一種采用含纖維素原料制備乙醇的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種采用含纖維素原料制備乙醇的方法，該方法包括在水的存在下，將含纖維素原料與酶混合，將含纖維素原料酶解，得到酶解產(chǎn)物，并發(fā)酵該酶解產(chǎn)物，其中，所述酶解分多階段進(jìn)行，所述多階段包括連續(xù)進(jìn)行的主酶解階段以及主酶解階段以后的間歇酶解階段，在主酶解階段中，向酶解罐中連續(xù)加入含纖維素原料以及酶，含纖維素原料的加入量以及酶的加入量使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為50-100g/L，并使經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物分別連續(xù)流入后續(xù)階段的酶解罐中進(jìn)行間歇酶解，直至后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖的含量為大于或等于105g/L。本發(fā)明的方法能有效地提高原料的糖轉(zhuǎn)化率，因此大大提高了乙醇的產(chǎn)率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種采用含纖維素原料制備乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)的由含纖維素原料，如秸桿制備乙醇的方法主要包括三個(gè)步驟:1、含纖維素原料的預(yù)處理，2、纖維素的酶解，3、糖的發(fā)酵制乙醇。
[0003]經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的含纖維素原料中的纖維素裸露出來(lái)，在與纖維素酶混合后被纖維素酶水解的反應(yīng)通常稱(chēng)為酶解反應(yīng)，又可以稱(chēng)為糖化反應(yīng)，酶解的主要產(chǎn)物是單糖。纖維素在纖維素酶的作用下能夠轉(zhuǎn)化成葡萄糖，半纖維素在半纖維素酶的作用下能夠轉(zhuǎn)化成木糖等單糖，葡萄糖和木糖都可以用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，比如釀酒酵母可以發(fā)酵葡萄糖制備乙醇，樹(shù)干畢赤酵母可以發(fā)酵木糖制備乙醇。纖維素的非結(jié)晶結(jié)構(gòu)是很容易被打破的，它可以完全降解成葡萄糖，然后由葡萄糖發(fā)酵成乙醇。
[0004]在傳統(tǒng)的采用含纖維素原料制備乙醇的方法中，酶解步驟通常采用間歇式操作，即將含纖維素原料和酶全部加入到一個(gè)酶解罐中并混合均勻，在適當(dāng)?shù)拿附鈼l件下維持至酶解終點(diǎn)，得到酶解產(chǎn)物。所述傳統(tǒng)的間歇式酶解方法的能耗較高，酶的作用效率低，酶解周期長(zhǎng)，且設(shè)備利用率低，因此會(huì)導(dǎo)致采用現(xiàn)有的含纖維素原料制備乙醇得到的乙醇產(chǎn)率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的采用含纖維素原料制備乙醇的方法制備得到的乙醇產(chǎn)率較低的缺陷，提供一種乙醇產(chǎn)率較高的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)·現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)的采用含纖維素原料制備燃料乙醇的方法中，含纖維素原料，如秸桿原料通常是以液漿的形式存在，在將漿液狀的全部秸桿原料直接與酶混合時(shí)，會(huì)使酶濃度降低，使酶活力下降。再者，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的秸桿與酶混合酶解的方法通常為將破碎的秸桿顆粒一次全部加入到酶與水的混合液中與酶液混合，進(jìn)行酶解糖化反應(yīng)，或者，先將所用反應(yīng)物料一經(jīng)預(yù)處理的秸桿顆粒于反應(yīng)罐中與水混合，然后在酶解溫度下，將酶直接加入到反應(yīng)罐中反應(yīng)。盡管上述混合是在攪拌條件下進(jìn)行的，但是秸桿顆粒仍然不容易與酶混合均勻。因?yàn)?，?jīng)過(guò)預(yù)處理后的秸桿粒度變小，顆粒以及碎屑狀的秸桿顆粒很容易互相粘連和團(tuán)聚，因此一次將全部秸桿完全與酶混合，僅有部分秸桿能與酶充分接觸，但是由于秸桿之間的粘連和團(tuán)聚也會(huì)有部分秸桿不能充分與酶接觸，即使在攪拌下，也不能完全將秸桿打散，從而導(dǎo)致酶的利用率較低。因此，酶解后纖維素轉(zhuǎn)化為糖的轉(zhuǎn)化率低，且酶解周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致糖發(fā)酵得到的乙醇的產(chǎn)率較低。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種采用含纖維素原料制備乙醇的方法，該方法包括在水的存在下，將含纖維素原料與酶混合，將含纖維素原料酶解，得到酶解產(chǎn)物，并發(fā)酵該酶解產(chǎn)物，其中，所述酶解分多階段進(jìn)行，所述多階段包括連續(xù)進(jìn)行的主酶解階段以及主酶解階段以后的間歇酶解階段，在主酶解階段中，向酶解罐中連續(xù)加入含纖維素原料以及酶，含纖維素原料的加入量以及酶的加入量使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為50-100g/L，并使經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物分別連續(xù)流入后續(xù)階段的酶解罐中進(jìn)行間歇酶解，直至后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖的含量為大于或等于105g/L。
[0008]本發(fā)明的方法通過(guò)采用連續(xù)酶解與間歇酶解相結(jié)合的方式，使含纖維素原料能與酶混合均勻并充分接觸，并且在反應(yīng)過(guò)程中，酶的濃度一直保持在較高的水平，因此，含纖維素原料能與酶充分反應(yīng)，從而有效地提高了原料的糖轉(zhuǎn)化率，因此大大提高了乙醇的產(chǎn)率。例如，在其它的蒸汽爆破條件都相同的情況下，實(shí)施例1的乙醇產(chǎn)率達(dá)18.65%，酶解周期僅為64小時(shí)；而對(duì)比例I的乙醇產(chǎn)率僅為17.16%，酶解周期高達(dá)88小時(shí)，乙醇產(chǎn)率提高幅度達(dá)8.7%，酶解周期縮短20小時(shí)以上，并同時(shí)提高的設(shè)備利用率并降低了綜合能耗。
[0009]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0011]本發(fā)明提供的采用含纖維素原料制備乙醇的方法包括在水的存在下，將含纖維素原料與酶混合，將含纖維素原料酶解，得到酶解產(chǎn)物，并發(fā)酵該酶解產(chǎn)物，其中，所述酶解分多階段進(jìn)行，所述多階段包括連續(xù)進(jìn)行的主酶解階段以及主酶解階段以后的間歇酶解階段，在主酶解階段中，向酶解罐中連續(xù)加入含纖維素原料以及酶，含纖維素原料的加入量以及酶的加入量使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為50-100g/L(5-10%)，并使經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物分別連續(xù)流入后續(xù)階段的酶解罐中進(jìn)行間歇酶解，直至后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖的含量為大于或等于105g/L(10.5%)。其中，該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量指從主酶解階段的最后一個(gè)酶解罐中流出的酶解產(chǎn)物中單糖的含量；酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖的含量指經(jīng)過(guò)主酶解階段以及后續(xù)的酶解階段后得到的最終的酶解產(chǎn)物中單糖的含量。
[0012]按照本發(fā)明，所述主酶解階段為連續(xù)進(jìn)行酶解的階段，在該主酶解階段中，向酶解罐中連續(xù)加入含纖維素原料以及酶，能夠保證酶與纖維素原料的充分接觸、混合，并保證經(jīng)過(guò)主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖達(dá)到一定的濃度，從而利于酶解周期的優(yōu)化。優(yōu)選情況下，含纖維素原料的加入量以及酶的加入量使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為60-80g/L。
