漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因，是GAL3ST4基因第1號外顯子第31位核苷酸由G突變?yōu)锳的突變基因。該關(guān)聯(lián)基因是漏斗胸疾病相關(guān)的GAL3ST4基因的突變體。利用全外顯子組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個漏斗胸相關(guān)基因GAL3ST4的突變基因，該突變基因的鑒定對發(fā)現(xiàn)漏斗胸及其相關(guān)疾病的易感人群和基因診斷有重要價值，對探索漏斗胸及其相關(guān)疾病的發(fā)病機制和開辟新的治療途徑有重要意義。
【專利說明】漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因。
【背景技術(shù)】
[0002]漏斗胸(pectus excavatum, PE)是兒童時期最為常見的胸壁畸形之一,其發(fā)病率國外報導(dǎo)在1-3%。之間，男孩約為女孩的5倍，國內(nèi)尚無確切統(tǒng)計。表現(xiàn)為部分胸骨、肋軟骨及肋骨向脊柱呈漏斗狀凹陷的一種畸形，多自第3肋軟骨開始到第7肋軟骨，向內(nèi)凹陷變形，一般在劍突的上方凹陷最深，有時胸骨偏向一側(cè)。心臟受壓移位，肺也因胸廓畸形而運動受限，影響患兒的心肺功能。患兒活動后心悸氣促，常發(fā)上呼吸道和肺部感染，甚至發(fā)生心力衰竭。癥狀在3歲以后逐趨明顯，凹胸、凸肚、消瘦、發(fā)育差。漏斗胸常是一種先天性并常常是家族性的疾病(Croitoru DP, Kelly RE Jr, Goretsky MJ, et al.The minimallyinvasive Nuss technique for recurrent or failed pectus excavatum repair in50patients:J Pediatr Surg,2005.40:181-187.)。
[0003]目前該病的研究主要限于病例報道，其分子學(xué)發(fā)病機制仍然不明，前面家系報道提示漏斗胸可能為單基因病，但是沒有實際研究證明發(fā)生在哪個基因上的突變導(dǎo)致漏斗胸。由于尋找該病致病基因不僅對發(fā)現(xiàn)易感人群和基因診斷有重要價值，而且對探索其發(fā)病機制和開辟新的治療途徑也有意義，因此亟待尋找一種新的方法以發(fā)現(xiàn)該病的致病基因。
[0004]最近，外顯子組測序(exome sequencing)被成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的致病基因，如Freeman-S heldon綜合癥的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合癥的SETBPl基因，以及嚴重大腦畸形的WDR62突變等(詳見:Ng SB, Turner EH, Robertson PD,et al, Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature 2009,461 (7261):272-276 ；A H,Bff vB,C G, et al,De novo mutations of SETBPlcause Schinzel-Giedion syndrome.D-9216904(-1546-1718(Electronic)) ；BilguvarK, OzturkAK, Louvi A, et al, ffhole-exome sequencing identifies recessive WDR62mutations in severe brain malformations.Nature 2010,467 (7312):207-210.)。該外顯子組測序方法已被證明為降低稀有單基因疾病候選基因甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種新的漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因。
[0006]本發(fā)明提供一種漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因，是GAL3ST4基因第I號外顯子第31位核苷酸由G突變?yōu)锳的突變基因。該關(guān)聯(lián)基因是漏斗胸疾病相關(guān)的GAL3ST4基因的突變體。
[0007]—種重組載體，包括載體及其攜帶的目的基因，所述目的基因是所述的關(guān)聯(lián)基因。
[0008]一種檢測試劑盒，含有能夠識別所述關(guān)聯(lián)基因的試劑。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:利用外顯子組測序發(fā)現(xiàn)一種漏斗胸相關(guān)基因GAL3ST4的突變基因，該突變基因的鑒定對發(fā)現(xiàn)漏斗胸及其相關(guān)疾病的易感人群和基因診斷有重要價值，對探索漏斗胸及其相關(guān)疾病的發(fā)病機制和開辟新的治療途徑有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是測序峰圖，其表示漏斗胸家系中基因GAL3ST4第I號外顯子上g.chr7:99764688G>A突變位點的檢測和驗證的結(jié)果，其中，箭頭表示驗證的結(jié)果及突變位點。
