專利名稱：一種高產(chǎn)降粘酶系的菌種及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)降粘酶系的菌種及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著石油枯竭和環(huán)境污染問題日益嚴重，生物燃料乙醇的發(fā)展受到了世界各國的普遍的關(guān)注和重視。作為第一代燃料乙醇，玉米(美國)和甘蔗(巴西)等糧食作物為主要原料(Srichuwong S et al, 2009),在過去的幾十年里得到了迅速的發(fā)展。但是在一些土地資源緊缺和糧食危機的一些發(fā)展中國家，以糧食為原料生產(chǎn)燃料乙醇是不經(jīng)濟也不切實際的策略。因此以農(nóng)業(yè)、林業(yè)和 工業(yè)廢棄物如秸桿等纖維素和半纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇第二代生物燃料乙醇得到了廣泛的研究(Kumar et al., 2008; Sukumaran et al., 2009; Yanget al., 2011)。但是生物質(zhì)抗性(biomass recalcitrance) (Himmel et al., 2007)導致植物纖維中的結(jié)構(gòu)性多糖難以被微生物利用，如果不提高纖維素降解為可發(fā)酵性糖類的動力學參數(shù)和轉(zhuǎn)化率，不解決這些原料難以降解的化學結(jié)構(gòu)特征，整個生產(chǎn)過程也是非常困難和昂貴的。美國計劃到2011年將生物燃料乙醇的產(chǎn)量提高到1.05億噸，歐盟計劃到2030年歐盟的運輸業(yè)的1/4的燃料將由生物燃料代替。在中國的十二五計劃中，燃料乙醇的產(chǎn)量要提高到500萬噸。在這些規(guī)劃中，要經(jīng)濟且高效的生產(chǎn)燃料乙醇還有很大的空間。甘薯等塊莖類非糧原料具有高淀粉和可發(fā)酵性糖，且中國是世界上甘薯最大生產(chǎn)國，是較為理想的1.5代燃料乙醇的原料。但是這些塊莖類的發(fā)酵醪液粘度很大，導致醪液輸送困難，降低了工藝流程中的熱傳導效率和酵母的活性(Zhang et al, 2010) 0采用流加的發(fā)酵工藝和添加發(fā)酵用水不能解決實際問題。因此在甘薯等全原料發(fā)酵過程中開發(fā)了一種添加降粘酶系的工藝，即添加木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶等商品酶達到快速降粘的效果。但是商品降粘酶價格昂貴，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)仍然增加了生產(chǎn)成本。因此成本問題已成為1.5代和2代燃料乙醇生產(chǎn)的共性問題，要降低生產(chǎn)成本必須從根源上解決問題。目前還沒有針對自主開發(fā)降粘酶系的報道，因此，本發(fā)明公開一種高產(chǎn)降粘酶系的菌種及其應(yīng)用，通過降粘酶系菌株的篩選和發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，利用其發(fā)酵粗酶液，通過簡單的操作工序，即可降低薯類原料粘度，達到很好的預處理效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決以上問題，提供了一種產(chǎn)降粘酶并能有效地降低甘薯發(fā)酵醪液的粘度的菌株赭綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge),以降低燃料乙醇生產(chǎn)成本。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:本發(fā)明公開了一種赭綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge),保藏號為:CBS131817。該菌株為一株降粘酶系高產(chǎn)菌株，命名為CMC-37，該菌株菌落為藍綠色，菌絲有橫隔，其分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，形成帚狀體。關(guān)于微生物保藏信息:
菌株名稱:赫綠青霉Penicillium ochrochloron保藏日期:27/01/2012保減單位:荷蘭微生物囷種保減中心地址:荷蘭烏特勒支3584郵政編碼區(qū)，烏普薩拉蘭8號，荷蘭皇家藝術(shù)與科學學院一荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS-KNAW)真菌生物多樣性中心(Centraalbureau voorSchimmelcultures, FungalBiodiversity Centre, Institute of the RoyalNetherlandsAcademy of Arts and Sciences,CBS-KNAff Fungal Biodiversity Centre,Uppsalalaan8,3584CT Utrecht, The Netherlands)
保藏號:CBS131817本發(fā)明還公開了上述菌株赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)篩選來源；具體地，所述的篩選來源于腐爛甘薯。本發(fā)明還公開了上述菌株赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)篩選篩選過程；具體地，所述的篩選過程，腐爛甘薯經(jīng)10—1，10_2，10_3，10Λ 10_5，10_6，10_7稀釋后，分別取100 μ L10_5，10_6，10_7濃度菌懸液涂布于篩選培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3天后，挑取單菌落到PDA斜面培養(yǎng)基中，平板用剛果紅染液染色，挑選黃色透明圈大且明顯的菌株。所述的篩選培養(yǎng)基為(g/L):CMC10,酵母膏 4.5，(NH4)2S044.5，NaCI5.0，Κ2ΗΡ042.0, MgSO4.7Η200.4, agar 15。