[0013]按照本發(fā)明，在主酶解階段中，所述連續(xù)加入的含纖維素原料以及酶的加入量只要保證使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為50-100g/L(5-10%)，更優(yōu)選為60-80g/L (6.0-8.0%)即可，并且所述含纖維素原料的加入量可以根據(jù)生產(chǎn)能力而定，例如，可以為10-300千克/小時(shí)。
[0014]按照本發(fā)明，所述多階段包括主酶解階段的依次串聯(lián)的多個(gè)酶解階段的酶解罐，以及與位于主酶解階段末位的酶解罐連通的后續(xù)間歇酶解階段的多個(gè)并聯(lián)的酶解罐。即，所述對(duì)主酶解階段以及后續(xù)的間歇酶解階段中的每個(gè)酶解階段均優(yōu)選對(duì)應(yīng)一個(gè)酶解罐。其中，本發(fā)明對(duì)所述連續(xù)進(jìn)行的主酶解階段以及后續(xù)的間歇酶解階段所用的酶解罐的種類(lèi)和數(shù)量沒(méi)有特別限定，可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的酶解罐。它們的位置可以在高度相同的一個(gè)平面上或者高度不同的平面上，呈梯級(jí)式。本發(fā)明優(yōu)選多個(gè)酶解罐在一個(gè)平面上串聯(lián)連接。
[0015]按照本發(fā)明，所述主酶解階段的酶解罐的數(shù)量沒(méi)有特別限定，從主酶解階段的效率以及縮短酶解周期的角度考慮，優(yōu)選情況下，所述主酶解階段包括依次串聯(lián)的2-3個(gè)酶解罐，即，依次包括串聯(lián)的兩個(gè)或三個(gè)酶解罐；優(yōu)選情況下，將含纖維素原料連續(xù)加入主酶解階段的第一酶解階段的酶解罐中，為了更好地保證酶解效果，將酶分別連續(xù)加入主酶解階段的第一酶解階段的酶解罐和與其串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中。在所述第二酶解罐中加入酶的方式，優(yōu)選，待第一酶解階段得到的酶解產(chǎn)物流入第二酶解階段的酶解罐后再連續(xù)向第二酶解階段的酶解罐中加入酶。
[0016]按照本發(fā)明，對(duì)主酶解階段以后的間歇酶解階段的酶解罐的數(shù)量沒(méi)有特別的限制，從充分酶解和生產(chǎn)周期的縮短以及設(shè)備的利用率等方面綜合考慮，優(yōu)選情況下，所述主酶解階段以后的間歇酶解階段包括并聯(lián)的2-4個(gè)酶解罐。
[0017]按照本發(fā)明，更優(yōu)選情況下，所述主酶解階段包括連續(xù)進(jìn)行的三個(gè)酶解階段，即，位于首位的第一酶解階段的酶解罐，與第一酶解階段的酶解罐串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐以及與第二酶解階段的酶解罐串聯(lián)的第三酶解階段的酶解罐，即優(yōu)選位于主酶解階段的末位的為第三酶解階段的酶解罐，將由第三酶解階段得到的酶解產(chǎn)物分別連續(xù)送入與之連通的后續(xù)的間歇酶解階段的多個(gè)并聯(lián)的酶解罐中繼續(xù)進(jìn)行酶解。
[0018]按照本發(fā)明，在所述主酶解階段中，所述串聯(lián)的多個(gè)酶解階段的酶解罐輸送酶解產(chǎn)物的方式多為溢流方式，且每個(gè)酶解階段的酶解程度也與纖維素原料以及酶的流量以及--體積有關(guān)。
[0019]具體地，在所述主酶解階段中，后一酶解階段的酶解罐的物料入口和與其相鄰的前一酶解階段的酶解罐的物料出口相連通。每個(gè)酶解階段的酶解罐的物料入口可以位于酶解罐的上部，與之對(duì)應(yīng)，每個(gè)酶解階段的物料出口可以位于酶解罐的下部；或者每個(gè)酶解階段的酶解罐的物料入口也可以位于酶解罐的下部，與之對(duì)應(yīng)，每個(gè)酶解罐的物料出口也可以位于酶解罐的上部。在所述主酶解解`階段中，從第一酶解階段的酶解罐的物料入口連續(xù)加入含纖維素原料和酶，使含纖維素原料酶解，待第一酶解階段的酶解產(chǎn)物從酶解罐的物料出口流出進(jìn)入第二酶解階段的酶解罐中，將酶連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐中，從而與第一酶解階段酶解的酶解產(chǎn)物混合，繼續(xù)酶解，經(jīng)第二酶解階段酶解的酶解產(chǎn)物從第二酶解罐的物料出口流出進(jìn)入第三酶解階段的酶解罐中繼續(xù)充分酶解，而后將酶解產(chǎn)物分別連續(xù)送入與之連通的后續(xù)的間歇酶解階段的多個(gè)并聯(lián)的酶解罐中繼續(xù)進(jìn)行酶解直至酶解終點(diǎn)；后續(xù)間歇酶解的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，將經(jīng)過(guò)主酶解階段的酶解產(chǎn)物分別連續(xù)流入間歇酶解階段的多個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，并優(yōu)選按照酶解罐的順序依次引入。按照引入的順序，將經(jīng)過(guò)間歇酶解的終點(diǎn)酶解產(chǎn)物依次引出，并再次連續(xù)引入經(jīng)過(guò)主酶解階段酶解后的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)酶解。例如，以三個(gè)并聯(lián)的酶解罐為例，將經(jīng)過(guò)主酶解階段酶解產(chǎn)物先連續(xù)引入間歇酶解階段的第一酶解罐中，待物料注滿后，繼續(xù)引入間歇酶解階段的第二酶解罐中，待物料注滿后，繼續(xù)引入間歇酶解階段的第三酶解罐中，在向該第三酶解罐中引入的同時(shí)將第一酶解罐的物料連續(xù)引出，待第三酶解罐中的物料注滿后，將經(jīng)過(guò)主酶解階段的酶解產(chǎn)物再次引入該間歇酶解階段的第一酶解罐中。
[0020]此外，由于酶解產(chǎn)物粘度較大，流動(dòng)性較差，因此，可以將后一酶解階段的酶解罐的物料入口設(shè)置成比所述前一酶解階段的酶解罐的物料入口稍低。另外，并可以通過(guò)泵送幫助粘稠的酶解產(chǎn)物順利地流入到下一個(gè)酶解罐中。
[0021]所述酶解罐的結(jié)構(gòu)及酶解罐的串聯(lián)連接方式都是本領(lǐng)域公知的，在此不再贅述。每個(gè)酶解罐中物料的初始裝液量通常為每個(gè)酶解罐體積的50-70% ;當(dāng)物料的流入和流出達(dá)到平衡后，將每個(gè)酶解罐的裝液量調(diào)節(jié)至酶解罐體積的80%左右。
[0022]按照本發(fā)明，酶解使用的酶通常包括纖維素酶，出于成本和效果的綜合考慮，優(yōu)選以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為8-20酶活力單位，更優(yōu)選為10-15酶活力單位。
[0023]例如，當(dāng)所述以干重計(jì)的含纖維素原料的加入量為300-350千克/小時(shí)，優(yōu)選為310-330千克/小時(shí)，在所述主酶解階段中，所述纖維素酶的加入總量為2.4X106-7.0 X IO6酶活力單位/小時(shí)，更優(yōu)選為3.0 X 106-5.25 X IO6酶活力單位/小時(shí)(纖維素酶的加入總量包括主酶解階段的向多個(gè)酶解罐，如第一酶解罐和第二酶解罐中加入的纖維素酶的總量)。
[0024]按照本發(fā)明，優(yōu)選情況下，在所述主酶解階段中，為了在盡量短的時(shí)間內(nèi)保證得到的酶解產(chǎn)物具有一定的單糖含量，連續(xù)向第一酶解階段的酶解罐加入的酶占酶總加入量的50%-70%，向第二酶解階段的酶解罐加入的酶占酶總加入量的30%-50%。因此，在上述含纖維素原料的加料量的前提下，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為
1.2X 106-4.9X IO6酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為0.72X 106-3.5 X IO6酶活力單位/小時(shí)。
[0025]優(yōu)選情況下，所述酶解使用的酶還包括半纖維素酶。因?yàn)榘肜w維素酶可以降解半纖維素成為溶于水的木糖，所以酶解使用的酶包括半纖維素酶，一方面可以更充分地暴露纖維素，增加纖維素與纖維素酶的接觸幾率，另一方面半纖維素降解產(chǎn)物木糖能夠被樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵生成乙醇，兩方面作用都可以增加乙醇產(chǎn)率。
