鑒別氣溶膠中布魯氏菌a19疫苗株的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及應用重組酶聚合酶擴增-側流層析試紙條檢 測技術（Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA_LFD) 快速鑒別診斷氣溶膠等臨床樣本中布魯氏菌A19疫苗株的引物與探針以及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 布魯氏菌病（Brucellosis)是由布魯氏菌屬細菌（主要為牛種、羊種、豬種和犬種 布魯氏菌等）引起的人和多種家畜共患的傳染病，也是我國法定檢疫和凈化的重要病原。 近年來發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，尤其是對奶畜危害極大，流產率高達50% -80%，乳、肉 產量減少10% -20%。據《獸醫(yī)公報》統(tǒng)計，2013年全國共發(fā)生布魯氏菌病3620次，42720 頭牛羊發(fā)病。因此，布魯氏菌病給社會經濟發(fā)展與穩(wěn)定、國家公共衛(wèi)生安全等構成嚴重威 脅。
[0003] 布魯氏菌病的傳染源主要是患病動物及帶菌者，它們通過分泌物、乳汁、體液等將 布魯氏菌排出體外，污染環(huán)境，同時布魯氏菌粘附在空氣中的灰塵懸浮粒子上，形成氣溶膠 進而傳播，感染其他動物和人。養(yǎng)殖場環(huán)境中的布魯氏菌氣溶膠的分布可造成布魯氏菌病 的傳染與流行，給畜牧業(yè)生產和人類健康帶來嚴重危害，尤其是當前集約化、高密度養(yǎng)殖環(huán) 境下更容易形成布魯氏菌氣溶膠性的流行。因此，通過監(jiān)測養(yǎng)殖場環(huán)境中布魯氏菌氣溶膠， 可以有效地預警預報布魯氏菌病的暴發(fā)與流行。
[0004] 我國動物布魯氏菌病防控的主要策略是檢疫與凈化。目前我國牛群免疫常用的牛 種布魯氏菌A19活疫苗株在抗原與抗體的診斷上會對布魯氏菌病野毒感染造成干擾。這是 因為我國目前使用的布魯氏菌病診斷方法不能對自然感染和人工疫苗免疫進行鑒別診斷， 必然導致一些自然感染的病畜逃避檢疫，使患病動物長期存在，對牛群和人類的安全長期 構成威脅，因此，我國很難實行布魯氏菌病的檢疫、撲殺、凈化的防控規(guī)程。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別氣溶膠中布魯氏菌A19疫苗株的引物、探針及試劑 盒，該試劑盒能夠特異、靈敏、簡易、快速的現(xiàn)場鑒別診斷氣溶膠中布魯氏菌A19疫苗株。
[0006] 為實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術方案：
[0007] -種鑒別氣溶膠中布魯氏菌A19疫苗株的引物對和探針組合，其中 Brucella-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探 針序列如SEQIDNo. 3所示；A19-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo. 4所示，反向引物序列如 SEQIDNo. 5所示，探針序列如SEQIDNo. 6所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種鑒別氣溶膠中布魯氏菌A19疫苗株的試劑盒，該試劑盒包含 上述引物對與探針組合。
[0009] 本發(fā)明進一步提供了一種用于快速鑒別診斷氣溶膠樣本中布魯氏菌A19疫苗株 的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)檢測樣本DNA的提取或檢測樣本裂解處理；
[0011] (2)以步驟⑴中處理的樣本為模板，進行RPA擴增；
[0012] (3)用側流層析試紙條檢測上述RPA擴增產物，根據檢測結果判定樣本中是否含 有布魯氏菌A19疫苗株。
[0013] 優(yōu)選的是，步驟⑵中所述RPA擴增體系為：RPA反應體系為50yL:其中包括 2. IyL 10 μ M 的正向引物，2. IyL 10 μ M 的反向引物，0.6 yL 10 μ M 的探針，rehydration 緩沖液29. 5 μ L，待測樣本DNA或粗裂解產物2 μ L，CldH2O 11. 2 μ L ;將上述47. 5 μ L混合物 加入RPA-nfo反應管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液2. 5 μ L，上下顛倒混勻 后于恒溫水浴38°C反應20-30分鐘。
[0014] 優(yōu)選的是，步驟（3)的具體步驟為：每個取RPA反應產物取2 μ L與98 μ L PBST試 紙條檢測緩沖液（IX PBS+0. 1 %吐溫20)混合，將一個測流層析試紙條（LFD)浸入，5min之 內觀察結果，若Brucella-RPA-LFD與A19-RPA-LFD兩個檢測組合同時出現(xiàn)檢測條帶和對 照條帶，則該樣品中布魯氏菌A19疫苗株陽性；Brucella-RPA-LFD檢測組出現(xiàn)檢測條帶和 對照條帶，而A19-RPA-LFD檢測組僅出現(xiàn)對照條帶，則說明該樣品中含有布魯氏菌A19疫 苗株以外的其他布魯氏菌；BrucelIa-RPA-LFD與A19-RPA-LFD兩個檢測組均未出現(xiàn)檢測條 帶而同時出現(xiàn)對照條帶，則說明檢測樣本中不含有布魯氏菌屬細菌。出現(xiàn)其他情況則說明 RPA-LFD布魯氏菌A19鑒別檢測不成立。
