專利名稱：一種基于質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定布魯氏菌的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種布魯氏菌核酸指紋圖譜制備的方法，以及使用該方法，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行快速鑒定的方法。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)又稱地中海弛張熱，馬爾他熱，波浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病，主要通過皮膚、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴(yán)重。豬種布魯氏菌感染人較少見，犬種布魯氏菌感染人罕見，綿羊附睪種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌基本不感染人。其臨床特點(diǎn)為長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。1886年英國(guó)軍醫(yī)Bruce在馬爾他島從死于“馬爾他熱”的士兵脾臟中分離出“布魯氏菌”，首次明確了該病的病原體。1897年Wright與其同事發(fā)現(xiàn) 病人血清與布魯氏菌的培養(yǎng)物可發(fā)生凝集反應(yīng)，稱為Wright凝集反應(yīng)，從而建立了迄今仍用的血清學(xué)診斷方法。我國(guó)古代醫(yī)籍中對(duì)本病雖有描述，但直到1905年Boone于重慶對(duì)本病作正式報(bào)道。目前該病在世界分布，只有幾個(gè)國(guó)家消滅此病，而在中國(guó)的東北，華北，西北一帶有流行和分布，其它地區(qū)有散發(fā)，且日益廣泛和危害嚴(yán)重。對(duì)畜牧業(yè)和人類來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌是一類革蘭陰性的短小桿菌，兩端鈍圓，偶見兩極濃染，一般長(zhǎng)O. 4-1. 5um，寬O. 4^0. 8um，羊種布魯氏菌較小，長(zhǎng)O. 3^0. 6um，近似球狀，豬種布魯氏菌和牛種布魯氏菌呈桿狀。通常呈散在狀態(tài).很少成對(duì)或短鏈狀排列。該菌無鞭毛，無芽孢.光滑型有莢膜。常在細(xì)胞內(nèi)寄生。內(nèi)毒素是重要的致病物質(zhì)。布魯氏菌有強(qiáng)侵襲力，細(xì)菌可通過完整皮膚和粘膜進(jìn)入宿主。布魯氏菌有6個(gè)生物型，我國(guó)流行的是羊布魯氏菌，牛布魯氏菌和豬布魯氏菌三種，其中以羊布魯氏菌最常見。自然情況下，有60多種動(dòng)物可感染布魯氏菌，其主要是山羊，綿羊，牛和豬，以流產(chǎn)為主，孕期動(dòng)物最為宜感。人類對(duì)布魯氏菌易感，細(xì)菌進(jìn)入人體后，遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，發(fā)熱呈波浪式，如不治療，后果嚴(yán)重。布魯氏菌是需氧菌.營(yíng)養(yǎng)要求較高，需硫胺素.煙酸胺和酵母生長(zhǎng)素。葡萄糖.甘油和復(fù)合氨基酸可促進(jìn)布魯氏菌的生長(zhǎng)泛酸鈣和赤鮮醇也可促進(jìn)某些布魯氏菌的生長(zhǎng)；來自人或動(dòng)物的標(biāo)本最好接種在胰酶消化液或血液培養(yǎng)基中。在固體培養(yǎng)基上，菌落為無色.半透明.圓形.表面光滑.邊緣整齊.中央稍凸起.直徑約2 3_。有時(shí)可出現(xiàn)黏液樣或干燥的硬皮樣菌落；在血瓊脂平板上，表現(xiàn)不溶血。在液體培養(yǎng)基中，呈均勻混濁生長(zhǎng)，不形成菌膜；在柯氏染色法(沙黃與孔雀綠對(duì)染)培養(yǎng)基上，該菌為鮮紅色，其它雜菌被染成綠色。該菌對(duì)磺胺及鏈霉京.四環(huán)素、慶大霉索等均較敏感，面對(duì)青霉素及頭孢菌素則不敏感。根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)以及布魯斯菌以上生化特性，不難做出布魯氏菌病的初步診斷，但由于在臨床上小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0:157感染存在相似的癥狀，必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)才能對(duì)布魯氏菌病進(jìn)行最后確診。為了建立適合本病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的方法，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了大量研究，并取得了顯著的成績(jī)。先后建立了病原鑒定、熒光抗體中和檢等檢測(cè)方法。我國(guó)目前應(yīng)用虎紅和試管凝集的方法，它們的敏感性及特異性差，是國(guó)際貿(mào)易淘汰的技術(shù)，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，與我國(guó)實(shí)際檢測(cè)普查工作需求存在一定的矛盾。目前布魯氏菌病的診斷主要依靠針對(duì)脂多糖的血清學(xué)試驗(yàn)，特異性不強(qiáng)，常常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。而且，由于布病感染后2周血中才開始出現(xiàn)抗體，所以感染早期血清學(xué)診斷往往出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。以PCR為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)方法，對(duì)布病的早期診斷和傳染源的發(fā)現(xiàn)有重要意義。單重PCR檢測(cè)，當(dāng)引物針對(duì)的序列發(fā)生了突變時(shí)則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而針對(duì)同種病原的多重PCR檢測(cè)，因?yàn)獒槍?duì)的是多個(gè)基因，雖假陰性率降低，但操作比較復(fù)雜。