·[0026]本發(fā)明的方法還包括在主酶解階段中，以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述半纖維素酶的用量為4.4-8.8酶活力單位。在上述含纖維素原料的加料量的前提下，將半纖維素酶分別連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐和第二酶解階段的酶解罐中，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的半纖維素酶的加入量為0.66Χ 106-2.156 X IO6酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的半酶解罐的纖維素酶的加入量為0.396X IO6-L 54Χ106酶活力單位/小時(shí)。
[0027]由于本發(fā)明僅涉及對(duì)酶解方式的改進(jìn)，因此對(duì)用含纖維素的原料制備乙醇的方法的其它步驟沒(méi)有特別的限制。
[0028]其中，所述纖維素酶可以通過(guò)各種方式獲得，例如商購(gòu)得到，或者通過(guò)使用產(chǎn)酶微生物分泌得到。由于使用產(chǎn)酶微生物分泌得到的酶會(huì)含有各種副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。本發(fā)明所述纖維素酶的酶活力按照美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(National Renewable
Energy Laboratory, NREL)提供的標(biāo)準(zhǔn)方法-纖維素酶活力測(cè)定NREL LAP-006測(cè)定，
所述纖維素酶的酶活力單位為在該標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的測(cè)定條件下，I分鐘內(nèi)將I克WhatmanN0.1濾紙轉(zhuǎn)化為葡萄糖所需酶的微克數(shù)。
[0029]按照本發(fā)明，所述纖維素酶為復(fù)合酶，至少包括C1型纖維素酶、Cx型纖維素酶和纖維二糖酶三種酶。
[0030]C1酶可以使結(jié)晶的纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)晶的纖維素。
[0031]Cx型纖維素酶又分為Cxi型纖維素酶和Cx2型纖維素酶兩種。CX I型纖維素酶為內(nèi)切型纖維素酶，可以從水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部作用于β_1，4-糖苷鍵，生成纖維糊精和纖維二糖。Cx2型纖維素酶是一種外切型纖維素酶，可以從水合非纖維素分子的非還原端作用于β-1，4-糖苷鍵，逐一切斷β-1，4-糖苷鍵生成葡萄糖。
[0032]纖維二糖酶則作用于纖維二糖，生成葡萄糖。
[0033]本發(fā)明所述半纖維素酶的酶活力單位(U)為在50°C、pH=4.8條件下，每分鐘分解濃度為I重量％木聚糖溶液產(chǎn)生I微克還原糖(以木糖計(jì))所需的酶量。
[0034]本發(fā)明所述半纖維素酶的活力指每克半纖維素酶所具有的活力單位。所述半纖維素酶的活力利用半纖維素酶在50°C、pH為4.8的條件下水解I重量％木聚糖產(chǎn)生還原糖(以木糖計(jì))，所得還原糖與過(guò)量3，5—二硝基水楊酸(DNS)發(fā)生顏色反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)得反應(yīng)液550納米的光吸收值與還原性糖(以木糖計(jì))的生成量成正比關(guān)系測(cè)定。具體測(cè)定方法如下:
[0035]準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000克木聚糖，用0.5毫升pH=4.8的0.1摩爾/升乙酸-乙酸鈉緩沖溶液溶解，然后用去離子水定容到100毫升，得到I重量％木聚糖溶液；
[0036]稱(chēng)取30克四水合酒石酸鉀鈉放入500毫升錐形瓶?jī)?nèi)，加16克NaOH后，加50毫升去離子水，以5°C /分鐘的速度水浴加熱至固體物質(zhì)溶解，加入I克3，5- 二硝基水楊酸，至溶解，冷卻至室溫，用去離子水定容至100毫升，可得3，5- 二硝基水楊酸(DNS)溶液；
[0037]將木糖80°C烘干至恒重，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000克溶于1000毫升水中，加10毫克疊氮化鈉防腐，得到I毫克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液；
[0038]準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000克固體半纖維素酶或移取I毫升液體半纖維素酶原液，用0.5毫升pH=4.8的0.1摩爾乙酸-乙酸鈉緩沖溶液溶解，然后用去離子水定容到100毫升，得到稀釋100倍的待測(cè)酶液；
`[0039]分別將在50°C水浴加熱60分鐘的2毫升木糖梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.3毫克/毫升、0.4毫克/毫升和0..5毫克/毫升，所述木糖梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液用去離子水與I毫克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液混合制備)或去離子水(木糖空白對(duì)照)，與2毫升DNS混合沸水浴5分鐘，冷卻，去離子水定容15毫升后，用分光光度計(jì)在550納米下分別測(cè)定反應(yīng)后木糖梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的光吸收值，以光吸收值為橫坐標(biāo)，木糖濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由該標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回歸方程y=bx+a，其中，X為光吸收值，y為木糖濃度，a為所得直線方程的截距，b為所得直線方程的斜率；
[0040]取0.2毫升待測(cè)酶液與1.8毫升所述I重量％木聚糖溶液或pH = 4.8的0.1摩爾/升乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(木聚糖空白對(duì)照)，按照與上述木糖梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的步驟測(cè)試光吸收值。并按照下式計(jì)算半纖維素酶的活力:
[0041]
半纖維素酶的活力= {bx+a)xnx5x\000 克(毫升)
[0042]式中X為待測(cè)酶液的光吸收值，b和a與木糖濃度對(duì)光吸收值的回歸方程中的b和a—致，η為酶的稀釋倍數(shù)，60表示為酶促反應(yīng)的時(shí)間為60分鐘，5為取樣倍數(shù)(這里從I毫升待測(cè)酶液中取出了 0.2毫升進(jìn)行測(cè)試)。
[0043]根據(jù)上述方法可以測(cè)定出具體的半纖維素酶的活力，進(jìn)而計(jì)算出半纖維素酶的用量。[0044]按照本發(fā)明，所述酶解的溫度可以為纖維素酶的任何最適作用溫度，一般為45-55°C，更優(yōu)選為48-52°C。所述酶解的時(shí)間只要保證經(jīng)過(guò)主酶解階段的酶解以及后續(xù)的間歇酶解階段的酶解后得到的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖的含量為大于或等于105g/L(10.5%)即可，采用本發(fā)明的酶解方式后，以傳統(tǒng)的單罐酶解方法相比，酶解周期能夠縮短18小時(shí)以上。所述酶解周期指從將酶與含纖維素原料混合時(shí)開(kāi)始計(jì)算直至酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖濃度達(dá)到要求為止所用的時(shí)間。
[0045]為了保證酶具有最佳的反應(yīng)活性，在將含纖維素原料與酶混合前，調(diào)節(jié)含纖維素原料的PH值為大于3小于7，優(yōu)選為4.0-6.0，以使得含纖維素原料與酶混合后，酶具有最佳的反應(yīng)活性。所述調(diào)節(jié)反應(yīng)物料PH值的方法可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法。如根據(jù)所得含纖維素原料的PH值，在該含纖維素原料中加入酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)。例如，所述酸性物質(zhì)可以是硫酸、鹽酸和磷酸中的一種或幾種；所述堿性物質(zhì)可以是氫氧化鈉和/或氫氧化鉀。
