專利名稱：冬蟲夏草中國被毛孢合成3-羥基丁酸的酶、基因及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一組來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與乙酰輔酶A出發(fā)合成代謝R-3氧化酰-?；d體蛋白的3-氧化酰-載體蛋白還原酶(3-oxoacy1-[acyl-carrier protein] reductase),編碼這個酶的基因及其應用。R-3 氧化酰-酰基載體蛋白可再經過水解生成3-羥基丁酸。
背景技術：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領域展現(xiàn)出巨大的應用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節(jié)陰陽的中藥?，F(xiàn)代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人·工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產。生產出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產物化學和現(xiàn)代色譜技術的飛速發(fā)展，在對蟲草產品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉向更深層次的功能性代謝產物研究。國內外已對蟲草代謝產物做了大量的研究，代謝產物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。
不飽和脂肪酸是指分子中含有一個或多個雙鍵的脂肪酸，其熔點較飽和脂肪酸低。不飽和脂肪酸是構成體內脂肪的一種脂肪酸，人體必需的脂肪酸，不飽和脂肪酸根據雙鍵個數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸二種。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)相對飽和脂肪酸來說具有更多的功效,它可以降低血中膽固醇和甘油三酯，調節(jié)心臟功能，降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細胞的活性，增強記憶力和思維能力，增強人體防御系統(tǒng)的功能等，此外它還可以排除人體內多余的“垃圾”，也就是由于攝人了過量的飽和脂肪酸形成的多余脂肪，從而達到減肥的目的。因此，其潛在的醫(yī)用藥用價值受到了世界的廣泛關注，引起了食品、醫(yī)藥甚至化妝品等行業(yè)的高度重視。1999 年 Yung-Sheng 引克隆了高山被抱霉(Mortiere Uaalpina)的八6和八12脂肪酸脫氫酶基因并在釀酒酵母中進行了表達。2004年，Dyer等人將桐樹中的Λ 3去飽和酶轉入酵母，成功地獲得了產亞麻酸的酵母菌。2007年Maal1-Amiri等人將藻青菌(Cyanobacterium)的Λ 12去飽和酶轉入馬鈴薯,成功檢測到馬鈴薯脂肪酸成分發(fā)生了明顯變化。2008年，Hao等人將卷枝毛霉的Λ 6去飽和酶轉人轉基因煙草中，成功獲得了高產Y-亞麻酸的菌株。此外，還有許多脂肪酸去飽和酶相關的基因被克隆并轉化應用。由于大部分去飽和酶為膜結合蛋白，其分離純化十分困難，已經分離純化并鑒定的去飽和酶屈指可數(shù)，而絕大多數(shù)的研究是圍繞去飽和酶基因及其表達調控來進行的。目前，所應用的不飽和脂肪酸生產菌以枯草芽孢桿菌為主，而作為重要合成代謝不飽和脂肪酸的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌不飽和脂肪酸合成代謝途徑中相關基因和蛋白的研究還很少見。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝3-羥基丁酸的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與乙酰輔酶A出發(fā)合成代謝R-3氧化酰-?；d體蛋白的酶、編碼基因及其應用。
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本發(fā)明采用的技術方案是: 一種參與乙酰乙?；?酰基載體蛋白出發(fā)合成代謝R-3氧化酰-?；d體蛋白的3-氧化酰-載體蛋白還原酶，與序列為SEQ ID N0.1的UnsB1蛋白，序列為SEQ ID N0.3的UnsB2蛋白，序列為SEQ ID N0.5的UnsB3蛋白或序列為SEQ ID N0.7的UnsB4蛋白具有90%以上同源性；該酶可催化乙酰乙酰基-?；d體蛋白制備相應的R-3氧化酰-?；d體蛋白，R-3氧化酰-?；d體蛋白再經過水解酶的作用生成3-羥基丁酸。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。由乙酰乙?；?酰基載體蛋白合成代謝獲得R-3氧化酰-?；d體蛋白、R-3氧化酰-?；d體蛋白水解生成3-羥基丁酸的路徑如下所示:
權利要求
1.一種參與乙酰輔酶A合成代謝R-3氧化酰-酰基載體蛋白的3-氧化酰-載體蛋白還原酶，與序列為SEQ ID N0.1的UnsB1蛋白，序列為SEQ ID N0.3的UnsB2蛋白，序列為SEQ ID N0.5的UnsB3蛋白或序列為SEQ ID N0.7的UnsB4蛋白具有90%以上同源性。
2.如權利要求1所述的3-氧化酰-載體蛋白還原酶，其特征在于所述3-氧化酰-載體蛋白還原酶為下列之一:序列為SEQ ID N0.1的UnsB1蛋白，序列為SEQ ID N0.3的UnsB2蛋白，序列為SEQ ID N0.5的UnsB3蛋白或序列為SEQ ID N0.7的UnsB4蛋白。
3.如權利要求1所述的3-氧化酰-載體蛋白還原酶，其特征在于該酶來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢。
4.如權利要求1或2所述的3-氧化酰-載體蛋白還原酶在微生物催化制備3-羥基丁酸中的應用。
5.編碼權利要求1或2所述3-氧化酰-載體蛋白還原酶的基因。
6.如權利要求5所述的基因，其特征在于所述基因為:序列為SEQID N0.2的因，序列為SEQ ID N0.4的UnsB2基因，序列為SEQ ID N0.6的UnsB3基因或序列為SEQ IDN0.8 的 UnsB4 基因。
7.如權利要求6所述的基因在構建能夠生物催化乙酰輔酶A制備R-3氧化酰-?；d體蛋白的基因工程 菌中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與乙酰輔酶A出發(fā)合成代謝R-3氧化酰-?；d體蛋白的3-氧化酰-載體蛋白還原酶、編碼基因及應用。該酶與序列為SEQ ID No.1的unsB1蛋白，序列為SEQ ID No.3的unsB2蛋白，序列為SEQ ID No.5的unsB3蛋白或序列為SEQ ID No.7的unsB4蛋白具有90%以上同源性。本發(fā)明從原理上對乙酰乙酰基-?；d體蛋白合成R-3氧化酰-?；d體蛋白代謝途徑進行了詳細研究，包含本發(fā)明核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，賦予宿主3-氧化酰-載體蛋白還原酶的高表達性，為擴大3-羥基丁酸或其衍生物的產量提供了有效途徑，具有重大應用前景。
文檔編號C12N1/21GK103074308SQ20121042530
公開日2013年5月1日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權日2012年10月30日
發(fā)明者鄭裕國, 柳志強, 吳暉, 李邦良, 許靜, 林善, 許峰, 薛亞平, 袁水金, 王鴻艷 申請人:浙江工業(yè)大學, 杭州中美華東制藥有限公司