一種N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶試劑及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種N-乙酰-β-D 葡萄糖苷酶檢測(cè)試劑，還涉及使用此檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Ν-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG)是存在于細(xì)胞溶酶體內(nèi)的一種水解酶， 廣泛分布于人體各組織中，但在前列腺和腎臟近端腎小管中含量最高。NAG分子量約為 130-140KD，在正常情況下，血清中NAG不能通過(guò)腎小球從尿中排泄。尿中NAG主要來(lái)自腎 近曲小管上皮細(xì)胞，但健康人尿中含量甚微。尿NAG活性水平的增高，是早期腎損傷和糖尿 病微血管病變的敏感指標(biāo)。NAG活性可用于腎小管間質(zhì)性腎炎、尿路感染、糖尿病腎病綜合 癥、高血壓腎病、腎移植后的排異反應(yīng)和腎病綜合癥的早期診斷。上述疾病時(shí)NAG活性的升 高均早于其他相應(yīng)指標(biāo)，有利于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。NAG活性還可用于重金屬等腎 毒性物質(zhì)環(huán)境污染的人群篩查、職業(yè)病調(diào)查等。
[0003] 目前，NAG的應(yīng)用廣泛的檢測(cè)方法有PNP-NAG法、CNP-NAG法，MPT-NAG法等方法。 PNP-NAG法是以P-硝基苯酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（PNP-NAG)做為底物，在NAG作 用下，生成N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖在N-乙酰氨基葡萄糖氧化酶（NAG0D)的 作用下生成H202。H202在過(guò)氧化物酶（P0D)的作用下與高靈敏的發(fā)色劑雙〔3-雙（4-氯 酚）甲基-4-二甲氨苯基〕胺（BCMA)反應(yīng)，生成綠色色素。通過(guò)測(cè)定此色素可求得NAG的 活力。此底物價(jià)廉，容易獲得，但是必須設(shè)定樣本空白，而且操作時(shí)間較長(zhǎng)，不適合大批量自 動(dòng)化分析。CNP-NAG法是以2-氯-4-硝基苯乙酰氨基葡萄糖苷為底物，經(jīng)NAG酶解后的產(chǎn) 物不需堿化可直接呈色，，無(wú)需設(shè)樣品空白，可實(shí)現(xiàn)大批量自動(dòng)化操作，但底物較難溶，測(cè)定 時(shí)需嚴(yán)格控制緩沖液pH值，底物溶液以新鮮配制為宜，操作繁瑣。MPT-NAG是的測(cè)定原理 是NAG催化6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG)水解，生成產(chǎn) 物6-甲基-2巰基吡啶（ΜΡΤ)，ΜΡΤ在340nm處有強(qiáng)烈吸收能力，通過(guò)測(cè)定340nm處每分鐘 的吸光度增加速度計(jì)算NAG的活力。
[0004]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明使用了新型的VRA-NAG[(4-(3-甲基-苯乙烯)-繞丹寧-3-乙 酸氨基-N-乙酰氨基-beta-D-葡萄糖苷]物，它是一種新的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷 酶的衍生物，它與其他的底物相比具有水溶性好，穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。此外，采用檸檬酸-檸 檬酸鈉緩沖體系，并添加多種表面活性劑起助溶作用，穩(wěn)定劑起穩(wěn)定作用，是一種更加穩(wěn) 定，抗干擾能力更強(qiáng)的NAG試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)尿液中NAG的試劑及使用該試劑檢測(cè)NAG含 量的方法。該試劑盒采用VRA-NAG作為新型底物，可以更加有效的檢測(cè)NAG含量，具有穩(wěn)定 性好，抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0006]基本原理 底物VRA-NAG在樣品中的NAG的催化下，水解釋放出有色化合物集團(tuán)VRA，它在505nm波長(zhǎng)處有吸收峰，檢測(cè)505波長(zhǎng)處吸光度的增加值就可以計(jì)算出NAG活性。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到的： 一種NAG檢測(cè)試劑，包括試劑R1和試劑R2,所述試劑R1和試劑R2的組成如下： 1) 試劑R1的組分為： 緩沖液...............................................100mmol/L VRA-NAG...............................................3mmol/L BSA...................................................lg/L 乙二醇................................................lml/L TritonX-100...........................................lml/L 抗壞血酸氧化酶........................................lml/L 防腐劑................................................2mmol/L 2) 試劑R2的組分為： 緩沖液.................................................lmol/L 防腐劑.................................................2mmol/L 所述的NAG檢測(cè)試劑，試劑R1中緩沖液為25°C，PH為5. 0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖 液。
