專利名稱：密碼子優(yōu)化的7β-羥基類固醇脫氫酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種按大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化的的7β_羥基類固醇脫氫酶σβ-HSDH)基因。
背景技術(shù)：
熊膽是名貴的中藥材，用于治療膽結(jié)石疾病以及各種急性、慢性肝病，具有良好的治療效果。熊去氧膽酸(3 α -7 β - 二羥基-5 β -膽烷酸，以下簡(jiǎn)稱UDCA)以及牛磺/甘氨熊去氧膽酸(T/GUDCA)是中藥材熊膽的主要有效成份。然而，由于中藥熊膽粉主要的獲取方式為“活熊引流取膽”，這有違野生動(dòng)物保護(hù)法。并且被認(rèn)為是非常不人道的獲取方式。另外，化學(xué)合成法過(guò)程復(fù)雜、得率較低。然而動(dòng)物膽汁中存在眾多膽酸類物質(zhì)，如牛、羊膽酸、鵝去氧膽酸、熊膽酸、豬膽酸、豬去氧膽酸等，這些物質(zhì)可以通過(guò)適當(dāng)?shù)纳锱嘤D(zhuǎn)化成UDCA及其衍生物，其中在雞膽汁中鵝去氧膽酸(CDCA)以及牛磺/甘氨鵝去氧膽酸(Τ/ G⑶CA)含量豐富。⑶CA與UDCA的差別僅在于7位羥基的差向異構(gòu)，利用7 α、7 β -羥基類固醇脫氫酶(7 α、7 β -HSDH)可以將CDCA、T/GCDCA轉(zhuǎn)化為UDCA、T/GUDCA。來(lái)自撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)的 7 α、7 β-HSDH 酶可以實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化過(guò)程。因此，為了快速獲取大量的和高純度的7 β -HSDH酶，本發(fā)明提出通過(guò)密碼子優(yōu)化的7β-HSDH酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)可以得到大量產(chǎn)物，而為了得到有活性、結(jié)構(gòu)完整的目的蛋白，分析基因中使用頻率較低的密碼子并進(jìn)行替換從而得到優(yōu)化的基因序列是十分必要的。另外，原核表達(dá)時(shí)采用原核表達(dá)載體pGEX-6p-l與目的基因進(jìn)行GST融合表達(dá)，得到的融合表達(dá)蛋白往往具有正確的空間結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的酶活，并且GST融合蛋白純化方法簡(jiǎn)單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供密碼子經(jīng)過(guò)改造且mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的密碼子優(yōu)化的7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。該優(yōu)化基因在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，按照大腸桿菌的偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化，使其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量和純度顯著提高；本發(fā)明的目的之二是提供含密碼子優(yōu)化的7 β -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體 pGEX-6p-l-7 β -HSDH ；本發(fā)明的目的之三是提供含密碼子優(yōu)化的7 β -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體的大腸桿菌。本發(fā)明采用密碼子優(yōu)化的7β_羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達(dá)載體pGEX-6p-l在大腸桿菌中GST融合表達(dá)，在短時(shí)間內(nèi)可以生成大量有活性、結(jié)構(gòu)完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡(jiǎn)單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。


圖I為本發(fā)明優(yōu)化前后7 β -HSDH基因序列比較圖2Α為本發(fā)明7 β -HSDH基因優(yōu)化前表達(dá)的7 β -羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳2Β為本發(fā)明7 β -HSDH基因優(yōu)化后表達(dá)的7 β -羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳3為本發(fā)明不同pH條件下優(yōu)化的7 β -HSDH催化⑶CA氧化的酶活比較
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例和附圖僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明不限于下述實(shí)施方式或?qū)嵤├?，凡不違背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。 實(shí)施例I :7 β -羥基類固醇脫氫酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)和合成稀有密碼子的分析稀有密碼子主要通過(guò)軟件Ε. coli Codon Usage Analysis2. O(Morris Maduro,參考Analysis and Predictions from Escherichia coli sequencesin:Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2，Ch. 114:2047-2066，1996，Neidhardt FCed.，ASM press, Washington, D. C.)分析得到在大腸桿菌中的使用相對(duì)頻率低于閾值(10%。)的密碼子。優(yōu)化稀有密碼子根據(jù)不同密碼子在大腸桿菌中的使用頻率將使用頻率低于閾值的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如下本發(fā)明所用的優(yōu)化密碼子
權(quán)利要求
1.密碼子優(yōu)化的7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNO. I所示。
2.含權(quán)利要求I所述密碼子優(yōu)化的7β-羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pGEX-6p-l-7β -HSDH。
3.含權(quán)利要求2所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了密碼子優(yōu)化的7β-羥基類固醇脫氫酶基因、含所述優(yōu)化基因的重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-7β-HSDH和含所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌。本發(fā)明采用密碼子優(yōu)化的7β-羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達(dá)載體pGEX-6p-1在大腸桿菌中GST融合表達(dá)，在短時(shí)間內(nèi)可以生成大量有活性、結(jié)構(gòu)完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡(jiǎn)單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102827847SQ20121026006
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者王伯初, 婁德帥, 譚君, 祝連彩, 季慶治, 岑小惜, 劉宜善 申請(qǐng)人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司