所述的剛果紅染液染色步驟為:菌落挑取后，利用1%剛果紅染液染色IOminJgJ掉染色液并用IM NaCI潤洗三次。本發(fā)明還公開了上述菌株赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)用于發(fā)酵產(chǎn)生降粘酶并應(yīng)用于塊莖類燃料乙醇發(fā)酵降粘預處理中的用途；具體地，所述的塊莖類優(yōu)選是鮮甘薯。本發(fā)明還公開了用上述赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)產(chǎn)降粘酶的發(fā)酵培養(yǎng)基；具體地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):玉米芯20，KH2P042.0,N H4N034.5，MgSO40.15，CaCl20.3，F(xiàn)eSO4.7Η200.0005，ZnSO4.7Η200.0014，MnSO4.H2O0.0016，COCI2.6Η200.0016，Tween803.3, ρΗ6.5。本發(fā)明還公開了赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)產(chǎn)降粘酶的發(fā)酵條件；具體地，所述的發(fā)酵條件為30°C，130rpm, 5天。本發(fā)明還公開了用上述赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)產(chǎn)降粘酶的降粘方法；具體地，所述的降粘方法包括:(I).打漿:甘薯塊莖原料洗凈、打漿。(2).液化:按照90 150KNU/kg淀粉在甘薯漿中添加α -淀粉酶，80 90°C液化至碘反應(yīng)為紅棕色，冷卻至室溫后按料水比3: I添加自來水。(3).高溫處理:液化后將甘薯漿在115°C高溫下作用20min。
(4).預處理:溫度降低至30 50°C時，每公斤甘薯漿中添加40mL降粘酶，50°C作用2h。所述的α -淀粉酶標準酶活力為90KNU/g，酶活定義為在37°C，pH5.6時，每小時水解5.26克淀粉的酶量為I個KNU。所述的降粘酶即由赭綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)發(fā)酵后經(jīng)過離心，上清液再經(jīng)過0.22 μ m過濾器過濾獲得。所述的粘度測定儀器為上海尼潤智能科技有限公司生產(chǎn)的RDV-2+PR0型數(shù)字式旋轉(zhuǎn)粘度計。本發(fā)明通過篩選獲得了一株產(chǎn)降粘酶的菌株赭綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge),該菌株利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯為主要原料發(fā)酵產(chǎn)生降粘酶,有效利用了農(nóng)業(yè)廢棄物，成本低廉，該降粘酶應(yīng)用于以非糧甘薯塊莖為原料生產(chǎn)燃料乙醇發(fā)酵降粘預處理工藝中，降粘效果明顯，大大降低了燃料乙醇的成產(chǎn)成本。
具體實施例方式以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但并非是對本發(fā)明的技術(shù)方案的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解， 依然可以對發(fā)明進行修改或等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之中。實施例1赫綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge)能夠在羧甲基纖維素鈉(CMC)為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基生長，30°C培養(yǎng)3天后，剛果紅染液實驗顯示較大的黃色透明圈。實施例2赭綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)接種于未經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基后，30°C，130rpm培養(yǎng)4天后，50g液化并經(jīng)過高溫后的甘薯漿加入2mL經(jīng)過離心和0.22 μ m過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h后粘度下降率為75.78%。實施例3赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)接種于50mL經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基后，30°C，130rpm培養(yǎng)4天后，50g液化并經(jīng)過高溫后的甘薯漿加入2mL經(jīng)過離心和
0.22 μ m過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h后粘度下降率為84.10%。實施例4赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)接種于50mL經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基后，30°C，130rpm培養(yǎng)5天后，50g液化并經(jīng)過高溫后的甘薯漿加入2mL經(jīng)過離心和