[0046]為了使酶與反應(yīng)原料混合的更均勻，所述含纖維素原料的酶解優(yōu)選在水存在條件下進(jìn)行，因此，為了進(jìn)料方便，更優(yōu)選先向位于主酶解階段首位的酶解罐中加入水，并連續(xù)加入含纖維素原料以及酶，以使含纖維素原料與水混合得到懸浮液，更利于位于主酶解階段首位的酶解罐中的物料粘度的降低。對(duì)所加入的水的量沒(méi)有特別限定，優(yōu)選情況下，所述水的加入量與全部含纖維素原料的重量比為1:1-3。
[0047]所述含纖維素原料可以是各種農(nóng)作物的秸桿、草本植物的莖桿等，如玉米秸桿、稻草、小麥秸桿、高粱桿等。由于秸桿的主要成分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，為了在酶解時(shí)能使纖維素酶和半纖維素酶充分與秸桿中的纖維素和半纖維素接觸進(jìn)行充分酶解，在酶解之前優(yōu)選還對(duì)含纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理以將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分離開(kāi)。
[0048]所述含纖維素原料 的預(yù)處理方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如，酸處理方法和/或蒸汽爆破方法。所述酸處理方法包括將含纖維素原料與酸混合以溶解木質(zhì)素而使之與纖維素和半纖維素分離。所述用于溶解含纖維素原料中的木質(zhì)素的酸的種類(lèi)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，如:所述酸可以是本領(lǐng)域常規(guī)的各種酸，如，選自硫酸、鹽酸和磷酸中的一種或幾種；所述酸的用量和濃度沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)需要溶解的含纖維素原料中木質(zhì)素的量控制酸的用量和濃度。
[0049]所述蒸汽爆破的方法包括將含纖維素原料與水混合后進(jìn)行蒸汽爆破或者直接將含纖維素原料置于蒸汽爆破裝置中進(jìn)行蒸汽爆破。由于蒸汽爆破方法更有利于破壞含纖維素原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使纖維素能夠被充分分離出來(lái)，有利于纖維素酶在纖維素表面的作用，提高纖維素的水解率及糖的產(chǎn)率。因此，本發(fā)明優(yōu)選所述含纖維素原料的預(yù)處理方法為蒸汽爆破方法，所述含纖維素原料優(yōu)選為蒸汽爆破的含纖維素原料。
[0050]采用現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)的蒸汽爆破條件進(jìn)行的蒸汽爆破都能達(dá)到本發(fā)明的發(fā)明目的，例如，所述蒸汽爆破的溫度為160-200°C，所述蒸汽爆破的壓力為0.6-1.6兆帕，所述蒸汽爆破壓力的維持時(shí)間為3-10分鐘。更優(yōu)選所述蒸汽爆破的溫度為160-180°C，所述蒸汽爆破的壓力為0.6-1.0兆帕，所述蒸汽爆破壓力的維持時(shí)間為4-8分鐘。
[0051]能夠發(fā)酵戊糖和/或己糖的微生物都可以用于本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程，由于釀酒酵母是釀酒工業(yè)上普遍應(yīng)用的耐酒精、副產(chǎn)物少、乙醇產(chǎn)率高的發(fā)酵己糖的微生物；樹(shù)干畢赤酵母為既可以發(fā)酵戊糖也可以發(fā)酵己糖的微生物(參見(jiàn)“樹(shù)干畢赤酵母連續(xù)發(fā)酵戊糖己糖生成酒精”，季更生等，南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，第28卷第3期，第9-13頁(yè)，2004年)，因此優(yōu)選所述發(fā)酵所使用的酵母為樹(shù)干畢赤酵母和/或釀酒酵母。以每克酶解產(chǎn)物計(jì)，所述發(fā)酵所使用的酵母的接種量為IO3-1O8菌落形成單位，更優(yōu)選IO4-1O6菌落形成單位。本發(fā)明發(fā)酵所使用的酵母可以為商購(gòu)酵母固體制劑(比如干酵母粉)或酵母菌種(比如ATCC編號(hào)2601的啤酒酵母)。所述酵母的菌落形成單位可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法測(cè)定，比如亞甲基藍(lán)染色活菌計(jì)數(shù)法。亞甲基藍(lán)染色活菌計(jì)數(shù)法的具體方法如下:
[0052]將I克干酵母粉溶于10毫升無(wú)菌水中，或?qū)毫升菌種活化液用無(wú)菌水稀釋至10毫升，加入0.5毫升0.1重量％亞甲基藍(lán)，在35°C下保溫30分鐘。在10倍光學(xué)顯微鏡下，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)保溫后的溶液中活菌的數(shù)目(死菌染色，活菌不染色)，可得I克干酵母或I毫升菌種活化液中活菌的數(shù)目，即菌落形成單位數(shù)。
[0053]所述酵母可以采用常規(guī)的方法接種，例如向酶解產(chǎn)物中加入5-15體積％的種子液。所述種子液可以為干酵母的水溶液或培養(yǎng)基溶液，也可以為干酵母或商購(gòu)菌種的活化種子液。所述發(fā)酵的溫度可以為任何適于酵母生長(zhǎng)的溫度，優(yōu)選為30-36°C，更優(yōu)選為32-35°C。所述發(fā)酵的時(shí)間可以為從接種開(kāi)始至酵母生長(zhǎng)的衰亡期出現(xiàn)(即發(fā)酵時(shí)間為遲滯期、對(duì)數(shù)期加上穩(wěn)定期)的時(shí)間，優(yōu)選發(fā)酵的時(shí)間為32-48小時(shí)，更優(yōu)選32-40小時(shí)。發(fā)酵產(chǎn)物乙醇可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求(比如燃料酒精要求乙醇的純度達(dá)99%以上)分離并精制，比如蒸餾、濃縮、除水。
[0054]另外，蒸汽爆破的壓力和溫度可以滅菌，酸處理也能夠起到殺菌的作用。為防止在酶解過(guò)程中雜菌(主要是細(xì)菌)污染產(chǎn)生影響酶活力的毒素，并防止在發(fā)酵過(guò)程中雜菌污染影響酵母的生長(zhǎng)，優(yōu)選在酶解之前加入諸如工業(yè)青霉素的細(xì)菌抗生素，所述抗生素對(duì)酵母沒(méi)有作用但可以抑制雜菌的生長(zhǎng)。以每毫升酶解液或發(fā)酵液為基準(zhǔn)，所述抗生素的加入量為1-10單位。所述酶解液包括蒸汽爆破產(chǎn)物、酶以及水，所述發(fā)酵液包括酶解產(chǎn)物和接種的酵母。
[0055]由于含纖維素原料中可能會(huì)含有沙石雜質(zhì)以及鐵雜質(zhì)，對(duì)蒸汽爆破設(shè)備會(huì)造成損害，因此本發(fā)明的制備乙醇的方法，可以包括在蒸汽爆破之前對(duì)含纖維素原料進(jìn)行除石除鐵常規(guī)操作，比如以“風(fēng)送”含纖維素原料并磁鐵吸引的方法進(jìn)行除石除鐵。沙石由于質(zhì)量大，不能被風(fēng)送到蒸汽爆破設(shè)備中，鐵雜質(zhì)由于磁鐵的吸引也不會(huì)隨原料進(jìn)入蒸汽爆破設(shè)備中，從而可以完成除石除鐵。此外，由于含纖維素原料本身容易纏結(jié)而堵塞設(shè)備管路，因此，在進(jìn)入蒸汽爆破設(shè)備前，優(yōu)選使所述含纖維素原料的大小為0.5-3厘米X0.2-1厘米X0.2-1厘米，更優(yōu)選使所述含纖維素原料的大小為1-2厘米X0.4-0.6厘米X0.5-1厘米。
[0056]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0057]另外需要說(shuō)明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。
[0058]此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。
