專利名稱：一種建立Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種建立Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型即Bilogistic模型的方法。
背景技術(shù)：
在環(huán)境領(lǐng)域，傳統(tǒng)毒理學(xué)研究重心在毒物的高劑量區(qū)域，其主要目的是評(píng)估毒物的毒性大小并確定對(duì)人類安全的劑量閾值。因此，傳統(tǒng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型主要有閾值模型和線性模型兩種(如圖2a和2b)。Hormesis是指毒物或化合物對(duì)生物體的 劑量-效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為在高劑量時(shí)產(chǎn)生抑制作用，而在低劑量時(shí)產(chǎn)生刺激效應(yīng)的特殊現(xiàn)象[I]，這種雙向劑量-效應(yīng)模型(圖2c)無疑對(duì)毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)一直沿用的經(jīng)典劑量-效應(yīng)模型提出了挑戰(zhàn)[2]，這將會(huì)從根本上改變整個(gè)危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)模式，因此成為危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)進(jìn)程中的重要里程碑。已有大量研究表明，Hormesis是在不同的模式生物、測試終點(diǎn)以及化合物類別下都普遍存在著的一種雙向劑量-效應(yīng)關(guān)系。Hormesis雙向劑量-效應(yīng)關(guān)系代表了整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域里對(duì)劑量-效應(yīng)概念的模式轉(zhuǎn)變，影響了毒理學(xué)家在生物模式、觀測終點(diǎn)、設(shè)計(jì)研究、評(píng)估危險(xiǎn)等方面的選擇，甚至影響到毒理學(xué)家對(duì)所試驗(yàn)的問題與假說提出的方式。該劑量-效應(yīng)模式不僅對(duì)毒理學(xué)，乃至藥理學(xué)、流行病學(xué)及臨床評(píng)估等方面都產(chǎn)生了很大的影響。目前，隨著分子遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、人類基因組和環(huán)境基因交互作用研究的不斷深入，人們對(duì)毒作用(化合物的毒性作用)機(jī)制有著不斷完整的認(rèn)識(shí)，以機(jī)制為基礎(chǔ)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)將很大程度上減少其中的不確定因素。因此，以機(jī)制為基礎(chǔ)將顯示出生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的真正科學(xué)意義，也是毒理學(xué)發(fā)展的終極目的之一 [3]?，F(xiàn)階段，人們對(duì)于Hormesis的研究主要圍繞以下幾個(gè)方面(I)形成機(jī)制目前，對(duì)于Hormesis的形成機(jī)制尚無定論，較為學(xué)界普遍接受的有受體機(jī)制假說和過度補(bǔ)償理論兩種[4，5]，但仍有些學(xué)者對(duì)這兩種機(jī)制持懷疑態(tài)度[6]。對(duì)于Hormesis形成機(jī)制有待進(jìn)一步深入的研究。(2)定量化研究由于已有的Hormesis機(jī)制的不確定，導(dǎo)致Hormesis的定量化研究進(jìn)展緩慢，到目前為止仍未形成統(tǒng)一的且令人信服的評(píng)價(jià)方法。過去數(shù)十年間，學(xué)者相繼提出過很多種用于擬合具有Hormesis現(xiàn)象的劑量-效應(yīng)模型，但多為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷亩嬖谥T多不足[7]對(duì)于混合物的Hormesis效應(yīng)研究更是處于起步階段。因此，Hormesis的定量化研究亟待創(chuàng)建一種能廣為接受的擬合模型以實(shí)現(xiàn)a)采用簡單參數(shù)即可表征興奮效應(yīng)山)該模型可表征相應(yīng)的生物學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種建立Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型的方法以及由該方 法得到的Bilogistic模型。由該方法建立的Bilogistic模型可以擬合具有Hormesis效應(yīng)的毒性數(shù)據(jù)，從而為毒物的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更為可靠、科學(xué)的理論依據(jù)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明中，將劑量-效應(yīng)曲線拆分為刺激作用曲線和抑制作用曲線，用Logistic模型分別擬合刺激作用曲線和抑制作用曲線，建立刺激作用曲線模型和抑制作用曲線模型，在受體機(jī)制假說的基礎(chǔ)上建立了 Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型-Bilogistic模型。