專利名稱：一種柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及拮抗細(xì)菌對(duì)植物病原細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法，具體涉及對(duì)柑橘潰瘍病菌抑菌能力的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
柑橘潰瘍病是由地毪草黃單胞桿菌柑橘致病變種、Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的ー種國(guó)內(nèi)外檢疫性細(xì)菌病害，主要侵染蕓香科柑橘屬、枳屬及金柑屬植物，引起柑橘葉片、果實(shí)、枝干潰瘍斑，導(dǎo)致樹勢(shì)生長(zhǎng)衰弱，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 該病害可通過(guò)氣孔、皮孔等自然孔ロ或外界造成的傷ロ侵入寄主；通過(guò)風(fēng)雨、媒介昆蟲、農(nóng)事操作等局部傳播，帶菌的種苗、接穗和果實(shí)等柑橘材料遠(yuǎn)距離傳播。目前對(duì)柑橘潰瘍病的防治措施主要采用以農(nóng)業(yè)防治為基礎(chǔ)，化學(xué)藥劑為主的防治技木，柑橘是世界上重要的商品水果，環(huán)境污染、病原菌抗藥性以及果品農(nóng)藥殘留等問(wèn)題限制了化學(xué)農(nóng)藥的大規(guī)模利用。為提高我國(guó)柑橘的品質(zhì)和出口標(biāo)準(zhǔn)，探索該病害新的防治途徑以克服農(nóng)藥殘留和病原菌抗藥性等問(wèn)題也勢(shì)在必行。生物防治對(duì)環(huán)境友好，無(wú)污染，不易在果實(shí)上殘留，因而備受人們的關(guān)注。因此篩選獲得有抑菌能力的拮抗微生物成了研究柑橘潰瘍病生物防治的重要前期基礎(chǔ)。目前柑橘潰瘍病的拮抗微生物的篩選方法中，關(guān)于測(cè)定拮抗菌株抑菌能力的方法有抑菌圈法、牛津杯法、平板對(duì)峙法等，其直接以拮抗菌株的菌懸液來(lái)進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定過(guò)程中，拮抗菌株繼續(xù)在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，由于不同的菌株生物學(xué)特性不同，生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力也不同，導(dǎo)致測(cè)定的抑菌圈大小不準(zhǔn)確，因此難以同時(shí)比較不同菌株的抑菌能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法——無(wú)菌濾液紙碟法，此法不僅能用于測(cè)定出分離獲得的拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制能力，還可以為篩選柑橘潰瘍病有潛在應(yīng)用價(jià)值的拮抗細(xì)菌提供操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)穩(wěn)定性好的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是按以下步驟進(jìn)行
(a)將I.0 X IO6 CFU/ mL的拮抗細(xì)菌新鮮菌液I mL接種到盛有50 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C下180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，經(jīng)12，000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)孔徑為0. 22 um的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得無(wú)菌濾液；
(b)將直徑10mm的無(wú)菌濾紙片放入步驟(a)制得的無(wú)菌濾液中浸潤(rùn)20min ；
(c)將柑橘潰瘍病菌配制為2.0 X IO8CFU/ mL的菌懸液，取2 mL菌懸液與冷卻至50°C的200 mL NA培養(yǎng)基混勻，倒入直徑90mm的培養(yǎng)皿制平板，每個(gè)平板20 mL ；
(d)往步驟(c)制得的含柑橘潰瘍病菌的平板中央放入步驟(b)制得的浸潤(rùn)拮抗細(xì)菌無(wú)菌濾液的濾紙片，280C培養(yǎng)48 h后，觀察記錄拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑菌能力，測(cè)定抑菌圈直徑。步驟(a)中，NB液體培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0g，葡萄糖 10. 0 g，牛肉膏 3.0 g，水 1,000.0 mL, pH 6. 8-7. O0步驟(b)中，NA培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，瓊脂 18.0 g，水 1,000.0 mL, pH 6. 8-7. O。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明使用拮抗細(xì)菌無(wú)菌濾液紙碟法能有效地測(cè)定出分離獲得的拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制能力，操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)穩(wěn)定性好、抑菌圈寬度測(cè)定準(zhǔn)確。此外本法不需要特別的儀器，實(shí)驗(yàn)成本較低。使用本發(fā)明方法能篩選出對(duì)柑橘潰瘍病有潛在應(yīng)用價(jià)值的拮抗細(xì)菌。



圖I為本發(fā)明實(shí)施例中拮抗細(xì)菌抑制柑橘潰瘍病菌能力結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例使用本發(fā)明所述的方法測(cè)定分離獲得的拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑菌能力
