專利名稱：玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于抗病育種領域，具體涉及玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法。
背景技術：
玉米彎抱菌葉斑病(Corn Curvularia Leaf Spot Disease)是20世紀八十年代中后期在華北地區(qū)發(fā)生的一種危害較大的新病害，主要危害葉片，也危害葉鞘和苞葉。抽雄后病害迅速擴展蔓延，植株布滿病斑，葉片提早干枯，一般減產20 30%，嚴重地塊減產50%以上，甚至絕收。玉米彎孢菌葉斑病的病原菌為新月彎孢菌(Curvularia lunata(Wakker)Boed) 和不等彎孢霉(Curvularia inaeguacis),屬半知菌亞門彎孢霉屬。對玉米彎孢菌葉斑病的防治主要是抗病育種、耕作栽培、化學藥劑等方法，其中培育抗病品種是最經濟有效的方法。在抗玉米彎孢菌葉斑病育種中，對其抗病性的鑒定主要是采用人工接種彎孢菌孢子懸浮液，然后利用病斑數(shù)、產孢量等病情指數(shù)進行抗性評價的方法(王宏等.沈陽農業(yè)大學學報，2000，31 (5) :476-478 ;趙來順等.河北農業(yè)大學學報，1995，18 (4) :36-38)，這種鑒定方法工作量較大，且易受其他病害及地域的影響(刁毅等.南方農業(yè)學報，2011，42(2)161-163 ;冷廷瑞等.現(xiàn)代農業(yè)科技，2010，(17) :159-161,163);其他的抗病性鑒定方法是采用同工酶分析、酶聯(lián)免疫檢測等，這些方法雖然精確，但步驟繁瑣，成本較高，難以進行大規(guī)模的鑒定和篩選，因此迫切需要尋找一種簡單可靠、且可在室內鑒定玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的方法。新月彎孢菌(Curvularia lunata (Wakker) Boed)毒素是玉米彎孢菌葉斑病的主要致病因子，是植物病程中起著決定作用的有毒物質，在玉米彎孢菌葉斑病病害的發(fā)生、發(fā)展過程中具有明顯的致病作用(李富華等.植物保護，2004，30 (6) :5-10)。經新月彎孢菌毒素處理后，玉米葉片組織結構明顯受到傷害，細胞壁結構斷裂，細胞膜結構破裂，基粒和基質片層釋放，線粒體內含物消解，發(fā)生空泡化，從而嚴重干擾葉片的正常光合作用和呼吸作用(張欣芳等.玉米科學，2009，17 (6) : 118-120，123)。植物的保護反應是復雜的新陳代謝過程，植物受到病原物侵染后，抗、感品種之間苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,簡稱為PAL)、多酌 氧化酶(polyphenoloxidase,簡稱為PP0)、過氧化物酶(horseradish peroxidase,簡稱為POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,簡稱為SOD)以及其它重要酶類的活性變化有明顯差異(Shoresh 等.Plant Physiology,2008,147 :2147-2163 ；Segarra 等 Proteomics, 2007，7(21) :3943-3952 ;何祖華等.植物生理學報，2001，27 (4) :281-290)。用玉米彎孢菌葉斑病毒素處理玉米幼苗后，抗病品種的PAL和POD對玉米彎孢菌葉斑病毒素較感病品種敏感，抗病品種的酶峰出現(xiàn)時間提前或峰值大于感病品種；而玉米彎孢菌葉斑病毒素能刺激感病品種SOD活性增加，抑制了抗病品種的SOD活性(陳捷等.植物病理學報，2002，32 (I)43-48)。因此，經新月彎孢菌毒素誘導處理后，保護反應中酶系活性的變化也可作為玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的鑒定和篩選的指標。