近年來，已經(jīng)出現(xiàn)質(zhì)譜技術(shù)來檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)領(lǐng)域，其中質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)在于，組成遺傳物質(zhì)DNA的基本單元——四種核苷酸之間存在質(zhì)量差異，如 ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP 的分子量依次為 271. 2Da、247. 2Da、287. 2Da、327. IDa(其中ddTMP是經(jīng)過修飾的)，它們之間的最小分子量差異在16Da，完全可以通過質(zhì)譜進(jìn)行分 辨。使用質(zhì)譜能夠?qū)A基突變或多態(tài)位點(diǎn)(SNP)、插入/缺失(InDeI)、甲基化位點(diǎn)、基因定量、拷貝數(shù)變化(copy number variation, CNV)等多種DNA變化類型進(jìn)行檢測(cè)。已有一些公開文獻(xiàn)使用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行分類和鑒定，例如，中國(guó)專利申請(qǐng)CN102337223A、“產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法”，公開了一種檢測(cè)產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-T0F鑒定方法，其中從平板上挑取產(chǎn)黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，預(yù)處理得到粗蛋白溶液在色譜柱上分離純化，并在羧甲基陽(yáng)離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，各組分離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分判斷獲得蛋白的純度；割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，進(jìn)行MALDI-T0F鑒定。該方法僅適用于特定微生物，且需要多重蛋白純化過程，最終用MALDI-T0F鑒定特征蛋白Pc-Arctin，其過程繁瑣、適用面窄，不能實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜分類細(xì)菌或微生物的目的。中國(guó)專利申請(qǐng)200910157210、“一種李斯特菌屬細(xì)胞中脂肪酸組分的分析方法”公開了一種利用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)分析法針對(duì)細(xì)菌脂肪酸進(jìn)行分類的方法，包括李斯特菌復(fù)壯，用牛津瓊脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂平板分別分離和純化李斯特菌，培養(yǎng)單個(gè)典型菌落的李斯特菌并制成菌懸液，用甲醛滅活處理，把經(jīng)甲醛處理后的菌懸液平均分裝在離心管洗滌，用鹽酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)分析。雖然該方法打破傳統(tǒng)細(xì)菌分類學(xué)的局限，減少人為因素對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)分類帶來的誤差，同時(shí)為新的菌種和毒種的分類鑒定提供強(qiáng)有力的工具，但該法仍然屬于利用質(zhì)譜法進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)分析分類，并未針對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)際專利申請(qǐng) W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公開了一種使用MALDI-MS (基質(zhì)輔助激光解吸和電離質(zhì)譜)用于識(shí)別生物材料的方法和裝置，包括準(zhǔn)備包含試樣和MALDI基質(zhì)材料的液體，并將其用于形成液體的連續(xù)流束。將該流束分散成接連的部分，以形成發(fā)射到飛行中的液滴，或?qū)⒘魇l(fā)射到飛行中，然后分散成液滴?？墒褂脧膰娔∷C(jī)中已知的液滴形成技術(shù)。對(duì)飛行中的液滴電離出材料。測(cè)量來自各個(gè)液滴的電離材料的質(zhì)譜。但該方法目的在于如何改善MALDI-MS檢測(cè)生物物質(zhì)的靈敏度，并不涉及質(zhì)譜鑒定和分類任意微生物，因此也不能解決上述技術(shù)問題。由于質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌存在著難以確定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜特征圖譜的問題。也就是說，盡管不同細(xì)菌之間的基因組DNA存在差異，將產(chǎn)生不同的核酸指紋圖譜，但如果沒有建立標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，則因?yàn)槌霈F(xiàn)每次質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)菌的結(jié)果因待檢的基因組過于龐大而缺乏重復(fù)性，導(dǎo)致準(zhǔn)確度下降。例如，朱健等人(“高效液相色譜-電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法對(duì)格爾德霉素粗品中各組分的初步判別及分類”，《中國(guó)抗生素》，2011年03期)報(bào)道了應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法(LC-ESI-MSn)對(duì)格爾德霉素(GDM)粗品中各組分進(jìn)行與質(zhì)量數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息方面的初步判別及分類。該方法針對(duì)格爾德霉素(GDM)中不同組分的多級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行的分析整理,并對(duì)各種化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確分類,但并不涉及針對(duì)細(xì)菌特定物質(zhì)(如核酸)進(jìn)行檢測(cè)從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的方法。