I、將分離純化后的柑橘潰瘍病菌的拮抗細(xì)菌菌株用無(wú)菌水配制為1.0 X IO6 CFU/ mL的新鮮菌液，取I mL接種到盛有50 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C下180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，經(jīng)12，000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得無(wú)菌濾液。所述NB液體培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，水 1,000.0 mL, pH 值 6. 8-7. O。2、將直徑10 mm的無(wú)菌濾紙片放入制得的無(wú)菌濾液中浸潤(rùn)20min。3、將柑橘潰瘍病菌配制為2.0 X IO8CFU/ mL的菌懸液，取2 mL菌懸液與冷卻至50°C的200 mL NA培養(yǎng)基混勻，倒入直徑90mm的培養(yǎng)皿制平板，每個(gè)平板20 mL。所述NA培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖
10.0 g，牛肉膏 3. 0 g，瓊脂 18. 0 g，水 1，000. 0 mL, pH 6. 8-7. O。4、往含柑橘潰瘍病菌的平板中央放入浸潤(rùn)拮抗細(xì)菌無(wú)菌濾液的濾紙片，28°C培養(yǎng)48 h后，觀察記錄拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑菌能力，測(cè)定抑菌圈直徑，每處理設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果見圖1，拮抗細(xì)菌TR7菌株無(wú)菌濾液對(duì)柑橘潰瘍病菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑為19. 5mm。從圖可見本法能有效地測(cè)定出分離獲得的拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制能力。
權(quán)利要求
1.一種柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟 (a)將I.O X IO6 CFU/ mL的拮抗細(xì)菌新鮮菌液I mL接種到盛有50 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C下180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，經(jīng)12，000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)孔徑為O. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌即得無(wú)菌濾液； (b)將直徑10mm的無(wú)菌濾紙片放入步驟(a)制得的無(wú)菌濾液中浸潤(rùn)20min ； (c)將柑橘潰瘍病菌配制為2.O X IO8CFU/ mL的菌懸液，取2 mL菌懸液與冷卻至50°C的200 mL NA培養(yǎng)基混勻，倒入直徑90mm的培養(yǎng)皿制平板，每個(gè)平板20 mL ； (d)往步驟(c)制得的含柑橘潰瘍病菌的平板中央放入步驟(b)制得的浸潤(rùn)拮抗細(xì)菌無(wú)菌濾液的濾紙片，28 0C培養(yǎng)48 h后，觀察記錄拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑菌能力，測(cè)定抑菌圈直徑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法，其特征在于所述步驟(a)中，NB液體培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏3. O g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，水 1,000.0 mL, pH 值 6. 8-7. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法，其特征在于所述步驟(c)中，NA培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏3. O g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨8.0 g，葡萄糖10.O g，牛肉膏 3. O g，瓊脂 18.0 g，水 1,000.0 mL, pH 值 6. 8-7. O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柑橘潰瘍病菌拮抗細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定方法，該方法將拮抗細(xì)菌新鮮菌液接種到NB液體培養(yǎng)基中，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，無(wú)菌濾紙片浸潤(rùn)其中；將柑橘潰瘍病菌配制菌懸液，與NA培養(yǎng)基混勻后制平板；無(wú)菌濾紙片放入平板中央，培養(yǎng)48h后測(cè)定抑菌圈直徑。本發(fā)明系采用拮抗細(xì)菌的無(wú)菌濾液來(lái)測(cè)定其對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制能力，從而為柑橘潰瘍病菌生防細(xì)菌的篩選提供方法。本發(fā)明方法能有效地測(cè)定出分離獲得的拮抗細(xì)菌對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制能力，具有操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)穩(wěn)定性好、抑菌圈寬度測(cè)定準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明方法能篩選出對(duì)柑橘潰瘍病有潛在應(yīng)用價(jià)值的拮抗細(xì)菌。
文檔編號(hào)C12Q1/20GK102766676SQ20121029578
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者易龍 申請(qǐng)人:贛南師范學(xué)院