[0015] 本發(fā)明還提供含有上述兩組引物與探針組合的用于鑒別診斷布魯氏菌A19疫苗 株的試劑盒。該試劑盒中還包括大腸桿菌來源的recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA 結合蛋白（SSB)、rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液、側流層析試紙條（特異性 檢測生物素與FAM標記基因擴增產物）、PBST試紙條檢測緩沖液（IX PBS+0. 1 %吐溫20)、 滅菌去離子雙蒸水（ddH20)，TE緩沖液、10%(W/ V)SDS、2%(W/V)蛋白酶K、布魯氏菌A19疫 苗株標準陽性模板。
[0016] 以布魯氏菌A19疫苗株與其他布魯氏菌基因組差異DNA序列為鑒別靶序列，應用 RPA-LFD技術，可以實現(xiàn)布魯氏菌A19疫苗株與其他布魯氏菌毒株現(xiàn)場快速鑒別診斷。RPA 技術通過三種酶的混合物，即能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋 白（SSB)和鏈置換DNA聚合酶，在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37-39?，整個過程一般 可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量級（trace levels)的核酸（尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約IO 12 擴增產物，更適合低濃度的臨床檢測模板。而且RPA反應對模板純度要求不高，適用于無法 提取核酸的實地檢測。目前，RPA反應可以通過瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴增曲線和LFD試紙 條三種不同方式檢測結果，這三種方式的引物與探針反應原理是不同的。凝膠電泳和熒光 擴增曲線法仍然依賴實驗室和特殊儀器設備，而LFD是一種無需特殊儀器可用于現(xiàn)場的方 法。
[0017] RPA-nfo反應的引物與探針的設計目前沒有具體的規(guī)則，只能經過RPA反應用側 流層析試紙條（LFD)檢測，才能篩選獲得可用于臨床檢測的引物與探針組合。在RPA-nfo 正向引物的擴增靶序列中設計一條帶FAM標記的特異探針，同時反向引物用生物素標記， 生物素標記的RPA產物與FAM標記的特異探針雜交、FAM標記的特異探針與抗FAM抗體的 金標物結合后，將該免疫復合物滴加到試紙條上，免疫復合物通過層析膜擴散，擴散到檢測 線時，生物素標記的擴增產物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的檢測線，即檢測條帶。不 被捕獲的免疫復合物繼續(xù)擴散到質控線被特異性抗體所捕獲，形成具有顏色的質控線，BP 對照條帶。這樣RPA技術與側流層析技術結合，即RPA-LFD技術，可以通過側流層析試紙條 (LFD)讀取結果，本方法既不要求特殊儀器設備，也無需復雜的樣品處理，僅僅使用普通的 加熱裝置如水浴鍋和側流層析試紙條就可以通過肉眼觀察結果。因此，RPA-LFD技術在布 魯氏菌氣溶膠等臨床樣本的現(xiàn)場診斷以及疫苗株A19的鑒別方面具有廣闊的應用前景。
[0018] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0019] (1)本發(fā)明提供的RPA技術是近年來新出現(xiàn)的一種在擴增速率和產量上均優(yōu)于 PCR和環(huán)介導等溫擴增（LAMP)技術的新方法，其反應在30min內就能從單個模板分子得到 大約IO12擴增產物。
[0020] (2)本發(fā)明提供的布魯氏菌屬細菌與A19疫苗株鑒別診斷的RPA-LFD引物與探針 組合以及試劑盒靈敏度高、特異性強，最低均可以檢測到3X IOtlCfu的布魯氏菌屬細菌或布 魯氏菌A19疫苗株細菌，Brucella-RPA-LFD檢測組與大腸桿菌0157:H7、小腸結腸炎耶爾森 菌0:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等細菌均無交叉反應。A19-RPA-LFD檢測組與其他布魯 氏菌株以及大腸桿菌〇157:H7、小腸結腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等細 菌均無交叉反應。
[0021] (3)本發(fā)明提供的布魯氏菌A19疫苗株鑒別診斷RPA-LFD引物與探針組合以及試 劑盒不僅僅可用于布魯氏菌A19疫苗株菌株與氣溶膠樣本的檢測，還可用于其他臨床樣本 如血液、奶樣等的檢測。
[0022] (4)本發(fā)明提供的布魯氏菌A19疫苗株鑒別診斷RPA-LFD檢測方法使用方便，無需 特殊儀器設備，僅僅在38°C下