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法。利用該方法可在室內完成抗彎孢菌葉斑病玉米自交系的鑒定和篩選，打破季節(jié)限制并減少田間抗病性鑒定的繁雜工作，提高工作效率。本發(fā)明所提供的玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法，按照如下方法進行(I)將3葉期的玉米自交系幼苗自根莖處剪下，放入濃度為20 IOOii g/mL玉米新月彎孢菌毒素溶液中，利用真空泵產生的200mmHg負壓力進行滲透6 48h，然后于25°C恒溫箱中靜置18h ； (2)取步驟(I)中經過玉米新月彎孢菌毒素處理過的玉米自交系幼苗的第3片葉(上部葉片)，剪去葉尖，取葉片中上部，用濾紙吸干水，稱取葉片I. Og和石英砂0. Ig,放入研缽中，加入pH 8. 8,0. 05mol/L的硼酸鈉緩沖液2. 0ml，研磨成勻漿，將勻漿轉入離心管中，并用硼酸鈉緩沖液2. OmL沖洗研缽上的殘留部分，轉入離心管，攪動5min;然后在4°C、12000g下離心30min，取上清液；將3ml上清液用pH 8. 8,0. 05mol/L硼酸鈉緩沖液稀釋成15ml，得稀釋的上清液，_4°C下保存；其中所述的硼酸鈉緩沖液中含有5mmol/L巰基乙醇和lmmol/L EDTA ;所述的上清液為苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的混合粗提液；(3)分別測定步驟(2)中所得的稀釋的上清液中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性(U);并計算出每種酶的比活力，比活力計算公式為比活力=酶活性/蛋白含量，再按照下述公式分別計算玉米自交系抗病性的抗性等級數(shù)值Xp X2和X3,Y1 = 22. 13Xl+35. 17(公式 I)；y2 = 50. 17x22-136. 9x3+222. 5(公式 2)；y3 = -4. 432xs+38. 04(公式 3)；其中yi為苯丙氨酸解氨酶(PAL)的比活力；y2為過氧化物酶(POD)的比活力；其中y3為超氧化物歧化酶(SOD)的比活力；(4)計算X1' X2和X3的平均值X,即X = (XjXfX3)/^,選取x彡3的玉米自交系，即為抗玉米彎孢菌葉斑病的自交系。上述方法步驟(I)中所述的玉米新月彎孢菌毒素溶液，按照如下方法制備(參見肖淑芹等.玉米科學，2006，14 (4) =138-140):將玉米新月彎孢菌菌株培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上(PDA培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為每IL蒸餾水中含馬鈴薯200g和葡萄糖15g)，培養(yǎng)7d后用打孔器(0=0. 7cm)在培養(yǎng)的菌落上打孔，將6個新月彎孢菌菌片接于IOOmL改良Fries液體培養(yǎng)基(其組成成分及其比例為每IL蒸餾水中含蔗糖20g、酒石酸氨5g、NH4N03lg、KH2P04lg、氯化鈉0. lg、七水硫酸鎂0. 5g、氯化鈣0. 13g和酵母膏l(xiāng)g，pH6. 2)中，于25°C、120rpm下培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)10 15d ;用活性炭柱(4cmX46. 5cm,顆?；钚蕴?0g)過濾上述液體培養(yǎng)基，流速為4. 2mL/min，用300mL甲醇洗脫炭柱3次，每次IOOmL ;每次甲醇洗脫后再用IOOmL蒸餾水洗滌，混合3次甲醇洗脫液，于60 70°C水浴鍋中濃縮至大約IOmL ;在25 65°C恒溫箱中蒸干，獲得漿狀物；將所得漿狀物溶于50mL溫度在25 37°C的甲醇中；過濾，除去不溶物，取濾液，加3倍體積的氯仿混合，在25°C下靜置過夜，蒸干甲醇、氯仿溶解層，獲得黃褐色晶體，即為新月彎孢菌粗毒素；加蒸餾水溶解，制成濃度為20 IOOy g/mL新月彎孢菌毒素溶液。