一種總膽汁酸測定試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測領域，具體的，涉及一種總膽汁酸測定試劑盒。
【背景技術】
[0002] 1974年挪威科明公司采用提純的3a-羥類固醇脫氫酶（3a-HSD)成功地生產(chǎn)出 第一代膽汁酸酶法試劑，使膽汁酸的測定真正進入臨床領域。此后，挪威科明和日本第一化 學將第一代試劑改進試劑組分，采用啟動試劑，發(fā)展了第二代膽汁酸測定試劑，之后，日本 第一化學從假單胞菌屬中提純出的3-氧-5P-類留醇-A 4脫氫酶（A 4DH)與3a-HSD偶 聯(lián)開發(fā)出第三代膽汁酸測定試劑盒。
[0003] 中國專利CN1281983申請公開了一種血清總膽汁酸測定試劑，該試劑是由含有硝 基四氮唑藍、氧化型輔酶I、黃遞酶、丙酮酸鈉、磷酸鹽的緩沖液構成的試劑I;和由含有 3a-HSD、人血清白蛋白、EDTA、磷酸鹽緩沖液的溶液構成的試劑II組成。其測試原理是利用 3a-HSD，黃遞酶將膽汁酸分子脫下的氫傳遞到硝基四氮唑藍，后者還原后生成藍色的化合 物，供比色檢測分析。該專利中提供的試劑，采用黃遞酶和硝基四氮唑藍組合，易污染比色 杯及堵塞生化分析儀管道，其測定靈敏度也偏低，受血液中還原性物質(zhì)及酶類的干擾嚴重； 且試劑為凍干粉制劑，試劑復溶后的穩(wěn)定時間短，臨床使用不方便。
[0004] 中國專利申請CN1378077A公開了 一種總膽汁酸測定方法和測定試劑，提供了 一種總膽汁酸測定的方法即酶循環(huán)法，其反應原理是利用3a-HSD和硫代氧化型輔酶 (Thio-NAD)特異性氧化膽汁酸，生成3-酮類固醇和還原性硫代氧化型輔酶（Thio-NADH); 在3a-HSD存在的條件下，3-酮類固醇和還原型輔酶I(NADH)又生成膽汁酸和氧化型 輔酶（NAD)每一次循環(huán)比原來的反應提高一倍的靈敏度，如此往復循環(huán)，從而放大微量 的膽汁酸，產(chǎn)生大量的水溶性非染料的硫代還原型輔酶I(Thio-NADH)，最后測定生成的 Thio-NADH的吸光度變化，測得膽汁酸的含量。
[0005] 該發(fā)明使用方便、消除干擾明顯、靈敏度高，對生化儀器管道無污染，使其在膽汁 酸的準確、快速測定中有重要的意義。該發(fā)明中提供的試劑，在2_8°C開蓋使用狀態(tài)下，試劑 穩(wěn)定的時間較短；在2-8°C度密閉避光存儲的過程中，試劑穩(wěn)定性不理想，隨著放置時間的 延長，反應度會下降，試劑顏色由無色或淡黃色逐漸變成紅色。
[0006] 因此有必要開發(fā)一種新的具有良好穩(wěn)定性和檢測準確性的總膽汁酸測定試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的總膽汁酸測定試劑存在的穩(wěn)定性差的缺陷，提供一 種在2_8°C開蓋使用狀態(tài)下和在2_8°C度密閉避光存儲條件下持續(xù)穩(wěn)定的總膽汁酸測定試 劑盒。
[0008] 為達到以上目的，本發(fā)明提供了一種總膽汁酸測定試劑盒，所述試劑盒包括劑A 和試劑B，其中，試劑A的組成成分包括：Thio-NAD、緩沖液A、表面活性劑和穩(wěn)定劑A;試劑 B的組成成分包括：3a-HSD、還原型輔酶I、表面活性劑、緩沖液B和穩(wěn)定劑B;
[0009] 其中，所述緩沖液A選自由磷酸鹽緩沖液、焦磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸 緩沖液、碳酸鹽緩沖液、醋酸緩沖液、2-N-嗎啡乙磺酸緩沖液、咪唑緩沖液所組成的組中的 一種；
[0010] 所述緩沖液B選自由2-(環(huán)己胺）乙磺酸緩沖液、3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸緩沖液、 3-(環(huán)己胺）-2-羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三（羥甲基）-3-氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三 羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液和三乙醇胺緩沖液所組成的組中的一種。
[0011] 可選的，所述表面活性劑選自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇對異辛基苯基醚、 聚乙二醇單月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烴基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙 二醇醚所組成的組中的一種或兩種；所述穩(wěn)定劑A選自由NaCl、KC1、MgCl2、EDTA. 2Na和 EDTA. 2K所組成的組中的一種或多種。
[0012] 可選的，所述穩(wěn)定劑B選自半胱氨酸、L-還原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、 L-氧化型谷胱甘肽二鈉鹽、巰基乙醇、腺苷酸、鳥苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺苷 5' -二磷酸鈉鹽、腺苷5' -二磷酸鉀鹽、腺苷-3'，5' -環(huán)單磷酸鈉鹽、鳥苷-3'，5' -環(huán)單磷酸 鈉鹽、鳥嘌呤核苷-5' -二磷酸二鈉、胞嘧啶核苷酸二鈉、尿苷二磷酸二鈉和牛血清白蛋白 所組成的組中的一種或多種。
[0013] 可選的，在所述試劑A中，Thio-NAD的濃度為0.01-10mmol/L，優(yōu)選為0.5-5mmol/ L;緩沖液A的終濃度為5-500mmol/L，優(yōu)選為10-100mm〇l/L;表面活性劑的濃度按質(zhì)量體 積百分含量計為0. 05-20 %，優(yōu)選為2-10% ;穩(wěn)定劑A的濃度為0.l-20g/L，優(yōu)選為I-IOg/ L0