劉海洪(“MALDI TOF MS在細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用”，《微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展》，2003年02期)報(bào)道了“細(xì)菌體內(nèi)含有大量的生物標(biāo)志分子能用于細(xì)菌的化學(xué)分類和鑒定，針對(duì)如根據(jù)細(xì)菌的組成成分獲得指紋圖譜檢測(cè)和鑒定細(xì)菌”，并對(duì)該方法預(yù)測(cè)其理論上的可行性。然而，該研究?jī)H僅是理論上探討了利用MALDI TOF MS對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的方向，其既沒有指明所針對(duì)細(xì)菌的何種組分進(jìn)行檢測(cè)，也沒有說明具體研究方法和過程。由于細(xì)菌中可用于分類的組分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)種類太多，且質(zhì)譜技術(shù)針對(duì)不同待測(cè)物也存在各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)的組合和選擇，因此在此之后的近10年內(nèi)并沒有利用MALDI TOF MS進(jìn)行細(xì)菌鑒定的新的報(bào)道。中國(guó)專利申請(qǐng)201110154723、“MALDI TOF MS輔助鑒定單增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS輔助鑒定霍亂弧菌的方法”公開了一種利用MALDI TOF MS技術(shù)輔助鑒定細(xì)菌的方法，包括預(yù)處理細(xì)菌培養(yǎng)物，采集所有菌株樣品的MALDI TOF MS圖譜，根據(jù)軟件制備細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜，使用相同的方法檢測(cè)并采集待測(cè)細(xì)菌的圖譜，以及比較二者圖譜，根據(jù)匹配分?jǐn)?shù)進(jìn)行判定。由于該方法使用常規(guī)的處理(通過無水乙醇、甲酸和乙腈處理，并輔以離心，最后吸取上清液進(jìn)行檢測(cè))，盡管其在一定程度上能表征該細(xì)菌的特征圖譜，但由于其待測(cè)物中含有蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被離子化的分子，其得到的圖譜實(shí)質(zhì)上是上述各種分子的圖譜集合，因此既需要處理和比對(duì)的圖譜信息量過大，并且因待檢分子過于龐大而導(dǎo)致其圖譜特征性偏低，只適用于某具體細(xì)菌而無法推廣到其他大量的細(xì)菌檢測(cè)中。由于質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌存在的上述缺陷，導(dǎo)致目前使用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌甚至布魯氏菌一直沒有進(jìn)展。作為最接近的現(xiàn)有技術(shù)，顧超慧等人(“蛋白質(zhì)組學(xué)在布魯氏菌病研究中的應(yīng)用”，《疾病監(jiān)測(cè)》第24卷第5期，2009)和王玉飛等人(“羊布魯氏菌的分泌蛋白質(zhì)組分析”，《微生物學(xué)通報(bào)》，第36卷第8期，2009)報(bào)道了利用質(zhì)譜技術(shù)分析羊布魯氏菌分泌蛋白的指紋圖譜，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)蛋白序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，從而鑒定布魯氏菌的蛋白。然而該方法仍然停留在對(duì)布魯氏菌的特征蛋白的分析上，并不涉及如何建立布魯氏菌相關(guān)核酸質(zhì)譜特征庫(kù)并利用該庫(kù)進(jìn)行細(xì)菌鑒定、分型的用途，因此也無法解決上述問題。因此目前需要新的布魯氏菌的鑒定和分析方法(如質(zhì)譜法)來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、便捷的分類結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明原理在于組成遺傳物質(zhì)DNA的基本單元一四種核苷酸之間存在質(zhì)量差異，對(duì)布魯氏菌基因組DNA上某個(gè)或某幾個(gè)片段進(jìn)行PCR和酶切后，將產(chǎn)生分子量和豐度各異的片段，使用質(zhì)譜檢測(cè)可產(chǎn)生核酸指紋圖譜，不同布魯氏菌之間基因組DNA存在差異，將產(chǎn)生不同的核酸指紋圖譜，建立數(shù)據(jù)庫(kù)后，可以實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜信息進(jìn)行比對(duì)，即可完成對(duì)布魯氏菌的鑒定。