上述方法步驟(I)中所述的3葉期的玉米自交系幼苗，按照如下方法獲得選擇飽滿的自交系的種子，經0. I % HgCl2消毒lOmin，用蒸餾水沖洗干凈，于25°C下吸脹24h，轉移到墊有6層濕潤濾紙的白磁盤中，于28°C/25°C (晝/夜)下暗萌發(fā)72h;萌發(fā)后轉移至光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°C /25°C (晝/夜)，光照強度為200mmol/m2 s，每天光照時間12h，培養(yǎng)2 3周，得3葉期的玉米自交系幼苗。上述方法步驟(3)中所述的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定，按照Koukol等(Koukol J 等 Journal of Biology Chemistry, 1961, 236 :2692-2698)公開的方法進行。 取上述方法步驟(2)中所得的稀釋的上清液lml，然后以L-苯丙氨酸為底物，在290nm處測定苯丙氨酸解氨酶的酶活；以每小時使OD29tl增加0. 01的酶量定為一個酶活單位(U)，計算苯丙氨酸解氨酶的比活力。上述方法步驟(3)中所述的過氧化物酶(POD)活性的測定，按照愈創(chuàng)木酚法(參見張志良等.植物生理學實驗指導[M].北京高等教育出版社，2003，123-124)進行；取上述方法步驟(2)中所得的稀釋的上清液lml,然后以愈創(chuàng)木酹(guaiacol)作底物,在470nm處測OD值；以每分鐘每毫克蛋白OD■增加值表示酶的活性，計算過氧化物酶的比活力。上述方法步驟(3)中所述的超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定，取步驟(2)中稀釋的上清液0. 1ml，按照氮藍四唑(NBT)光化還原法測定SOD活力(參見王愛國等.植物生理學報，1983,9(1) :77-84)。找出抑制NBT 50%光化學還原的酶液量，定為一個酶活單位(U)，計算超氧化物歧化酶的比活力。上述方法步驟(3)中所述蛋白含量的測定方法取步驟(2)中的稀釋的上清液，利用考馬斯亮蘭G-250微量法測定其蛋白含量(具體方法參見張志良等.植物生理學實驗指導[M].北京高等教育出版社，2003，159-160)。玉米自交系彎孢菌葉斑病性評價標準(參見王宏等.沈陽農業(yè)大學學報，2000，31(5) :476-478 ;趙來順等.河北農業(yè)大學學報，1995，18 (4) :36-38)為抗病病斑類型為R或M，嚴重度I級；中抗病斑類型為R或M，嚴重度2級；中感病斑類型S或M，嚴重度3級；感病病斑類型S，嚴重度4級。上述方法步驟(3)中所述的PAL、POD及SOD比活力與抗病性的回歸方程的建立方法以典型的抗病玉米自交系BC2433，中抗玉米自交系178，中感玉米自交系H21，感病玉米自交系掖478為材料，按照前述方法測得新月彎孢菌毒素處理后玉米幼苗的PAL、POD和SOD比活力值。以抗性等級為X，I表示感病自交系抗性，2表示中感自交系抗性，3表示中抗自交系抗性，4表示抗性自交系抗性，以PAL、POD和SOD比活力數(shù)據為y，先利用數(shù)據分析軟件EXcel2007做出表示X和y關系的散點圖，初步判斷x和y關系，再利用DPS (DataProcessing System,即DPS統(tǒng)計軟件,該軟件是實驗設計及統(tǒng)計分析的多功能統(tǒng)計分析軟件)7. 05根據散點圖進行線性回歸或二次多項式回歸分析，建立PAL、POD及SOD比活力與抗病性的回歸方程，結果分別為Y1 = 22. 13Xl+35. 17(公式 I)；
