專利名稱：一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術及纖維原料水解領域，具體涉及一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
木聚糖是植物細胞壁半纖維素的土要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源之一。木糖就存在于半纖維素多縮戊糖中，是亟待開發(fā)的重要可再生資源。如果將半纖維素生物降解為木糖和少量其它單糖，可以用作基本碳源生產各種發(fā)酵產品、工業(yè)酒精及糠醛制備等。同時，木糖的衍生物木糖醇還可作為食品添加劑，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味劑等。木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的較為關鍵的多糖水解酶，通過隨機切割木寡糖的 β -I, 4-糖苷鍵，將木寡糖降解為木糖。由于木糖苷酶可以將寡糖降解為木糖，因此可作為一種高效的工業(yè)酶制劑用于木糖及木糖衍生物的生產，因此具有潛在的應用價值。

發(fā)明內容
發(fā)明目的針對現有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種極耐熱木糖苷酶，以使其滿足使用要求。本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼上述極耐熱木糖苷酶的核苷酸序列。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種極耐熱木糖苷酶的應用。技術方案為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下
一種極耐熱木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一種極耐熱木糖苷酶，氨基酸序列為權利要求I所述的SEQ NO :1序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白質。一種編碼上述的極耐熱木糖苷酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一種可表達上述的極耐熱木糖苷酶的重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。一種擴增上述的編碼極耐熱木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物對為
Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；
Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。上述的極耐熱木糖苷酶在酶解木寡糖中的應用。酶解反應溫度為75-100°C，PH5. 0-7. 5。所述的木寡糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括木二糖、木三糖和木四糖。上述的重組體系在酶解木寡糖中的應用。上述的極耐熱木糖苷酶在酶解玉米秸桿的木寡糖中的應用。有益效果與現有技術相比，本發(fā)明所提供的木糖苷酶具有優(yōu)良的耐熱性能。在95°C、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達到117. 6U/mg ;該蛋白酶在溫度為75-100°C, pH為5. 0-7. 5的范圍內，均具有較高的酶活。該木糖苷酶的耐熱性能極高，在85°C反應體系中，保溫Ih酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木糖苷酶比現有木糖苷酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80°C以上高溫、偏中性的pH條件下木寡糖的降解，具有潛在的工業(yè)應用價值。


圖I是木糖苷酶Tth xylo的SDS-PAGE蛋白電泳 圖2是Tth xylo的最適溫度結果 圖3是Tth xylo的最適pH結果 圖4是Tth xylo的熱穩(wěn)定性結果 圖5是Tth xylo降解玉米秸桿半纖維素TLC圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例I嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌基因組DNA的提取
采用嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌Thermo toga thermarum DSM5069 (購自德國微生物菌種保藏中心)新鮮菌體10g，懸于5mL 50mM Tris緩沖溶液中(pH8. 0)，混勻后在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于 0. 5mL TE 緩沖液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保溫lh，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用0. 5mL超純水溶解。實施例2木糖苷酶基因Tth xylo的制備
可采用如下方法制備Tth xylo基因，也可以采用人工合成的方式得到。認Thermotoga thermarum DSM5069的總DNA (實施例I制備)為模版，用下述引物對進行PCR擴增
Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；
Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’ ；
引物合成時，Tth-I引入Nde I酶切位點，Tth-2引入Xho I酶切位點。PCR 反應體系I μ L T. thermarum 基因組 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應條件94°C變性 5min ;94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，并用PCR產物回收試劑盒進行純化(BI0MIGA，上海)。實施例3重組克隆、表達載體pET-20b-7iA xylo的構建與驗證
將純化過的PCR產物(實施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經濃縮加入8yL無菌水重懸，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應產物轉化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng) 10-12h。從轉化平板上挑取多個單菌落，采用BI0MIGA的質粒小量提取試劑盒提取質粒。對獲得的質粒雙酶切驗證并對獲得的重組質粒進行測序。測序結果顯示，pET-20b載體中插入了所克隆的目的片段(核苷酸長度為2322 bp)，進而得到重組克隆、表達載體pET-20b-m xylo, Tth xylo的核苷酸如SEQ NO 2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ NO I所示，將該蛋白命名為Tth xylo。實施例4重組木糖苷酶Tth xylo的表達與純化 將重組克隆、表達載體pET-20b-Tth xylo (實施例3制備)電轉至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/ml氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養(yǎng)基,在37°C溫度下,200rpm震蕩培養(yǎng)8-12h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養(yǎng)基的1000 mL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)，當吸光度達到0. 6-0. 8時，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導表達10-12h。用高速冷凍離心機將培養(yǎng)液在4°C下一下以13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下一下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mLIXBinding Buffer 重懸(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機破碎細菌細胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木糖苷酶Tthxylo的粗提液。粗提液先經70°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親和層析柱進行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進行，結果見圖1，I即為化過后的Tth xylo蛋白，分子量約為85 kDa，與理論值相近。實施例5重組木糖苷酶Tth xylo的酶學性質分析