因此，針對(duì)布魯氏菌屬不同菌種的特定區(qū)域的DNA設(shè)計(jì)合適的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物通過特定內(nèi)切酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一豐度不一的核酸片段，并通過MALDI-TOF MS質(zhì)譜進(jìn)行核酸分析檢測(cè)，并形成譜圖。對(duì)布魯氏菌目標(biāo)基因序列進(jìn)行擴(kuò)增后酶切，得到布魯氏菌屬不同菌種的圖譜?？梢詫?shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中布魯氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)圖譜信息進(jìn)行比對(duì)，即可完成對(duì)布魯氏菌的分類和鑒定(鑒定、分型、分類等)。此方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)少等優(yōu)勢(shì)。 因此，本發(fā)明第一目的是提供一種基于酶切的布魯氏菌屬核酸指紋圖譜制備方法。其特征在于，它至少包括如下步驟(I)PCR反應(yīng)使用針對(duì)細(xì)菌的PCR通用引物，分別擴(kuò)增多個(gè)細(xì)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物；(2) SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物；(3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，分別在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟
(2)得到的各個(gè)細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段；(4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物；(5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到不同布魯氏菌的特征核酸指紋譜圖。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的細(xì)菌核酸序列，包括但不限定于布魯氏菌DNA基因組上一個(gè)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一實(shí)施方案中，步驟3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟5的純化包括在轉(zhuǎn)錄和酶切產(chǎn)物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。上述任一方案中，其中所述細(xì)菌包括但不限于羊種布魯氏菌(Brucellamelitensis)、牛種布魯氏菌(Brucella abortus)及豬種布魯氏菌(Brucella suis)。本發(fā)明的第二目的是建立布魯氏菌屬的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)，至少包括上述步驟1-5，和；(6)將步驟5得到的不同分離株的核酸指紋特征圖譜，通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行匯總和整理，得到布魯氏菌的標(biāo)準(zhǔn)核酸指紋特征圖譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述軟件是發(fā)明人自行研究開發(fā)的BioExplore軟件，其版權(quán)號(hào)為軟著登字第136879號(hào)、登記號(hào)2009SR10700。
本發(fā)明的第三目的是提供一種快速鑒定布魯氏菌的方法，包括(I)PCR反應(yīng)使用針對(duì)布魯氏菌的PCR通用引物，擴(kuò)增待測(cè)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物；(2) SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物；(3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段；(4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物；(5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀 進(jìn)行檢測(cè)，得到該菌的核酸指紋特征圖譜；(6)將所得核酸指紋特征圖譜與庫(kù)中布魯氏菌核酸指紋特征圖譜進(jìn)行比較，從而判斷待測(cè)細(xì)菌的種屬。本發(fā)明的第四目的是提供能用于布魯氏菌分類和鑒定、臨床檢驗(yàn)的試劑盒，包括(I)用于擴(kuò)增細(xì)菌DNA的通用引物對(duì)及其緩沖液；(2) SAP酶及其緩沖液；(3) RNAase 及其緩沖液；(4)用于純化酶切產(chǎn)物的樹脂；(5)用于比對(duì)核酸指紋特征圖譜的分析軟件。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述引物是SEQ ID N0:l_2。在另一實(shí)施方案中，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號(hào)為(軟著登字第136879 號(hào)、登記號(hào) 2009SR10700)。定義本發(fā)明所述的“細(xì)菌或布魯氏菌分類和鑒定”，包括對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和識(shí)別、分型、分種、分類。例如在食品安全檢測(cè)中(如奶制品、肉制品)，通過布魯氏菌分類或鑒定，能準(zhǔn)確識(shí)別傳染源和細(xì)菌組成，以備采用合理措施進(jìn)行保障食品安全。又如，在研究細(xì)菌的進(jìn)化中，通過對(duì)布魯氏菌的識(shí)別和分類/分型，能夠確定各種布魯氏菌種屬之間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系O本發(fā)明所述的布魯氏菌DNA基因組上一個(gè)區(qū)域，優(yōu)選是具有高度保守同時(shí)又具有一定多態(tài)性的區(qū)域。