y2 = 50. 17 x22_136. 9x3+222. 5(公式 2)；y3 = -4. 432xs+38. 04(公式 3)；其中yi為苯丙氨酸解氨酶(PAL)的比活力；y2為過氧化物酶(POD)的比活力；其中y3為超氧化物歧化酶(SOD)的比活力；其中X1、X2和X3為玉米自交系抗病性的抗性等級數(shù)值。對建立的3個回歸方程是否成立進行假設檢驗，結果顯示PAL比活力與玉米自交系抗病性存在極顯著線性正相關關系，線性方程Y1 = 22. 13Xl+35. 17 (R2=0. 955，P < 0. 01) ；P0D比活力與抗病性存在曲線正相關，回歸方程為y2 =50. 17x22-136. 9x3+222. 5 (R2 = 0. 996，P = O. 058) ；S0D比活力與玉米抗病性存在極顯著線性負相關，回歸方程為 y3 = -4. 432xs+38. 04 (R2 = 0. 961，P < 0. 01)。
所述的估算玉米自交系彎孢菌葉斑病的抗性水平的方法為根據PAL、P0D及SOD比活力與抗病性的回歸方程計算出Xl、X2和X3，取其平均值X，根據I < X < 2表示為感病自交系、2 ^ X < 3表不中感自交系，3 ^ X < 4表不中抗自交系，X ^ 4表不抗病自交系判斷玉米自交系的抗性。選擇X > 3的，即為抗玉米彎孢菌葉斑病的自交系。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點或有益效果(1)本發(fā)明方法準確、可靠。(2)本發(fā)明方法可在室內完成玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的鑒定和篩選，無需在田間進行抗病性鑒定，不受外界環(huán)境條件的限制。(3)本發(fā)明方法在苗期進行抗病性鑒定，無需在成株期鑒定，打破了季節(jié)限制，并且縮短了鑒定所需的時間。(4)本發(fā)明減少田間抗病性鑒定的繁雜工作，工作效率高。
具體實施例方式實施例I玉米新月彎孢菌毒素溶液的制備I.將玉米新月彎孢菌菌株(該菌株由青島農業(yè)大學植物病理教研室鄢洪海老師分離鑒定)培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上(其組成成分及其重量比為每IL蒸餾水中含馬鈴薯200g和葡萄糖15g)，培養(yǎng)7d后用打孔器= 0.7cm)在培養(yǎng)的菌落上打孔，將6個新月彎孢菌菌片接于IOOmL改良Fries液體培養(yǎng)基中(其組成成分及其重量比為每IL蒸餾水中含蔗糖20g、酒石酸氨5g、NH4NO3 lg、KH2PO4 lg、氯化鈉0. lg、七水硫酸鎂0. 5g、氯化鈣0. 13g和酵母膏l(xiāng)g, PH6. 2)，于25°C、120rpm下培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)15d ;用活性炭柱(4cmX 46. 5cm，顆?；钚蕴?0g)過濾上述液體培養(yǎng)基,流速為4. 2mL/min,用300mL甲醇洗脫炭柱3次,每次IOOmL ;每次甲醇洗脫后再用IOOmL蒸餾水洗滌，混合3次甲醇洗脫液，于60 70°C水浴鍋中濃縮至大約IOmL ;在37°C恒溫箱中蒸干，獲得漿狀物；將所得漿狀物溶于50mL 37°C甲醇中；紗布過濾，除去不溶物，取濾液，加3倍體積的氯仿混合，在25°C下靜置過夜，蒸干甲醇、氯仿溶解層，獲得黃褐色晶體，即為新月彎孢菌粗毒素，加蒸餾水溶解，制成濃度為50 u g/mL玉米新月彎孢菌毒素溶液。實施例2玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定對比試驗按照如下方法進行試驗材料10個玉米自交系齊319、Q58、昌7-2、鄭58、美26800、丹340、鄭0510、陜 814、189、丹黃 25。試驗設計