【具體實施方式】 [0011]下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0012]為了尋找漏斗胸的相關(guān)基因，本 申請人:將外顯子組測序與生物信息學(xué)方法相結(jié)合，最終找到了漏斗胸的相關(guān)基因GAL3ST4 (GenBank: 79690)，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及分離的漏斗胸疾病相關(guān)基因GAL3ST4的突變體，其是在GAL3ST4基因的第I號外顯子第31位核苷酸，由鳥苷酸突變?yōu)橄佘账?g.chr7:99764688G>A)。
[0013]本 申請人:在一個中國漢族人四代家系中將該漏斗胸疾病的致病基因定位于7號染色體。并且在散發(fā)漏斗胸人群中驗證了該結(jié)果。
[0014]首先， 申請人:用Agilent SureSelect Human All Exon Kit 結(jié)合 Solexa 高通量測序技術(shù)對該家系中的兩名病例(II 4and III 8)和一名家系內(nèi)正常人(II 7)的外顯子組序列進行了測序，具體測序流程如下:
[0015]I)將基因組DNA隨機打斷成150_200bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上接頭制備雜交文庫(參見http://www.1llumina.com/提供的Illumina/Solexa標準建庫說明書)。
[0016]2)文庫經(jīng)純化后經(jīng)過ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴增與SureSelect Biotiny lated RNA Libra ry (BAITS)進行雜交富集，再經(jīng)過LM-PCR 的線性擴增后進行上機測序。測序平臺為Illumina Hiseq 2000，讀取長度為90bp，每個樣本的平均測序深度最少為50。
[0017]3)測序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Software 1.7進行處理，經(jīng)過過濾去污染、使用 SOAPaligner 2.20 (Li R, Li Y, Kristiansen K, et al, SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformati cs 2008,24(5):713-714 ;Li R,Yu C, Li Y, ea al, S0AP2:an improved ultrafast tool for shortread alignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.)比對參考基因組，獲得比對到基因組上的Unique mapped reads。革巴區(qū)域的基因型由 SOAPsnp (Li R, Li Y,Fang X, Yang H, et al, SNPdetection f or massively parallel whoIe-genome resequencin g.Genome Res 2009,19(6):1124-1132.)確定。然后對數(shù)據(jù)進行標準的信息分析流程，包括對SNP、InDel等進行檢測、注釋和統(tǒng)計分析，得到患者共有的SNP。同時對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控檢測，包括測序深度、覆蓋度均一性等分析的檢測報告。
[0018]一種漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因，是人GAL3ST4基因第I號外顯子第31位核苷酸由G (鳥苷酸)突變?yōu)锳 (腺苷酸)的突變基因。
[0019]一種檢測試劑盒，其含有能夠識別漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因的試劑。[0020]一種重組載體，包括載體及其攜帶的目的基因，目的基因是所述的漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因。該載體可以選自自由克隆載體、真核表達載體、原核表達載體和穿梭載體所組成的組中。
[0021]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下， 還可以做出若干簡單推演或替換。
【權(quán)利要求】
1.一種漏斗胸疾病關(guān)聯(lián)基因，其特征在于，是GAL3ST4基因第I號外顯子第31位核苷酸由G突變?yōu)锳的突變基因。
2.一種重組載體，包括載體及其攜帶的目的基因，其特征在于，所述目的基因是權(quán)利要求I所述的關(guān)聯(lián)基因。
3.—種檢測試劑盒，含有能夠識別權(quán)利要求1所述關(guān)聯(lián)基因的試劑。
【文檔編號】C12N15/12GK103789316SQ201210420857
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月29日
【發(fā)明者】吳松, 孫小娟, 黃毅, 王大平, 蔡志明 申請人:吳松, 孫小娟, 黃毅