啟動子PgpdP及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種啟動子，特別是一種擴展青霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子以及所述啟動子的用途。本發(fā)明所述啟動子具有SEQID?NO：1所示的核苷酸序列，或其具有啟動子功能的變體。本發(fā)明還涉及含有所述啟動子的核酸構(gòu)建體、載體、重組細胞和轉(zhuǎn)基因工程菌。本發(fā)明還涉及所述啟動子用于調(diào)控真菌中目的基因表達的用途。本發(fā)明的啟動子可啟動目的基因在真菌菌絲體中高效表達，特別是在擴展青霉菌絲體中有較高的活性。
【專利說明】啟動子PgpdP及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種啟動子，特別是涉及一種來源于擴展青霉的啟動子PgpdP及其在調(diào)控真菌中目的基因表達中的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]近年來，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工業(yè)應(yīng)用方面取得了很大進展。堿性脂肪酶具有對底物水解效率高、反應(yīng)溫和、無毒、能在一定條件下水解脂肪等優(yōu)點，已經(jīng)在洗滌劑、造紙、制革、食品、紡織及輕工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，并已經(jīng)成為全世界酶制劑市場上重要的品種。脂肪酶可以從動物、植物提取，也可以由多種微生物產(chǎn)生。由于微生物脂肪酶種類多，來源廣，周期短，具有比動物、植物脂肪酶更廣的pH、作用溫度，更多的專一性類型底物，便于工業(yè)化生產(chǎn)和提純，所以在酶的理論研究和實際應(yīng)用中有更重要的作用?；谖⑸镏久傅谋姸鄡?yōu)點，人們一直期望獲得產(chǎn)脂肪酶能力強的微生物菌株。在現(xiàn)有的技術(shù)中，通過對大量的微生物菌種進行選育，已經(jīng)獲得了一種產(chǎn)堿性脂肪酶能力較強的擴展青霉(P.expansium)菌株,并經(jīng)過多年的誘變育種和發(fā)酵工藝改進,其產(chǎn)脂肪酶的能力已經(jīng)得到大幅度的提高。但是，傳統(tǒng)的菌株育種方法主要依靠隨機的理化誘變，目標(biāo)不明確，費時費力，而且收效不明顯，目前通過采用這些方法來提高該菌株產(chǎn)脂肪酶的能力已經(jīng)非常困難。因此，基于同源表達技術(shù)之上的遺傳工程改良將是進一步提高擴展青霉產(chǎn)脂肪酶能力的高效手段。
[0003]啟動子是基因轉(zhuǎn)錄單元的一個組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游，是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的的一段DNA序列。啟動子能夠指導(dǎo)RNA聚合酶全酶同模板正確結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達的程度。選擇高效的啟動子是進一步提高擴展青霉產(chǎn)脂肪酶能力的有效手段。
[0004]甘油醒-3-憐酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GPD,ECl.2.1.12)是生物體內(nèi)糖酵解和糖異生過程中的關(guān)鍵酶，其生理功能是在NAD+和無機磷酸存在的條件下催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化，生成1，3- 二磷酸甘油酸，是維持生命活動最基本的酶之一。真菌中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶是一個由四個相同的亞基組成的四聚體蛋白，并且在真核細胞中高效表達，如在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中其含量可達細胞內(nèi)可溶性蛋白的5 在酵母中其mRNA的量占總RNA量的2~5%，如此高的mRNA表達量以及蛋白積累說明甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子非?；钴S，這一結(jié)果已在釀酒酵母(S.cerevisiae),畢赤酵母(PichiaPastoris),卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和金針燕(Flammulian velutipes)中得到了證實。在真菌的遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建中，gpd啟動子通常被認(rèn)為是表達異源基因的理想候選啟動子；雖然使用異源甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子構(gòu)建表達載體非常普遍，但是載體上的基因在某些真菌受體中也有不表達的情況發(fā)生。因此，人們希望使用內(nèi)源啟動子以期載體上的基因在受體中高效表達。
[0005]經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Moralejo, F.J.等在《Applied andEnvironmental Microbiology)) 1999 年第 3 期 1168-1174 頁發(fā)表了題為((Thaumatinproduction in Aspergilus awamori by use of expression cassettes with strongfungal promoters and high gene dosage)) 一文，文中評述，產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)的pcbC啟動子或產(chǎn)黃頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的B2啟動子構(gòu)建不同的表達盒在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中表達時,表達產(chǎn)量分別為7.7mg/L和1.6mg/L，相反，如果換用泡盛曲霉自身的啟動子時，表達產(chǎn)量能達到llmg/L。這表明，同種特異性的啟動子具有更好的啟動表達效果。
[0006]由上所述，發(fā)明一種同源啟動子是提高擴展青霉產(chǎn)脂肪酶能力的高效手段，但是，到目前為止，擴展青霉菌中并未有相關(guān)的高效啟動子的報道，這讓同源表達技術(shù)難以在該菌株的遺傳改良中得以應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有擴展青霉中無高效啟動子的情況，提供一種啟動子，特別是一種擴展青霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子以及所述啟動子的用途，所述啟動子可啟動目的基因在真菌菌絲體中高效表達，特別是在擴展青霉菌絲體中有較高的活性。
[0008]本發(fā)明的一個方面涉及一種能夠高效啟動目的基因表達的啟動子，所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列:
[0009]a、SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
[0010]b、與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列；
[0011]C、在嚴(yán)格條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0012]d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；所述 SEQ ID NO:1 的序列如下:GTCGACGCGTCTTCGAGGGGCAGTTTTCATCGAGTAACTCA
【權(quán)利要求】
1.一種啟動子，所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列: a、SEQID NO:1所示的核苷酸序列； b、與SEQID NO:1互補的核苷酸序列； C、在嚴(yán)格條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列； d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列； e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1的啟動子，與啟動子可操作連接的基因序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。
3.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體，所述載體為權(quán)利要求1的啟動子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體與PMD18-T或PCHAMBIA2302質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組質(zhì)粒。
4.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞含有權(quán)利要求1的啟動子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的載體，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農(nóng)桿菌細胞。
5.一種含有權(quán)利要求1的啟動子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的載體或權(quán)利要求4的重組細胞的真菌，所述真菌為擴展青霉菌。
6.一組引物對，所述引物對用于擴增得到權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述引物對的兩條引物分別含有SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的序列，或者分別含有SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列，或者分別含有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列。
7.制備SEQID NO:1所示的啟動子的方法，包括: 以擴展青霉基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求6所述的一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據(jù)SEQ ID NO:1在擴展青霉基因組DNA中的序列分別針對首尾進行設(shè)計。
8.—種調(diào)控真菌中目的基因表達的方法，其特征在于，所述方法包括: 將權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體或權(quán)利要求4所述的重組細胞導(dǎo)入真菌，所述真菌為擴展青霉。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因工程菌的方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的真菌。
10.權(quán)利要求1的啟動子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的載體或權(quán)利要求4的重組細胞在調(diào)控真菌中目的基因表達中的用途；所述真菌為擴展青霉，所述目的基因為⑶S基因。
【文檔編號】C12R1/80GK103571840SQ201210277947
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】張?zhí)? 王劍英, 唐克軒, 賈佳 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司