試驗方法(一)室內幼苗鑒定試驗(I)選擇飽滿的自交系的種子，經0. I % HgCl2消毒lOmin，用蒸餾水沖洗干凈，于25°C下吸脹24h，轉移到墊有6層濕潤濾紙的白磁盤中于28V /25V (晝/夜)下暗萌發(fā)72h ;萌發(fā)后轉移至光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°C /25°C (晝/夜)，光照強度為200mmol/m2 s,每天光照時間12h,培養(yǎng)2 3周,得3葉期的玉米自交系幼苗。(2)選擇均勻一致的3葉期的玉米自交系幼苗自根莖處剪下放入50mL試管中，每個試管5株，加實施例I中制備的濃度為50 u g/mL新月彎孢菌毒素溶液50mL，200mmHg負壓力下滲透12h，25°C恒溫箱中靜置18h，取第3葉進行酶活性的檢測。(3)將(2)中經過新月彎孢菌毒素溶液處理的玉米幼苗的第3葉，剪去葉尖，取葉片中上部，用濾紙吸干水后，稱取I. Og葉片，加pH8. 8、0. 05mol/L硼酸鈉緩沖液(內含5mmol/L巰基乙醇，lmmol/L EDTA) 2. 0ml，加石英砂0. Ig研磨成勻漿，將勻漿轉入離心管， 用2. OmL硼酸鈉緩沖液沖洗殘留部分，轉入離心管；攪動5min，然后在4°C、12 000 Xg下離心30min，取上清液；再取上清液3ml用pH8. 8,0. 05mol/L硼酸鈉緩沖液稀釋到15ml，得稀釋的上清液(或稱酶液)，_4°C冰柜中保存。(4) (a)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定取步驟(3)中稀釋上清液1ml，按照Koukol 等(Koukol J 等 Journal of Biology Chemistry, 1961, 236 :2692-2698)所述的方法進行PAL活性的測定，具體結果見表I。表I玉米自交系苯丙氨酸解氨酶活性測定結果
權利要求
1.玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法，按照如下方法進行 (1)將3葉期的玉米自交系幼苗自根莖處剪下，放入濃度為20 100ii g/mL玉米新月彎孢菌毒素溶液中，利用真空泵產生的200mmHg負壓力進行滲透6 48h，然后于25°C恒溫箱中靜置18h ； (2)取步驟(I)中經過玉米新月彎孢菌毒素處理過的玉米自交系幼苗的第3片葉，剪去葉尖,取葉片中上部,用濾紙吸干水,稱取葉片I. Og和石英砂0. lg，放入研缽中，加入pH8. 8,0. 05mol/L的硼酸鈉緩沖液2. 0ml，研磨成 勻漿 ，將勻漿轉入離心管中，并用硼酸鈉緩沖液2. OmL沖洗研缽上的殘留部分，轉入離心管，攪動5min ;然后在4°C、12000g下離心30min，取上清液；將3ml上清液用pH8. 8,0. 05mol/L硼酸鈉緩沖液稀釋成15ml，得稀釋的上清液，_4°C下保存；其中所述的硼酸鈉緩沖液中含有5mmol/L巰基乙醇和lmmol/LEDTA ；所述的上清液為苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的混合粗提液； (3)分別測定步驟(2)中所得的稀釋的上清液中苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性；并計算出每種酶的比活力，比活力計算公式為比活力=酶活性/蛋白含量，再按照下述公式分別計算玉米自交系抗病性的抗性等級數(shù)值Xl、X2和x3， Y1 = 22. 13Xl+35. 17(公式 I)；y2 = 50. 17x22-136. 9x3+222. 5(公式 2)； y3 = -4. 432xs+38. 04(公式 3)； 其中Y1為苯丙氨酸解氨酶(PAL)的比活力；y2為過氧化物酶(POD)的比活力；其中y3為超氧化物歧化酶(SOD)的比活力； (4)計算XpX2和X3的平均值X,即X = (XdXfX3)/^,選取X > 3的玉米自交系，即為抗玉米彎孢菌葉斑病的自交系。