[0008] 所述的NAG檢測(cè)試劑，試劑R2中緩沖液為25°C，PH為10. 2的碳酸鈉-碳酸氫鈉 緩沖液。
[0009] 所述的NAG檢測(cè)試劑，所述防腐劑為NaN3。
[0010] 所述的NAG檢測(cè)試劑來(lái)檢測(cè)NAG的方法，使用全自動(dòng)生化分析儀利用終點(diǎn)法進(jìn)行 測(cè)定，檢測(cè)主波長(zhǎng)為505nm〇
[0011] 所述的檢測(cè)方法，R1試劑和R2試劑的比例為3 :1。
[0012] 本發(fā)明的有益效果： 1)采用新型底物VRA-NAG，此底物與其他底物相比水溶性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，是一種可靠的NAG底物。
[0013] 2)采用表面活性劑TritonX-100以及乙二醇，對(duì)于底物的溶解具有很顯著的助溶 作用，并增強(qiáng)了試劑的抗干擾能力。
[0014] 3)采用新的緩沖體系檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，大大提高了試劑的分析靈敏 度。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為兩種試劑的相關(guān)性曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行機(jī)一步說(shuō)明： 實(shí)施例1 N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的檢測(cè)試劑，包括試劑R1和試劑R2 : 1)試劑R1的組分為： 檸檬酸-磷酸氫二鈉鈉緩沖液（ΡΗ=5· 0).....................100mmol/L VRA-NAG.................................................3mmol/L BSA.....................................................lg/L 乙二醇..................................................lml/L TritonX-100..............................................lml/L 抗壞血酸氧化酶..........................................lml/L 防腐劑NaN3...............................................2mmol/L 2) 試劑R2的組分為： 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（ΡΗ=10· 2).........................lmol/L 防腐劑NaN3...............................................2mmol/L 3) 本實(shí)施例試劑的使用方法： 本實(shí)施例描述的NAG檢測(cè)試劑，在使用時(shí)采用雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀，如日 立7180全自動(dòng)生化分析儀等，利用兩點(diǎn)終點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定。將R1和R2按照3 :1的比例放置 到對(duì)應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對(duì)應(yīng)位置放置好蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，操作如表1 : 表1實(shí)施例1試劑檢測(cè)方法
計(jì)算：NAG含量（U/L) =(ΔΑ測(cè)定+ΔΑ標(biāo)準(zhǔn)）XC標(biāo)準(zhǔn)。
[0017] 實(shí)施例2 干擾性試驗(yàn)：取新鮮尿液，分為2等份，然后將每等份再分為5等份，加入不同的干擾物 質(zhì)，使其在尿液中濃度達(dá)到表2的要求。然后分別用實(shí)施例1所得試劑，與市場(chǎng)常見(jiàn)并認(rèn)可 的NAG試劑同時(shí)對(duì)比測(cè)定血清中UA的含量，對(duì)照組測(cè)定結(jié)果與加入不同干擾物質(zhì)后各組的 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。相對(duì)偏差（%) =(干擾樣本的測(cè)定均值一對(duì)照樣本的測(cè)定均值）/對(duì)照樣本 的測(cè)定均值X100%。
[0018] 由表2可以看出，實(shí)施例1試劑在乳酸< 0. 9g/L、丙酮酸< 20mg/L、酒石酸< 17 mg/L、尿酸彡g/L、葡萄糖彡g/L、膽紅素彡mg/L對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有明顯干擾。而對(duì)照試劑在 上述濃度干擾物質(zhì)存在時(shí)，受到明顯干擾，這說(shuō)明實(shí)施例1試劑的抗干擾性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì) 比試劑。
[0019] 表2實(shí)施例試劑抗干擾性能比較