[0059]以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0060]下述實(shí)施例中，所使用的酶解罐是宜興市制藥設(shè)備廠生產(chǎn)的型號(hào)為Φ 2800 X 3500, ss304、容量為21500L的酶解罐，所使用的纖維素酶是諾維信酶制劑公司生產(chǎn)的牌號(hào)為NS50010的纖維素酶，本發(fā)明中所使用的半纖維素酶是諾維信酶制劑公司生產(chǎn)的牌號(hào)為NS50013的半纖維素酶，本發(fā)明所使用的釀酒酵母是湖北安琪酵母股份公司生產(chǎn)的安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母。
[0061]實(shí)施例1
[0062]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
[0063]( I)含纖維素原料的預(yù)處理
[0064]將1000千克沒(méi)有雜質(zhì)的玉米秸桿(含水量10重量％)切成不超過(guò)1.2厘米X0.5厘米X 1.0厘米的小段，在180°C下維持1.0兆帕的壓力5分鐘，然后泄壓，完成蒸汽爆破。共得到1800千克蒸汽爆破產(chǎn)物(含水量為50重量％)。
[0065]所得固體蒸汽爆破產(chǎn)物中纖維素總重量和半纖維素總重量的測(cè)定:
[0066]取10克上述蒸汽爆破產(chǎn)物在45 °C下烘干至恒重5克，稱(chēng)量300.0毫克該干燥后的蒸汽爆破產(chǎn)物，放置于重80克的100毫升干燥三角燒瓶?jī)?nèi)。向所述三角燒瓶?jī)?nèi)加入3.00毫升濃度為72重量％的硫酸溶液，攪拌I分鐘。然后將三角燒瓶在30°C的水浴中放置60分鐘，每隔5分鐘攪拌一次以確保均勻水解。水解結(jié)束后，用去離子水使硫酸的濃度稀釋到4重量％，然后用布氏漏斗過(guò)濾，共得到濾液84毫升。將20毫升濾液轉(zhuǎn)移至干燥的50毫升的三角瓶中。使用2.5克碳酸鈣調(diào)節(jié)該濾液的pH值至5.5，靜置5小時(shí)，收集上層清液。用0.2微米濾膜過(guò)濾收集的上層清液`，所得濾液用Biorad AminexHPX-87P高效液相色譜(HPLC)分析。HPLC條件:進(jìn)樣量20微升；流動(dòng)相為0.2微米濾膜過(guò)濾并且超聲振蕩脫氣的HPLC超純水；流速為0.6毫升/分鐘；柱溫80-85°C ;檢測(cè)器溫度80_85°C ;檢測(cè)器為折光率檢測(cè)器；運(yùn)行時(shí)間為35分鐘。以0.1-4.0毫克/毫升濃度范圍的D- ( + )葡萄糖和0.1-4.0毫克/毫升濃度范圍D- ( + )木糖作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。HPLC分析得到蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解液中葡萄糖濃度為2.67毫克/毫升，計(jì)算可得I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解能得到重量為0.224克的葡萄糖，因?yàn)闈舛葹?2重量％的硫酸溶液可以將蒸汽爆破的產(chǎn)物的纖維素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破產(chǎn)物中纖維素重量的1.11倍，即I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物中含纖維素0.202克，則1800千克蒸汽爆破產(chǎn)物中共含纖維素363千克。HPLC分析得到蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解液中木糖濃度為0.667毫克/毫升，計(jì)算可得I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解能得到重量為0.055克的木糖，因?yàn)闈舛葹?2重量％的硫酸溶液可以將蒸汽爆破的產(chǎn)物的半纖維素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破產(chǎn)物中半纖維素重量的1.14倍，即I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物中含半纖維素0.048克，則1800千克蒸汽爆破產(chǎn)物中共含半纖維素87千克。
[0067](2)酶解
[0068]所述酶解分多階段進(jìn)行，所述多階段包括連續(xù)進(jìn)行的主酶解階段以及主酶解階段以后的間歇酶解階段，所述主酶解階段包括依次串聯(lián)的3個(gè)酶解階段的酶解罐，后續(xù)間歇酶解階段包括3個(gè)并聯(lián)的酶解罐，所述主酶解階段末位的酶解罐分別與后續(xù)間歇酶解階段的3個(gè)并聯(lián)的酶解罐連通。[0069]將上述蒸汽爆破產(chǎn)物與水的混合物(蒸汽爆破產(chǎn)物與水的重量比為1.4:1)調(diào)節(jié)PH值為5，加熱至52°C后，連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解罐中，所述蒸汽爆破產(chǎn)物的加入量為28.13千克/小時(shí)，先將纖維素酶連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解階段的酶解罐中，待位于首位的酶解罐中的酶解產(chǎn)物開(kāi)始流入與首位串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中時(shí)，并在52°C下，將纖維素酶連續(xù)加入該第二酶解階段的酶解罐中，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為9.4X IO4酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為4.7 X IO4酶活力單位/小時(shí)；以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為10酶活力單位，分別將主酶解階段首位、第二位和第三位酶解罐中流出的酶解產(chǎn)物取樣(主酶解階段的時(shí)長(zhǎng)為每罐12小時(shí))，用布氏漏斗過(guò)濾，將20毫升濾液轉(zhuǎn)移至干燥50毫升的三角瓶中，靜置5小時(shí)，收集上層清液。0.2微米濾膜過(guò)濾收集的上層清液，按照上述步驟(1)所述高效液相條件，得出由主酶解階段的位于首位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為36克/L，位于第二位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為48克/L，位于第三位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為64克/L。
[0070]將由所述主酶解階段的末位酶解罐的酶解產(chǎn)物分別依次連續(xù)送入與其連通的3個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，在上述酶解條件下保溫混合28小時(shí)進(jìn)行間歇酶解，按照上述方法測(cè)定后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為112克/L，葡萄糖總量為共345.71千克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的纖維素的重量共311.45千克，按照下式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化率和單糖產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0071]纖維素轉(zhuǎn)化率=100%X被酶解的纖維素的重量/纖維素的總重量
[0072]單糖產(chǎn)率=100%X酶解得到的葡萄糖重量/秸桿干重
[0073](3)發(fā)酵
[0074]使酶解產(chǎn)物的溫度·降至35°C，以每克酶解產(chǎn)物的重量計(jì)，接種IO5菌落形成單位的釀酒酵母(安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)，所得混合物在32°C下于發(fā)酵罐中攪拌培養(yǎng)40小時(shí)。在100°C蒸餾所得發(fā)酵產(chǎn)物，所得蒸餾餾分在78.3°C下二次蒸餾可得乙醇167.82千克，按照下式計(jì)算乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0075]乙醇產(chǎn)率=100%X乙醇重量/秸桿干重
[0076]實(shí)施例2
[0077]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