[0014] 可選的，在所述試劑B中，3a-HSD的濃度為0.5-100KU/L，優(yōu)選為5-20KU/L;還原 型輔酶I的濃度為〇. 〇l-l〇g/L，優(yōu)選為0. 5-6g/L;緩沖液B的終濃度為5-500mmol/L，優(yōu)選 為10-100_〇1/1;表面活性劑的濃度以質(zhì)量體積百分含量計為0.05-20%，優(yōu)選為1-15%; 穩(wěn)定劑B的濃度為l-20g/L，優(yōu)選為3-15g/L。
[0015] 可選的，所述試劑A的pH為3. 0-5. 5,試劑B的pH為8. 5-10. 0。
[0016] 可選的，緩沖液A為甘氨酸緩沖液和2-N-嗎啡乙磺酸中的至少一種；表面活性 劑為聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇對異辛基苯基醚中的至少一種；穩(wěn)定劑A為MgCljP EDTA. 2Na中的至少一種；
[0017] 可選的，所述緩沖液B為N-三（羥甲基）-3_氨基丙烷磺酸或3-三羥甲基甲 胺-2-羥基丙磺酸，所述穩(wěn)定劑B為腺苷-3'，5' -環(huán)單磷酸鈉鹽、鳥苷-3'，5' -環(huán)單磷酸 鈉鹽和半胱氨酸中的至少一種。
[0018] 可選的，所述試劑盒還包括校準品，所述校準品的組成成分包括基質(zhì)、純品及穩(wěn)定 劑C;其中，所述基質(zhì)為緩沖液A、緩沖液B、人血清、牛血清、牛血清白蛋白中的一種或多種； 所述純品為膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、鵝脫氧膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸鈉、甘氨鵝脫氧 膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鈉和牛黃鵝脫氧膽酸鈉中的一種或多種；所述穩(wěn)定劑C 為MgCl2、NaCl、KCl、CaCl2、螯合劑EDTA類、聚乙二醇類、二糖類和多元醇中的一種或多種。
[0019] 可選的，在所述校準品中，純品的濃度為40-60ymol/L;穩(wěn)定劑C的濃度為 1-lOOmmol/L;當所述基質(zhì)中含有緩沖液時，緩沖液的濃度為5-500mmol/L;當所述基質(zhì)中 含有人血清時，人血清的濃度按質(zhì)量體積百分含量計為0. 5-90%;當所述基質(zhì)中含有牛血 清時，牛血清的濃度按質(zhì)量體積百分含量計為0. 5-90%;當所述基質(zhì)中含有牛血清白蛋白 時，牛血清白蛋白的濃度按質(zhì)量體積百分含量計為0. 5-60 %。
[0020] 可選的，所述校準品的pH為6. 0-10. 0,優(yōu)選為6. 5-8. 5。
[0021] 可選的，所述試劑A和試劑B中還包括去干擾劑、抗氧化劑和防腐劑中的至少一 種。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在總膽汁酸的測定中的應用，包括，將待測樣本、試 劑A、試劑B按照3yL:210yL:70yL的體積比（可根據(jù)試劑中主要成分的濃度和檢測儀器 的不同，按比例進行用量的調(diào)整）混勻后靜置60-120秒，在測試溫度37°C、主波長405nm、 副波長660nm下，使用純化水和校準品進行線性校準，測量待測樣本中總膽汁酸的濃度。
[0023] 通過上述技術方案，本發(fā)明所提供的總膽汁酸測定試劑在2_8°C開蓋使用狀態(tài)下 的穩(wěn)定時間可以達到20-30天。在2-8°C密閉避光存儲過程中的穩(wěn)定時間可以達到10-15 個月。
【具體實施方式】
[0024] 下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給 出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技術人員在 不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0025] 本發(fā)明提供了一種總膽汁酸測定試劑盒，所述試劑盒包括：試劑A和試劑B，其中， 試劑A的組成成分包括：Thio-NAD、緩沖液A、表面活性劑和穩(wěn)定劑A;試劑B的組成成分包 括：3a-HSD、還原型輔酶I、表面活性劑、緩沖液B和穩(wěn)定劑B;
[0026] 其中，所述緩沖液A選自由磷酸鹽緩沖液、焦磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸 緩沖液、碳酸鹽緩沖液、醋酸緩沖液、2-N-嗎啡乙磺酸緩沖液、咪唑緩沖液所組成的組中的 一種；
[0027] 所述緩沖液B選自由2-(環(huán)己胺）乙磺酸緩沖液、3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸緩沖液、 3-(環(huán)己胺）-2_羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三（羥甲基）-3_氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三 羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液和三乙醇胺緩沖液所組成的組中的一種。
[0028] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒還包括校準品，所述校準品的組 成成分包括基質(zhì)、純品及穩(wěn)定劑C;其中，所述基質(zhì)為緩沖液A、緩沖液B、人血清、牛血清、牛 血清白蛋白中的一種或多種；所述純品為膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、鵝脫氧膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、 甘氨脫氧膽酸鈉、甘氨鵝脫氧膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鈉和牛黃鵝脫氧膽酸鈉中 的一種或多種；所述穩(wěn)定劑C為MgCl2、NaCl、KCl、CaCl2、螯合劑EDTA類、聚乙二醇類、二糖 類（例如：山梨