實(shí)施例3 相關(guān)性試驗(yàn)：利用實(shí)施例1配方配制試劑，與市場(chǎng)常見(jiàn)的國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn) 可的某公司的NAG試劑盒進(jìn)行對(duì)照檢查，同時(shí)檢測(cè)了 20個(gè)臨床樣本，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。 并獲得了兩種試劑的相關(guān)性曲線(如圖1所示)，通過(guò)結(jié)果顯示，兩個(gè)試劑盒的相關(guān)系數(shù)為 0. 9994,說(shuō)明兩者有極大的相關(guān)性。
[0020] 表3實(shí)施例1與市場(chǎng)常見(jiàn)并得到認(rèn)可的NAG測(cè)定試劑盒對(duì)比檢測(cè)結(jié)果
實(shí)施例4 分析靈敏度實(shí)驗(yàn)：用本發(fā)明NAG檢測(cè)試劑盒測(cè)試已知濃度為38U/L的樣本，記錄吸光 度差值。同時(shí)用市場(chǎng)認(rèn)可的NAG試劑測(cè)試作為對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如表4所示。
[0021] 表4 分析靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果_
通過(guò)檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，對(duì)照試劑的吸光度差值比實(shí)施例1的高，說(shuō)明檸檬酸-磷酸氫二鈉 緩沖液使試劑的緩沖能力得到提高，并大大提高了試劑的分析靈敏度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶檢測(cè)試劑，包括試劑R1和試劑R2,所述試劑R1和 試劑R2的組成如下： 試劑R1的組分為： 緩沖液...................................................100mmol/L VRA-NAG...................................................3mmol/L BSA.......................................................lg/L 乙二醇...................................................lml/L TritonX-100................................................lml/L 抗壞血酸氧化酶............................................lml/L 防腐劑....................................................2mmol/L 試劑R2的組分為： 緩沖液....................................................lmol/L 防腐劑....................................................2mmol/L〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NAG檢測(cè)試劑，其特征在于使用新型底物VRA-NAG。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NAG檢測(cè)試劑，其特征在于試劑R1緩沖液為PH5. 0的檸檬 酸-磷酸氫二鈉緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NAG檢測(cè)試劑，其特征在于試劑R2緩沖液為PH10. 2的碳酸 鈉-碳酸氫鈉緩沖液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NAG檢測(cè)試劑，其特征在于所述防腐劑為NaN3。6. -種使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的NAG檢測(cè)試劑來(lái)檢測(cè)NAG的檢測(cè)方法，其特 征在于使用全自動(dòng)生化分析儀利用兩點(diǎn)終點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)主波長(zhǎng)為505nm。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于R1試劑和R2試劑的比例為3:1。
【專利摘要】本發(fā)明試劑NAG檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別試劑一種NAG檢測(cè)試劑，試劑R1中含有緩沖液、VRA-NAG、牛血清白蛋白、TritonX-100、乙二醇、抗壞血酸氧化酶、防腐劑；試劑R2中含有緩沖液、防腐劑。本試劑采用新型底物VRA-NAG，此底物與其他底物相比水溶性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，是一種可靠的NAG底物。本試劑使用檸檬酸-磷酸氫二鈉做緩沖液，大大提高了試劑的緩沖能力，同時(shí)不破壞反應(yīng)體系。添加TritonX-100以及乙二醇做助溶劑，促進(jìn)底物溶解，具有明顯助溶效果。添加BSA做穩(wěn)定劑，大大增強(qiáng)了試劑的穩(wěn)定性以及抗干擾能力。產(chǎn)品配置簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，非常適合大面積臨床推廣。
【IPC分類】G01N33/573
【公開(kāi)號(hào)】CN105424934
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510723864
【發(fā)明人】譚柏清, 劉慧 , 王綺, 趙新
【申請(qǐng)人】山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月30日