[0078]按照實(shí)施例1的方法制備乙醇，不同的是，在酶解步驟(2)中，在主酶解階段，將所述蒸汽爆破產(chǎn)物調(diào)節(jié)pH值為5，加熱至52°C后，連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解罐中，所述蒸汽爆破產(chǎn)物的加入量為25千克/小時(shí)，先將纖維素酶連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解階段的酶解罐中，待位于首位的酶解罐中的酶解產(chǎn)物開(kāi)始流入與首位串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中時(shí)，并在52°C下，將纖維素酶連續(xù)加入該第二酶解階段的酶解罐中，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為1.25 X IO5酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為6.3X IO4酶活力單位/小時(shí)；以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為15酶活力單位，分別將主酶解階段首位、第二位和第三位酶解罐中流出的酶解產(chǎn)物取樣(主酶解階段的時(shí)長(zhǎng)為每罐12小時(shí))，用布氏漏斗過(guò)濾，將20毫升濾液轉(zhuǎn)移至干燥50毫升的三角瓶中，靜置5小時(shí)，收集上層清液。0.2微米濾膜過(guò)濾收集的上層清液，按照上述步驟(1)所述高效液相條件，得出由主酶解階段的位于首位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為42克/L，位于第二位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為58克/L，位于第三位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為75克/L。
[0079]將由所述主酶解階段的末位酶解罐的酶解產(chǎn)物分別依次連續(xù)送入與其連通的3個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，在上述酶解條件下保溫混合36小時(shí)進(jìn)行間歇酶解，按照上述方法測(cè)定后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為112.86克/L，葡萄糖總量為共348.37千克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的纖維素的重量共313.85千克，按照實(shí)施例1中的公式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化率和單糖產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表
[0080]按照與實(shí)施例1步驟3相同的條件進(jìn)行發(fā)酵，可得乙醇169.12千克，并按照實(shí)施例I的公式計(jì)算乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0081]實(shí)施例3
[0082]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
[0083]按照實(shí)施例1的方法制備乙醇，不同的是，在酶解步驟(2)中，在主酶解階段，將所述蒸汽爆破產(chǎn)物調(diào)節(jié)pH值為5，加熱至52°C后，連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解罐中，所述蒸汽爆破產(chǎn)物的加入量為26.47千克/小時(shí)，先將纖維素酶連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解階段的酶解罐中，待位于首位的酶解罐中的酶解產(chǎn)物開(kāi)始流入與首位串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中時(shí)，并在52°C下，將纖維素酶連續(xù)加入該第二酶解階段的酶解罐中，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為1.06X IO5酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為5.3 X IO4酶活力單位/小時(shí)；以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為12酶活力單位，分別將主酶解階段首位、第二位和第三位酶解罐中流出的酶解產(chǎn)物取樣(主酶解階段的時(shí)長(zhǎng)為每罐12小時(shí))，用布氏漏斗過(guò)濾，將20毫升濾液轉(zhuǎn)移至干燥50毫升的三角瓶中，靜置5小時(shí)，收集上層清液。0.2微米濾膜過(guò)濾收集的上層清液，按照上述步驟(1)所述高效液相條件，得出由主酶解階段的位于首位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為40克/L，位于第二位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為55克/L，位于第三位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為68克/L0
[0084]將由所述主酶解階段的末位酶解罐的酶解產(chǎn)物分別依次連續(xù)送入與其連通的3個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，在上述酶解條件下保溫混合32小時(shí)進(jìn)行間歇酶解，按照上述方法測(cè)定后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為112.32克/L，葡萄糖總量為共346.68千克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的纖維素的重量共312.33千克，按照實(shí)施例1中的公式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化率和單糖產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表
1
[0085]按照與實(shí)施例1步驟3相同的條件進(jìn)行發(fā)酵，可得乙醇168.30千克，并按照實(shí)施例I的公式計(jì)算乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0086]實(shí)施例4
[0087]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
[0088]按照實(shí)施例1的方法制備乙醇，不同的是，在酶解步驟(2)中，所述主酶解階段包括依次串聯(lián)的2個(gè)酶解階段的酶解罐，后續(xù)間歇酶解階段包括2個(gè)并聯(lián)的酶解罐，所述主酶解階段末位的酶解罐分別與后續(xù)間歇酶解階段的2個(gè)并聯(lián)的酶解罐連通。連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解罐中，所述蒸汽爆破產(chǎn)物的加入量為23.08千克/小時(shí)，先將纖維素酶連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解階段的酶解罐中，待位于首位的酶解罐中的酶解產(chǎn)物開(kāi)始流入與首位串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中時(shí)，并在該溫度下，將纖維素酶連續(xù)加入該第二酶解階段的酶解罐中，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為7.7 X IO4酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為
3.8 X IO4酶活力單位/小時(shí)；以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為10酶活力單位。分別將主酶解階段首位和第二位酶解罐中流出的酶解產(chǎn)物取樣(主酶解階段的時(shí)長(zhǎng)為每罐12小時(shí))，用布氏漏斗過(guò)濾，將20毫升濾液轉(zhuǎn)移至干燥50毫升的三角瓶中，靜置5小時(shí)，收集上層清液。0.2微米濾膜過(guò)濾收集的上層清液，按照實(shí)施例1步驟(1)所述高效液相條件，得出，由主酶解階段的位于首位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為36克/L，位于第二位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為50克/L。