本發(fā)明所述的保守區(qū)域或保守片段，優(yōu)選是布魯氏菌rRNA區(qū)域。rRNA是研究細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，它含量達(dá)80%，并存在于所有細(xì)菌中，rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成，在細(xì)菌中高度保守，素有“細(xì)菌化石”之稱，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用和最常用的分子鐘。目前以16SrDNA進(jìn)行布魯氏菌分類和鑒定的方法主要是采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)的方法。測(cè)序法應(yīng)用于臨床檢測(cè)，目前存在如下問題(1)成本高；
(2)耗時(shí)；(3)對(duì)于混合樣本，測(cè)序易產(chǎn)生套峰，難以進(jìn)行有效區(qū)分；(4)16S rDNA全長(zhǎng)I. 5kb以上，一般需要經(jīng)過兩次測(cè)序并將結(jié)果進(jìn)行拼接，在這個(gè)過程中易引入誤差。如前所述，16S rDNA對(duì)布魯氏菌分類鑒定具有重要的意義，但是傳統(tǒng)測(cè)序等方法檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)；對(duì)于混合感染的樣品，測(cè)序法將得到混合的序列峰圖，難以進(jìn)行有效的區(qū)分，并且利用質(zhì)譜進(jìn)行待測(cè)物分析，需要選擇合適的待測(cè)物和優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，因此目前需要新的細(xì)菌分類技術(shù)(如質(zhì)譜法)來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、便捷的分類結(jié)果。本發(fā)明所述的“通用引物”是能位于各種細(xì)菌基因組的待擴(kuò)增區(qū)域的上下游，能在不同細(xì)菌基因組中擴(kuò)增相應(yīng)片段的引物。其中，本發(fā)明所述的基因組上的待擴(kuò)增區(qū)域選自與SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，優(yōu)選該序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。由于對(duì)于細(xì)菌DNA (例如16S rDNA)而言，其序列通常由保守區(qū)和可變區(qū)組成，且可變區(qū)多為不連續(xù)或短片段甚至SNP形式夾雜在保守區(qū)中間或兩端，因此使用通用引物即能在不同細(xì)菌基因組中擴(kuò)增相應(yīng)片段。因各種細(xì)菌的該片段均具有一定同源性，故在與SEQ IDN0:3所示序列具有至少60%同源性的片段中，經(jīng)過酶切和質(zhì)譜后能得到待測(cè)細(xì)菌的核酸指紋特征圖譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，羊種布魯氏菌16S rDNA的特定區(qū)域是16S rDNA序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAG CGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCATTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAATGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG，即SEQ ID N0:3。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該特定區(qū)域的引物是SEQ ID No 1 和 SEQ ID No :2。有益效果I、本發(fā)明基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，由于質(zhì)譜檢測(cè)的高靈敏性，使用本方案對(duì)布魯氏菌存在與否的檢測(cè)下限能夠遠(yuǎn)超出其他技術(shù)方案；2、對(duì)于不同的樣本，本發(fā)明可比對(duì)它們產(chǎn)生的核酸指紋圖譜，將實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的核酸指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的圖譜進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)生物信息學(xué)分析，可以判斷該菌是否為布魯氏菌分離株；3、使用本方案可以進(jìn)行布魯氏菌的分類與鑒定，并可用于臨床檢驗(yàn)等方面。4、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，全過程僅僅數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，省時(shí)省力；5、本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(kù)是開放式的，可不斷補(bǔ)充新的分離株，不斷完善和擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫(kù)，以便更為準(zhǔn)確的完成布魯氏菌的鑒定；6、另外，本發(fā)明首次提出將布魯氏菌的16S rDNA區(qū)域作為待測(cè)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，以獲得不同布魯氏菌種的核酸指紋圖譜，用于布魯氏菌的分類與鑒定。


