專利名稱：一種利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-l-古龍酸的方法
一種利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于維生素C生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是Vc第二步生物發(fā)酵中一種利用混合菌生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法。
背景技術(shù)：
Vc 二步發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)，其第二步發(fā)酵為兩種菌的混合發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸的生物轉(zhuǎn)化。兩種菌包括具有產(chǎn)酸能力的細(xì)菌-普通生酮基古龍酸菌(俗稱產(chǎn)酸菌或小菌)和不具有轉(zhuǎn)化產(chǎn)酸能力但卻能促進(jìn)小菌生長和產(chǎn)酸的伴生菌(俗稱大菌)。已有研究結(jié)果表明，普通生酮基古龍酸菌單獨(dú)培養(yǎng)傳代存活率及產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸能力均較弱，只有與伴生菌混合培養(yǎng)時(shí)才能快速生長和產(chǎn)酸。但是，伴生菌的種類、數(shù)量和生長特性對小菌的生長和產(chǎn)酸具有重要影響，進(jìn)而改變著維生素C第二步發(fā)酵的效率。
目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的伴生菌主要有蠟狀芽孢桿菌(Bacills cereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和蘇云金芽抱桿菌(Bacillsthuringiensis)等，且僅用其中一種伴生菌與產(chǎn)酸菌搭配進(jìn)行兩種菌的混合發(fā)酵產(chǎn)酸。因?yàn)橐恢臧樯母咝О樯芰Τ掷m(xù)時(shí)間較短，難以在發(fā)酵的整個(gè)階段持續(xù)提供充足的效應(yīng)物，所以，產(chǎn)酸菌的產(chǎn)酸能力在發(fā)酵過程中無法長期保持在最佳狀態(tài)，使得第二步混菌發(fā)酵的效率難以得到有效提高。另外，由于檢測結(jié)果的滯后和種子液多級擴(kuò)大過程的復(fù)雜，二步混菌發(fā)酵的大罐常出現(xiàn)染菌和染噬菌體的現(xiàn)象，噬菌體殺死伴生菌，使得伴生因子不能滿足產(chǎn)酸菌生長和發(fā)酵產(chǎn)酸，導(dǎo)致發(fā)酵速度明顯降低甚至發(fā)生放罐情況，嚴(yán)重影響了古龍酸的產(chǎn)量，并造成大量能耗和材料損失。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為
—種利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法Vc 二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝的種子液逐級擴(kuò)大，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)將A菌系和B菌系的種子液，以體積百分比15-20%的總接種量接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)(即至發(fā)酵液中殘余山梨糖濃度< lmg/ml)，實(shí)現(xiàn)利用混合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸；
其中A菌系由伴生菌蠟樣芽孢桿菌/伴生菌巨大芽孢桿菌與產(chǎn)酸菌生酮基古龍酸菌組成菌系由伴生菌蘇云金芽孢桿菌和產(chǎn)酸菌生酮基古龍酸菌組成。
所述A菌系和B菌系的種子液按體積比2:1 10:1的比例混合接入發(fā)酵罐。
將所述兩種菌系分別加入到發(fā)酵罐中，兩種先后加入的菌系在20小時(shí)內(nèi)接種到發(fā)酵罐中使總接種量達(dá)到15-20%。
所述在Vc 二步發(fā)酵過程中A菌系和B菌系經(jīng)過連續(xù)三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，繼而得到的三級種子液再接種于發(fā)酵罐；其中A菌系和B菌系連續(xù)三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)分別為以體積比1-5%、5-10%和5-10%的接種量分別作為三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)的各級接種量，同時(shí)各級培養(yǎng)溫度為27-31 °C，發(fā)酵時(shí)間在6-14小時(shí)，通風(fēng)量為1:0.8-1.0 (溶氧比為25-30%);每級種子達(dá)到種液中古龍酸含量達(dá)3. 0-10. Omg/ml,轉(zhuǎn)種到下一級。