[0089]將由所述主酶解階段的末位酶解罐的酶解產(chǎn)物分別依次連續(xù)送入與其連通的2個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，在實(shí)施例1的酶解條件下保溫混合54小時(shí)進(jìn)行間歇酶解，按照實(shí)施例1所述方法測(cè)定后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為107.89克/L，葡萄糖總量為共333.06千克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的纖維素的重量共300.06千克，按照實(shí)施例1中的公式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化率和單糖產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0090]在與實(shí)施例1發(fā)酵步驟(3)相同的發(fā)酵條件下，將酶解終點(diǎn)得到的酶解產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵，并蒸餾得到乙醇161.68千克。按照實(shí)施例1中的公式計(jì)算乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表
1
[0091]實(shí)施例5
[0092]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
`[0093]( I)含纖維素原料的預(yù)處理
[0094]將1000千克沒(méi)有雜質(zhì)的玉米秸桿(含水量10重量％)切成不超過(guò)1.5厘米X0.4厘米X 1.0厘米的小段，將秸桿段水浸5分鐘后(秸桿與水的重量比為1:25)，并在180°C下維持1.0兆帕的壓力5分鐘，然后泄壓，完成蒸汽爆破。共得到1925千克蒸汽爆破產(chǎn)物(含水量為53.25重量％)。
[0095]按照實(shí)施例1所述HPLC分析硫酸水解蒸汽爆破產(chǎn)物的方法，得到蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解液中葡萄糖濃度為2.52毫克/毫升，計(jì)算可得I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解能得到重量為0.209克的葡萄糖，因?yàn)闈舛葹?2重量％的硫酸溶液可以將蒸汽爆破的產(chǎn)物的纖維素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破產(chǎn)物中纖維素重量的1.11倍，即I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物中含纖維素0.189克，則1925千克蒸汽爆破產(chǎn)物中共含纖維素363千克。HPLC分析得到蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解液中木糖濃度為0.64毫克/毫升，計(jì)算可得I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物酸水解能得到重量為0.052克的木糖，因?yàn)闈舛葹?2重量％的硫酸溶液可以將蒸汽爆破的產(chǎn)物的半纖維素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破產(chǎn)物中半纖維素重量的1.14倍，即I克所述蒸汽爆破產(chǎn)物中含半纖維素0.045克，則1925千克蒸汽爆破產(chǎn)物中共含半纖維素87千克。
[0096]按照與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行酶解步驟(2)，不同的是，pH值為4，酶解溫度為48°C，在向主酶解階段的位于首位的酶解階段的酶解罐加入纖維素酶的同時(shí)還連續(xù)加入半纖維素酶，待位于首位的酶解罐中的酶解產(chǎn)物開(kāi)始流入與首位串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中時(shí)，并在該溫度下，將纖維素酶連續(xù)加入該第二酶解階段的酶解罐中的同時(shí)還連續(xù)加入半纖維素酶，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為1.13 X IO5酶活力單位/小時(shí)，半纖維素酶的加入量為4.69X IO4酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為5.63 X IO4酶活力單位/小時(shí)，半纖維素酶的加入量為
2.34X IO4酶活力單位/小時(shí)；以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為12酶活力單位/小時(shí)，所述半纖維素酶的用量為5酶活力單位，主酶解階段的時(shí)長(zhǎng)為每罐12小時(shí)。按照與上述步驟(1)所述高效液相條件，得出由主酶解階段的位于首位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為46克/L，位于第二位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為64克/L，位于第三位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為80克/L。
[0097]將由所述主酶解階段的末位酶解罐的酶解產(chǎn)物分別依次連續(xù)送入與其連通的3個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，在上述酶解條件下保溫混合28小時(shí)進(jìn)行間歇酶解，并按照實(shí)施例1步驟(I)所述高效液相條件，測(cè)定并計(jì)算出終點(diǎn)酶解產(chǎn)物中的葡萄糖為108.54克/L，葡萄糖總量為共335.08千克，所述酶解得到的葡萄糖的重量除以1.11，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的纖維素的重量共301.87千克，測(cè)定并計(jì)算出酶解產(chǎn)物中的木糖共69.72千克，所述酶解得到的木糖的重量除以 1.14，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的半纖維素的重量共61.16千克；并按照下述公式計(jì)算纖維素、半纖維素轉(zhuǎn)化率和單糖產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0098]纖維素轉(zhuǎn)化率=100%X被酶解的纖維素的重量/纖維素的總重量
[0099]半纖維素轉(zhuǎn)化率=100%X被酶解的半纖維素的重量/半纖維素的總重量
[0100]單糖產(chǎn)率=100%X (酶解得到的葡萄糖重量+酶解得到的木糖重量)/秸桿干重
[0101](3)發(fā)酵
[0102]使酶解產(chǎn)物的溫度降至34°C，以每克酶解產(chǎn)物的重量計(jì)，接種為IO4菌落形成單位的釀酒酵母(安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)和IO4菌落形成單位的樹(shù)干畢赤酵母，所得混合物在33°c下于發(fā)酵罐中攪拌培養(yǎng)37小時(shí)。在100°C蒸餾所得發(fā)酵產(chǎn)物，所得蒸餾餾分在78.3°C下二次蒸餾可得乙醇196.51千克，并按照實(shí)施例1的公式計(jì)算乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0103]實(shí)施例6
[0104]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的采用含纖維素原料制備乙醇的方法。