2.按照權利要求I所述的早期鑒定方法，其特征在于其步驟(I)中所述的玉米新月彎孢菌毒素溶液，按照如下方法制備將玉米新月彎孢菌菌株培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d后用打孔器在培養(yǎng)的菌落上打孔，將6個新月彎孢菌菌片接于IOOmL改良Fries液體培養(yǎng)基中，于25°C、120rpm下培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)10 15d ;用活性炭柱過濾上述液體培養(yǎng)基，流速為4.2mL/min，用300mL甲醇洗脫炭柱3次，每次IOOmL ;每次甲醇洗脫后再用IOOmL蒸餾水洗滌，混合3次甲醇洗脫液，于60 70°C水浴鍋中濃縮至大約IOmL ;在25 65°C恒溫箱中蒸干，獲得漿狀物；將所得漿狀物溶于50mL溫度在25 37°C的甲醇中；過濾，除去不溶物，取濾液，加3倍體積的氯仿混合，在25°C下靜置過夜，蒸干甲醇、氯仿溶解層，獲得黃褐色晶體，即為新月彎孢菌粗毒素；加蒸餾水溶解，制成濃度為20 100 u g/mL新月彎孢菌毒素溶液；其中所述的PDA培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為每IL蒸餾水中含馬鈴薯200g和葡萄糖15g ;所述的改良Fries液體培養(yǎng)基組成成分及其比例為每IL蒸餾水中含蔗糖20g、酒石酸氨5g、NH4NO3 lg、KH2PO4 lg、氯化鈉0. lg、七水硫酸鎂0. 5g、氯化鈣0. 13g和酵母膏l(xiāng)g, pH6. 20
3.按照權利要求I所述的早期鑒定方法，其特征在于其步驟(3)中所述的苯丙氨酸解氨酶活性的測定，取其步驟(2)中所得的稀釋的上清液lml，然后以L-苯丙氨酸為底物，在290nm處測定苯丙氨酸解氨酶的酶活；以每小時使OD29tl增加0. 01的酶量定為一個酶活單位，計算苯丙氨酸解氨酶的比活力。
4.按照權利要求I所述的早期鑒定方法，其特征在于其步驟(3)中所述的過氧化物酶活性的測定，取其步驟(2)中所得的稀釋的上清液lml，然后以愈創(chuàng)木酚作底物，在470nm處測OD值；以每分鐘每毫克蛋白0D470增加值表示酶的活性，計算過氧化物酶的比活力。
5.按照權利要求I所述的早期鑒定方法，其特征在于其步驟(3)中所述的超氧化物歧化酶)活性的測定，取其步驟(2)中的稀釋的上清液0. 1ml，按照氮藍四唑光化還原法測定SOD活力，找出抑制NBT 50%光化學還原的酶液量，定為一個酶活單位，計算超氧化物歧化酶的比活力。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于作物抗病育種領域的一種玉米自交系彎孢菌葉斑病抗性的早期鑒定方法，包括將3葉期玉米自交系幼苗的葉片用玉米新月彎孢菌毒素溶液處里，然后用硼酸鈉緩沖液混合提取葉片中的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶粗提液；再分別測定苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活，并計算比活力；再按照公式計算抗性值，接著計算抗性值的平均數(shù)，如果抗性值的平均數(shù)大于3，即為抗玉米彎孢菌葉斑病的自交系。本發(fā)明方法準確、可靠；其次，本發(fā)明方法可在室內完成鑒定和篩選，不受外界環(huán)境條件的限制；此外，本發(fā)明方法在苗期進行抗病性鑒定，不受季節(jié)限制，并且縮短了鑒定所需的時間；本發(fā)明方法工作效率高。
文檔編號C12Q1/28GK102747135SQ20121025246
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權日2012年7月20日
發(fā)明者葉克蓯, 宋希云, 張恩盈, 裴玉賀, 郭新梅 申請人:青島農業(yè)大學