將連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的A菌系和B菌系的三級種子液接種于發(fā)酵罐中，在27_31°C、罐壓O. 005-0. 02Mpa, pH 6. 0-8. O下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中流加L-山梨糖，直至發(fā)酵液中殘余山梨糖濃度彡lmg/ml，從而實(shí)現(xiàn)利用混合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸。
所述發(fā)酵過程中間斷或連續(xù)的流加底物L(fēng)-山梨糖，流加速率為2-10m3/小時(shí)，至發(fā)酵液中山梨糖終濃度達(dá)7-10mg/ml。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
I.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)三菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸，可縮短發(fā)酵周期 6-8小時(shí)，降低能耗10-15%，提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率2-4%。
2.本發(fā)明的工藝簡便，不需要添置大型設(shè)備，也不需要對現(xiàn)有設(shè)備進(jìn)行過多改造。
3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)Vc 二步發(fā)酵的三菌混合培養(yǎng)，兩種伴生菌可提供持續(xù)有效的伴生效應(yīng)物，從而使小菌生長和產(chǎn)酸處于最佳狀態(tài)，杜絕了二步發(fā)酵過程中因效應(yīng)物不足出現(xiàn)小菌產(chǎn)酸效率不高的現(xiàn)象，使其發(fā)酵轉(zhuǎn)化得以持續(xù)高效進(jìn)行。
4.本發(fā)明的三菌混合培養(yǎng)，其中兩種伴生菌的生長和繁殖特性不同，A菌系前期生長快，B菌系后期生長快，兩種伴生菌共同培養(yǎng)，可以有效彌補(bǔ)在發(fā)酵過程中因一種伴生菌數(shù)量不足而導(dǎo)致的發(fā)酵效率低下。
5.本發(fā)明的三菌混合發(fā)酵，兩種伴生菌同時(shí)存在于發(fā)酵液中，增強(qiáng)了發(fā)酵過程中對染噬菌體的抗性，減少了因染噬菌體而放罐的現(xiàn)象，提高了發(fā)酵效率。
6.本發(fā)明基于Vc 二步發(fā)酵伴生菌與產(chǎn)酸菌的相互作用機(jī)理及各自生長和代謝特性的差異，采用不同發(fā)酵菌系種液按比例共同接入大罐發(fā)酵的模式，完成2-酮基-L-古龍酸的高效發(fā)酵。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I
從斜面種液中分別取由蠟樣芽孢桿菌和生酮基古龍酸菌組成的A菌系和由蘇云金芽孢桿菌和生酮基古龍酸菌組成的B菌系，分別以5% (體積比)作為三級連續(xù)擴(kuò)增的種液的接種量，分別接種于不同等級的種子培養(yǎng)基中(種子培養(yǎng)基，按重量百分比計(jì)蛋白胨O.3%，牛肉膏 O. 3%，酵母膏 O. 3%，玉米漿 O. 3%，MgS04 O. 01%,FeSO4 O. 01%，L-山梨糖 2%, pH 7.0,瓊脂2. 5%，余量為水；121°C高溫滅菌20min;待用。)，分別搖瓶培養(yǎng)20小時(shí)至不同等級發(fā)酵液中古龍酸產(chǎn)量在8-10mg/ml,轉(zhuǎn)種到下一級；
在上述種子液經(jīng)三級擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別取A種子液2. 4ml和B種子液O. 8ml,共 3. 2ml接入裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方按重量百分比計(jì)玉米漿，I. 5%，尿素I. 2%， 山梨糖8%, MgSO4 O. 01% ,蒸懼水定容至1000ml,調(diào)節(jié)pH至7. 0,121°C高溫滅菌20min) 的三角瓶中，以29°C，罐壓O. 005-0. 02Mpa, 150轉(zhuǎn)/分下振蕩培養(yǎng)38小時(shí)，發(fā)酵過程中流加 L-山梨糖，直至發(fā)酵液中殘余山梨糖濃度彡lmg/ml，從而實(shí)現(xiàn)利用混合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸。最終發(fā)酵液中古龍酸值達(dá)68. Omg/ml，轉(zhuǎn)化率達(dá)94.4%。
實(shí)施例2-權(quán)利要求
1.一種利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法，其特征在于Vc二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝的種子液逐級擴(kuò)大，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)將A菌系和B菌系的種子液，以體積百分比15-20%的總接種量接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)(即至發(fā)酵液中殘余山梨糖濃度(lmg/ml),實(shí)現(xiàn)利用混合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸； 其中A菌系由伴生菌蠟樣芽孢桿菌/伴生菌巨大芽孢桿菌與產(chǎn)酸菌生酮基古龍酸菌組成菌系由伴生菌蘇云金芽孢桿菌和產(chǎn)酸菌生酮基古龍酸菌組成。