圖1、2為羊種布魯氏菌的核酸指紋特征圖譜。圖3為牛種布魯氏菌的核酸指紋特征圖譜。圖4為豬種布魯氏囷的核酸指紋特征圖譜。圖5為待測(cè)樣品I的核酸指紋特征圖譜。圖6為牛布魯氏菌在抗生素SDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)圖。圖7為牛布魯氏菌在柯氏染色培養(yǎng)上菌落形態(tài)圖。圖8為待測(cè)樣品2的核酸指紋特征圖譜。
圖9為羊布魯氏菌在柯氏染色培養(yǎng)上菌落形態(tài)圖。圖10為待測(cè)樣品2的電泳檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例一羊種布魯氏菌核酸指紋圖譜的建立一、設(shè)計(jì)并選擇合適弓I物根據(jù)羊布魯氏菌(Brucella melitensis)的16S基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物,分別
為
權(quán)利要求
1.一種基于酶切的布魯氏菌核酸指紋圖譜制備方法，其特征在干，它至少包括如下步驟 (1)PCR反應(yīng)使用針對(duì)細(xì)菌的PCR通用引物，分別擴(kuò)增多個(gè)細(xì)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物； (3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，分別在ー個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的各個(gè)細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得ー系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物； (5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到布魯氏菌的特征核酸指紋譜圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中通用引物包括但不限于SEQID No 1和SEQ ID No 2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中步驟5的純化包括在轉(zhuǎn)錄和酶切產(chǎn)物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘；所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。
4.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的方法，其中所述布魯氏菌包括常見的對(duì)人感染的幾種布魯氏國(guó)。
5.利用權(quán)利要求I的方法用于建立布魯氏菌核酸指紋特征圖譜庫(kù)的方法，至少包括上述步驟1-5，和； (6)將步驟5得到的各種布魯氏菌的核酸指紋特征圖譜，通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行匯總和整理，得到所述的布魯氏菌核酸指紋特征圖譜庫(kù)。
6.權(quán)利要求7的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號(hào)為軟著登字第136879 號(hào)、登記號(hào) 2009SR10700。
7.利用權(quán)利要求5或6的方法所建立的布魯氏菌核酸指紋特征圖譜，用于布魯氏菌鑒定或分類的方法，包括 (I )PCR反應(yīng)使用針對(duì)細(xì)菌的PCR通用引物，擴(kuò)增待測(cè)細(xì)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物； (3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得ー系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物； (5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到該菌株的核酸指紋特征圖譜； (6)將所得核酸指紋特征圖譜與布魯氏菌核酸指紋特征圖譜庫(kù)進(jìn)行比較，從而判斷待測(cè)菌株的類別或種屬。
8.權(quán)利要求7的方法,其中步驟6通過BioExplore軟件進(jìn)行比較檢測(cè)。
9.提供能用于布魯氏菌分類和鑒定、臨床檢測(cè)的試劑盒，包括 (1)用于擴(kuò)增細(xì)菌DNA的通用引物對(duì)及其緩沖液； (2)SAP酶及其緩沖液；(3)RNAase及其緩沖液； (4)用于純化酶切產(chǎn)物的樹脂； (5)用于比對(duì)核酸指紋特征圖譜的分析軟件。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-2，所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號(hào)為(軟著登字第136879號(hào)、登記號(hào)2009SR10700)。
全文摘要
一種基于質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定布魯氏菌的方法及其用途，本發(fā)明公開了一種用于快速鑒定布魯氏菌的方法，包括PCR擴(kuò)增、SAP酶消化、轉(zhuǎn)錄和核酸酶切、純化、質(zhì)譜儀檢測(cè)等步驟?；谠摲椒?，建立常見布魯氏菌的核酸指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的質(zhì)譜峰圖，可對(duì)待檢樣品中的布魯氏菌進(jìn)行分類與鑒定，結(jié)果可廣泛運(yùn)用于布魯氏菌的分型和分類、及環(huán)境衛(wèi)生和公共安全檢疫等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851362SQ20121027386
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者馬慶偉, 趙洪斌, 張海燕, 趙艷梅 申請(qǐng)人:向華