[0105]按照實(shí)施例1的方法制備乙醇，不同的是，在酶解步驟(2)中，將蒸汽爆破產(chǎn)物調(diào)節(jié)PH值為5，加熱至52°C后，連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解罐中，所述蒸汽爆破產(chǎn)物的加入量為22.5千克/小時(shí)，先將纖維素酶連續(xù)加入主酶解階段的位于首位的酶解階段的酶解罐中，待位于首位的酶解罐中的酶解產(chǎn)物開(kāi)始流入與首位串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中時(shí)，并在該溫度下，將纖維素酶連續(xù)加入該第二酶解階段的酶解罐中，連續(xù)加入第一酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為6.0X IO4酶活力單位/小時(shí)，連續(xù)加入第二酶解階段的酶解罐的纖維素酶的加入量為3.0 X IO4酶活力單位/小時(shí)；以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖維素酶的用量為8酶活力單位，分別將主酶解階段首位、第二位和第三位酶解罐中流出的酶解產(chǎn)物取樣(主酶解階段的時(shí)長(zhǎng)為每罐12小時(shí))，用布氏漏斗過(guò)濾，將20毫升濾液轉(zhuǎn)移至干燥50毫升的三角瓶中，靜置5小時(shí)，收集上層清液。0.2微米濾膜過(guò)濾收集的上層清液，按照上述步驟(1)所述高效液相條件，得出由主酶解階段的位于首位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為30克/L，位于第二位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為41克/L，位于第三位的酶解罐流出的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為55克/L。
[0106]將由所述主酶解階段的末位酶解罐的酶解產(chǎn)物分別送入與其連通的3個(gè)并聯(lián)的酶解罐中，在上述酶解條件下保溫混合44小時(shí)進(jìn)行間歇酶解，并按照上述方法測(cè)定后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中葡萄糖為107.56克/L，葡萄糖總量為共332.01千克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破產(chǎn)物中被酶解的纖維素的重量共299.11千克，按照實(shí)施例1中的公式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化率和單糖產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0107]在步驟(3)中，使酶解產(chǎn)物的溫度降至30°C，以每克酶解產(chǎn)物的重量計(jì)，接種為IO5菌落形成單位的釀酒酵母(安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)和IO4菌落形成單位的樹(shù)干畢赤酵母，所得混合物在30°c下于發(fā)酵罐中攪拌培養(yǎng)37小時(shí)。在100°C蒸餾所得發(fā)酵產(chǎn)物，所得蒸餾餾分在78.3°C下二次蒸餾可得乙醇161.19千克，按照實(shí)施例1中的公式計(jì)算乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0108]對(duì)比例I
[0109]本對(duì)比例說(shuō)明采用含纖維素原料制備乙醇的參比方法。
[0110]按照實(shí)施例1的方法制備乙醇，不同的是，在酶解步驟(2)中將步驟(1)取樣測(cè)試后剩余的蒸汽爆破產(chǎn)物一次全部加入到一個(gè)含水的酶解罐中，然后與纖維素酶混合均勻(全部蒸汽爆破產(chǎn)物與水的重量比為1.4:1，相對(duì)于每克纖維素原料的干重，纖維素酶的用量為10酶活力單位)，酶解時(shí)間為88小時(shí)；二次蒸餾得到乙醇154.44千克。并按照實(shí)施例1的方法和公式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化率、單糖產(chǎn)率和乙醇產(chǎn)率，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
[0111]表1·
【權(quán)利要求】
1.一種采用含纖維素原料制備乙醇的方法，該方法包括在水的存在下，將含纖維素原料與酶混合，將含纖維素原料酶解，得到酶解產(chǎn)物，并發(fā)酵該酶解產(chǎn)物，其特征在于，所述酶解分多階段進(jìn)行，所述多階段包括連續(xù)進(jìn)行的主酶解階段以及主酶解階段以后的間歇酶解階段，在主酶解階段中，向酶解罐中連續(xù)加入含纖維素原料以及酶，含纖維素原料的加入量以及酶的加入量使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為50-100g/L，并使經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物分別連續(xù)流入后續(xù)階段的酶解罐中進(jìn)行間歇酶解，直至后續(xù)階段的各個(gè)酶解罐的酶解終點(diǎn)的酶解產(chǎn)物中單糖的含量為大于或等于105g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，含纖維素原料的加入量以及酶的加入量使得經(jīng)過(guò)該主酶解階段得到的酶解產(chǎn)物中的單糖含量為60-80g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述多階段包括主酶解階段的依次串聯(lián)的多個(gè)酶解階段的酶解罐，以及與位于主酶解階段末位的酶解罐連通的后續(xù)間歇酶解階段的多個(gè)并聯(lián)的酶解罐。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述主酶解階段包括依次串聯(lián)的2-3個(gè)酶解罐；將含纖維素原料連續(xù)加入主酶解階段的第一酶解階段的酶解罐中，將酶分別連續(xù)加入主酶解階段的第一酶解階段的酶解罐和與其串聯(lián)的第二酶解階段的酶解罐中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述主酶解階段以后的間歇酶解階段包括并聯(lián)的2-4個(gè)酶解罐。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，連續(xù)向主酶解階段的第一酶解階段的酶解罐加入的酶占酶總加入量的50-70%，連續(xù)向第二酶解階段的酶解罐加入的酶占酶總加入量的30-50%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或6所述的方法，其中，酶解使用的酶包括纖維素酶，以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述纖`維素酶的用量為8-20酶活力單位。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或6所述的方法，其中，酶解使用的酶還包括半纖維素酶，以每克含纖維素原料的干重計(jì)，所述半纖維素酶的用量為4.4-8.8酶活力單位。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酶解的溫度為45-55°C，所述酶解的pH值為4-6。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的方法，其中，所述含纖維素原料為蒸汽爆破的含纖維素原料和/或酸處理的含纖維素原料。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述含纖維素原料為秸桿。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述發(fā)酵所使用的酵母為樹(shù)干畢赤酵母和/或釀酒酵母；以每克酶解終點(diǎn)得到的酶解產(chǎn)物計(jì)，所述發(fā)酵所使用的酵母的接種量為IO3-1O8菌落形成單位，所述發(fā)酵的溫度為30-36°C，發(fā)酵的時(shí)間為32-48小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12P7/10GK103789354SQ201210434463
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月2日
【發(fā)明者】魏擁輝, 李春玲, 劉文信, 孫長(zhǎng)征, 吳楊, 宋思琦, 任玲, 沈乃東 申請(qǐng)人:中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司, 中糧生化能源（肇東）有限公司, 中糧集團(tuán)有限公司