2.按權(quán)利要求I所述的利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法，其特征在于所述A菌系和B菌系的種子液按體積比2:1 10:1的比例混合接入發(fā)酵罐。
3.按權(quán)利要求I所述的利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法，其特征在于將所述兩種囷系分別加入到發(fā)酵te中，兩種先后加入的囷系在20小時(shí)內(nèi)接種到發(fā)酵罐中使總接種量達(dá)到15-20%。
4.按權(quán)利要求I或3所述的利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法，其特征在于所述在Vc 二步發(fā)酵過程中A菌系和B菌系經(jīng)過連續(xù)三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，繼而得到的三級種子液再接種于發(fā)酵罐；其中A菌系和B菌系連續(xù)三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)分別為以體積比1-5%、5-10%和5-10%的接種量分別作為三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)的各級接種量，同時(shí)各級培養(yǎng)溫度為27-31°C，發(fā)酵時(shí)間在6-14小時(shí)，通風(fēng)量為1:0.8-1.0 (溶氧比為25-30% );每級種子達(dá)到種液中古龍酸含量達(dá)3. 0-10. Omg/ml,轉(zhuǎn)種到下一級。
5.按權(quán)利要求4所述的利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法，其特征在于將連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的A菌系和B菌系的三級種子液接種于發(fā)酵罐中，在27-31°C、罐壓O. 005-0. 02Mpa, pH 6. 0-8. O下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中流加L-山梨糖，直至發(fā)酵液中殘余山梨糖濃度彡lmg/ml，從而實(shí)現(xiàn)利用混合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸。
6.按權(quán)利要求5所述的利用三種菌混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖2-酮基-L-古龍酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵過程中間斷或連續(xù)的流加底物L(fēng)-山梨糖，流加速率為2-10m3/小時(shí)，至發(fā)酵液中山梨糖終濃度達(dá)7-10mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于維生素C生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是Vc第二步生物發(fā)酵中一種利用混合菌生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸的方法。Vc二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝的種子液逐級擴(kuò)大，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)將A菌系和B菌系的種子液，以體積百分比15-20％的總接種量接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)(即至發(fā)酵液中殘余山梨糖濃度≤1mg/ml)，實(shí)現(xiàn)利用混合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮基-L-古龍酸;其中A菌系由伴生菌蠟樣芽孢桿菌/伴生菌巨大芽孢桿菌與產(chǎn)酸菌生酮基古龍酸菌組成；B菌系由伴生菌蘇云金芽孢桿菌和產(chǎn)酸菌生酮基古龍酸菌組成；采用本發(fā)明的三菌混合發(fā)酵新方法，發(fā)揮了兩種伴生菌的各自優(yōu)勢，可縮短發(fā)酵周期6-8小時(shí)，降低能耗10-15％，提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率2-4％。
文檔編號C12P7/60GK102978273SQ201210453539
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者楊偉超, 徐慧, 滿都拉, 張忠澤, 安海英, 胡昊, 李英杰, 韓利濤, 姜銘妍, 諶明, 徐靜, 曹桂環(huán) 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所