酶活定義為1 min內催化4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(ρΝΡΧ)產生I μ mo I對硝基苯酚(pNP)所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為6.0的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施4制得的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。酶活測定反應體系為200 μ L，20mM的4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(PNPX) 10 μ L，180 μ L 0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應體系的pH為6. O。將反應體系在60-1001溫育201^11后，加入60(^1^ IM Na2CO3試劑終止反應，測定410nm的吸光值。實驗設3次重復，取平均值作圖，結果如圖2所示，研究結果表明在95°C時，木糖苷酶具有最高的酶活性，為117. 6 U/mg ;將此溫度下的酶活反應體系的吸光值最為相對活性100%，其它溫度下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性。其中，在溫度75-100°C的反應體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活測定反應體系為200 μ L，20mM的4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(ρΝΡΧ) 10 μ L，180 μ L ρΗ4. 0-ρΗ8. 5的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液(同上)組成。將反應體系在95°C溫育20 min后，加入600 μ L IM Na2CO3試劑終止反應，測定410nm的吸光值，實驗設3次重復實驗，取平均值。結果如圖3所示，研究結果表明，在pH為6. O時，木糖苷酶具有最高的酶活性，為117.6 U/mg;將此pH值下的酶活反應體系的作為相對活性100%，其它pH值下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對活性。在PH5. 0-7. 5的條件下，酶活較高。( 3 )重組酶熱穩(wěn)定性
用PH值為6. O的O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施例4制得的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。將稀釋酶液在75°C、80°C、85°C、90°C和95°C分別水浴30 min、60 min,90 min和120 min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應體系中pH為6. 0，測定溫度為95°C。實驗設3次重復，取平均值。結果如圖4所示，研究結果顯示，85 °C處理I h未見酶活下降，可見該木聚糖在85°C條件下熱穩(wěn)定非常好，該酶在75°C溫育2 h酶活未見下降。實施例6重組木糖苷酶Tth xylo的應用研究
重組木糖苷酶Tth xylo對木寡糖的降解研究,具體步驟如下所述 (I)用pH6. O的上述緩沖液配制1%木二糖、木三糖及木四糖各lmL，混勻后形成1%的混合液。吸取100 μ L混合液，加入上述的緩沖溶液90 μ L與含10 μ L的純化酶于100 μ L的反應體系中，75 °C水浴震蕩O. 5h、lh、2h和3h。(2)分別收集上述lh、2h、3h和4h水解液于_20°C的冰箱中保存。(3)配置上述水解液適宜的TLC的展層劑和顯色劑，展層劑中正丁醇乙酸水=2 I :1，顯色劑為將Ig的3，5-二羥基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。(4)用毛細吸管蘸取少量的1%的木I-木4糖的混合液及上述樣品，分別點至寬度為10cm、長度為20cm的玻璃娃膠板上，點完樣后用吹分機吹干并將娃膠板放置于上述展層劑的層析缸中。(5) 3h后取出玻璃板先風干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通風櫥中用噴壺將硅膠板均勻噴灑，接著在再放置于100°c的干燥箱中烘干。結果如圖5所示，M為木I-木4的標準樣品，1、2、3和4分別為O. 5h、lh、2h和3h
的水解液。研究結果表明，重組木糖苷酶Tth xylo可以快速有效地將木二糖、木三糖及木四糖降解為木糖。因此，此木糖苷酶Tth xylo適用于玉米秸桿等原料的木糖生產。
權利要求
1.一種極耐熱木糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO 1所示。
2.一種極耐熱木糖苷酶，其特征在于氨基酸序列為權利要求I所述的SEQ NO 1序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白質。
3.一種編碼權利要求I所述的極耐熱木糖苷酶的基因，其特征在于DNA序列如SEQNO 2所示。
4.一種可表達權利要求I所述的極耐熱木糖苷酶的重組體系，其特征在于在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。
5.一種擴增權利要求3所述的編碼極耐熱木糖苷酶的基因的方法，其特征在于所使用的引物對為Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。
6.權利要求I或2所述的極耐熱木糖苷酶在酶解木寡糖中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于酶解反應溫度為75-100°C，pH5.0-7. 5。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的木寡糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括木二糖、木三糖和木四糖。
9.權利要求4所述的重組體系在酶解木寡糖中的應用。
10.權利要求I所述的極耐熱木糖苷酶在酶解玉米秸桿的木寡糖中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應用，該極耐熱木糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO1所示。該木糖苷酶具有優(yōu)良的耐熱性能。在95℃、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達到117.6U/mg；該蛋白酶在溫度為75-100℃、pH為5.0-7.5的范圍內，均具有較高的酶活。該木糖苷酶的耐熱性能極高，在85℃反應體系中，保溫1h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木糖苷酶比現有木糖苷酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80℃以上高溫、偏中性的pH條件下木寡糖的降解，具有潛在的工業(yè)應用價值。
文檔編號C12P19/14GK102864132SQ201210333818
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權日2012年9月11日
發(fā)明者王飛, 時號, 李迅, 錢方軍 申請人:南京林業(yè)大學, 沭陽祥泰生物能源科技有限公司