0.22 um過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h后粘度下降率為89.09%。實施例5赫綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge)接種于 200mL 經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基后，30°C，130rpm培養(yǎng)5天后，IOOg液化并經(jīng)過高溫后的甘薯漿加入4mL經(jīng)過離心和
0.22 um過濾器過濾獲得酶液，50°C作用2h后粘度下降率為84.96%。實施例6赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)接種于20L經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基后，30°C，130rpm培養(yǎng)5天后，150g液化并經(jīng)過高溫后的甘薯漿加入3L經(jīng)過離心獲得酶液，50°C作用2h后粘度下降率為89.95%。實施例7赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)接種于20L經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基后，30°C，130rpm培養(yǎng)5天后，300g液化并經(jīng)過高溫后的甘薯漿加入6L經(jīng)過離心獲得酶液，50°C作用2h后粘度下降率為91.26%。其中實施例3-7中所述 所述的經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基是(g/L):玉米芯20，ΚΗ2Ρ042.0, ΝΗ4Ν034.5，MgSO40.15，CaCl20.3，F(xiàn)eSO4.7Η200.0005，ZnSO4.7Η200.0014，MnSO4.H2O0.0016, COCl2.6Η200.0016, Tween803.3, ρΗ6.5。
權(quán)利要求
1.一種降粘酶系菌株，其特征在于，其分類命名為赭綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge),保藏于荷蘭微生物菌種保藏中心,保藏號為:CBS131817。
2.權(quán)利要求1所述的降粘酶系菌株赫綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge)用于發(fā)酵產(chǎn)生降粘酶并應(yīng)用于塊莖類燃料乙醇發(fā)酵降粘預處理中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的塊莖類優(yōu)選是鮮甘薯。
4.一種用權(quán)利要求1所述的赫綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)產(chǎn)降粘酶的降粘方法，其特征在于所述方法包括: (1).打漿:甘薯塊莖原料洗凈、打漿； (2).液化:按照90 150KNU/kg淀粉在甘薯漿中添加α-淀粉酶，80 90°C液化至碘反應(yīng)為紅棕色，冷卻至室溫后按所需的料水比添加自來水； (3).高溫處理:液化后將甘薯漿在115°C高溫下作用20min； (4).預處理:溫度降低至30 50°C時，每公斤甘薯漿中添加40mL降粘酶，50°C作用2h ； 其中，降粘酶即由赭綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)發(fā)酵后經(jīng)過離心，上清液再經(jīng)過0.22 μ m過濾器過濾獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降粘方法,其特征在于，所述的赭綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge)發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):玉米芯 20，ΚΗ2Ρ042.0，ΝΗ4Ν034.5，MgSO40.15，CaCl20.3， FeSO4.7Η200.0005，ZnSO4.7Η20 0.0014，MnSO4.H2O 0.0016，COCl2.6Η200.0016，Tween 803.3，pH 6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降粘方法，其特征在于，所述的赭綠青霉(Penicilliumochrochloron Biourge)發(fā)酵的發(fā)酵條件為 30°C, 130rpm, 5 天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)降粘酶系的菌種及其應(yīng)用。本發(fā)明篩選出的一株降粘酶系高產(chǎn)菌株，命名為CMC-37，該菌株菌落為藍綠色，菌絲有橫隔，其分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，形成帚狀體。其分類名為赭綠青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)，保藏號為CBS131817。本發(fā)明菌株利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯可以高產(chǎn)降粘酶系，作用于鮮甘薯粘度下降率高達91.26%，作用明顯，成本低廉。有效解決制約我國薯類原料發(fā)酵的成本問題，大幅度提升我國薯類原料發(fā)酵的可行性和經(jīng)濟性。
文檔編號C12N9/00GK103146583SQ201210234738
公開日2013年6月12日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者趙海, 靳艷玲, 方揚, 黃玉紅 申請人:中國科學院成都生物研究所