的Colo205細(xì)胞懸浮于含有ImM EDTA、0. 1% NaN3>5% FCS的PBS的SB (染色緩沖液)中。將細(xì)胞懸浮液分注在96孔圓底板中(Becton Dickinson公司制備,50 y L/孔)。再加A50UL實(shí)施例4培養(yǎng)的雜交瘤的培養(yǎng)上清，進(jìn)行攪拌，在冰點(diǎn)溫度下反應(yīng)30分鐘，然后離心(2000rpm, 4°C，2分鐘)，除去上清。將沉淀物(pellet)用100 u L/孔的SB清洗一次，然后將FITC熒光標(biāo)記兔抗人Igii F(ab' )2抗體(Dako Cytomation公司制備)用SB稀釋為50倍，或者將RPE熒光標(biāo)記山羊抗人IgYF(ab' )2抗體(SuthernBiotech公司制備)用SB稀釋為200倍，或者將RPE熒光標(biāo)記兔抗人Ig K F(ab' )2抗體(Dako Cytomation公司制備)用SB稀釋為200倍，加入，在冰點(diǎn)溫度下反應(yīng)30分鐘。用SB清洗一次，然后懸浮于300 V- L SB中，通過FACS(FACSCan,Becton Dickinson公司制備)測(cè)定表不抗體結(jié)合的突光強(qiáng)度。所得抗體的一部分結(jié)果如表I所不。C2是重鏈為ii鏈、輕鏈為K鏈，K3、3-69_6、7-95-8、10-60-7、1-40-1和5-80-1均是重鏈為y鏈、輕鏈為k鏈。[表I]各抗體的亞類
權(quán)利要求
1.人單克隆抗體或其功能性片段，其具有SEQID NO :41和47 —對(duì)序列作為重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
2.人單克隆抗體或其功能性片段，其中所述抗體具有SEQ ID NO 41 的 Vh；SEQ ID NO -Al 的 \ ； 人K輕鏈恒定區(qū)；和 人重鏈恒定區(qū)，其中IgG的Y鏈和IgM的μ鏈的位于CHl恒定區(qū)的共通序列GCL序列朝向可變區(qū)一側(cè)方向上相鄰的26個(gè)氨基酸為μ鏈中的相應(yīng)氨基酸，而GCL序列恒定區(qū)一側(cè)的全部氨基酸為Y鏈中的相應(yīng)氨基酸。
3.權(quán)利要求2所述的人單克隆抗體或其功能性片段，其中Vh和位于CHl恒定區(qū)的共通序列GCL序列朝向可變區(qū)一側(cè)方向上相鄰的26個(gè)氨基酸由SEQ ID NO 45表示。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其功能性片段，其中所述功能性片段選自抗體的Fab、Fab’、(Fab/ ) 2、Fv、scFv、sdFv以及它們的組合。
5.綴合物，該綴合物包含 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其功能性片段；和 異源結(jié)構(gòu)域，其含有藥物或可檢測(cè)的部分。
6.權(quán)利要求5的綴合物，其中所述可檢測(cè)的部分為標(biāo)志物。
7.綴合物，該綴合物包含 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其功能性片段；和 異源結(jié)構(gòu)域，其含有結(jié)合蛋白。
8.綴合物，該綴合物包含 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其功能性片段；和 異源結(jié)構(gòu)域，其含有酶。
9.綴合物，該綴合物包含 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其功能性片段；和 異源結(jié)構(gòu)域，其含有毒素或免疫調(diào)節(jié)劑。
10.細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其功能性片段。
11.抗體的制備方法，該方法包含將含有下述(a)和(b)中任意一對(duì)序列或其簡(jiǎn)并核苷酸序列的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主；培養(yǎng)該宿主；由培養(yǎng)物獲得該抗體(a)SEQ ID NO :40 和 46，和(d)SEQ ID NO :44 和 46。
12.權(quán)利要求11所述的制備方法，其中，宿主選自大腸桿菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了與來自癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、且與具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白質(zhì)(例如，LAT1)形成復(fù)合體的CD98具有特異性結(jié)合能力的人抗體或其功能性片段。該抗體與在癌細(xì)胞表面與LAT1形成二聚體的CD98結(jié)合，使用ADCC或CDC的免疫系統(tǒng)對(duì)表達(dá)CD98的癌細(xì)胞特異性攻擊，并且抑制經(jīng)LAT1介導(dǎo)的癌細(xì)胞對(duì)氨基酸的攝取，由此抑制其增殖。本發(fā)明繼而提供含有該抗體或其抗體片段的、作用于多種癌癥、或?qū)Π樘禺愋缘?、沒有副作用的癌癥的預(yù)防或治療藥。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102659947SQ20121013567
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2007年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日
發(fā)明者吉野哲也, 片岡之郎, 田原知幸, 遠(yuǎn)藤仁, 金井好克, 長(zhǎng)谷川和正 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社