—種建立Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型的方法,其包括以下步驟(I)分析化合物的穩(wěn)定性；(2)菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)；(3)毒性測試，包括步驟(I)所分析的化合物對(duì)步驟(2)培養(yǎng)的菌株的急性毒性測試及慢性毒性測試； (4)應(yīng)用步驟(3)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算步驟(I)分析的化合物對(duì)步驟(2)復(fù)蘇培養(yǎng)的菌株的抑制率，以抑制率為指標(biāo)進(jìn)行毒性表征；(5)基于受體機(jī)制假說對(duì)步驟(4)得到的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到Bilogistic模型。所述步驟(I)中的化合物穩(wěn)定性分析，具體包括以下步驟采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)化合物進(jìn)行穩(wěn)定性分析，檢測化合物在試驗(yàn)條件下24h后濃度變化；其中高效液相色譜條件的分析條件如下高效液相色譜儀(Agilent, USA),色譜柱反相柱C18,5ym,250mmX4. 5mm,柱溫 25。C ;流動(dòng)相乙腈=80%(20% 水，pH=7),流速1. Oml/min ;檢測波長265nm。所述步驟(2)中的菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)，具體包括以下步驟(2a)菌種復(fù)蘇菌種復(fù)蘇及傳代在固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行。所述的固體培養(yǎng)基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g，NaC13g,蒸餾水 lOOmL，瓊脂 2g ；將明亮發(fā)光桿菌的凍干粉溶解，接種到斜面上傳代3次后獲得穩(wěn)定發(fā)光性能的菌株備用；(2b)菌種培養(yǎng)將傳代好的菌種用接種環(huán)接種到液體培養(yǎng)基作為工作菌液用，在溫度為20°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)12h液體培養(yǎng)基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g, NaC13g，蒸餾水 IOOmL0所述的步驟(3)中的毒性測試，包括以下步驟(3a)菌液的平衡移取步驟(2)適量工作菌液(以光值為控制指標(biāo)來添加)到20mL3%NaCl溶液中，控制光值測定范圍在20萬左右，20°C條件下攪拌40min ；(3b)毒性測試急性毒性測試基于Micortox的測定原理，每個(gè)小試管先加入800 μ L不同濃度測試溶液(空白為含1%DMS0的NaCl溶液)，統(tǒng)一震蕩Imin混勻；再加入200 μ L菌液，統(tǒng)一震蕩Imin混勻后，置于20° C室溫下等候15min后測定光值；慢性毒性測試基于Micortox的測定原理,每個(gè)小試管先加入400 μ L不同濃度測試溶液(空白為含1%DMS0的NaCl溶液)，再加入400 μ L高倍液體培養(yǎng)基，統(tǒng)一震蕩Imin混勻；再加入200 μ L菌液，統(tǒng)一震蕩Imin混勻后，置于20° C恒溫培養(yǎng)箱中180r/min恒溫培養(yǎng)24h再取出采用發(fā)光儀測定光值。高倍液體培養(yǎng)基的配制由于慢性毒性測試時(shí)間比較長(24h)，測試樣需加入適量培養(yǎng)基以保持發(fā)光菌正常生長所需營養(yǎng)，因此需提前配制高倍液體培養(yǎng)基以備慢性毒性測試中加樣時(shí)使用。高倍液體培養(yǎng)基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g, NaC13g,蒸懼水 40mL。所述固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及高倍液體培養(yǎng)基均用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. O。所述的步驟(4)中毒性表征是指對(duì)于步驟(3)得到的毒性測試數(shù)據(jù)，用毒物對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光值的抑制率表征，計(jì)算如下抑制率％=100%X (對(duì)照抑制率一樣品抑制率)/對(duì)照抑制率其中，對(duì)照抑制率指的是樣品前后的空白平均抑制率；所述的步驟(5)中的受體機(jī)制假說，包括以下內(nèi)容化合物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的作用中存在兩種關(guān)鍵蛋白，化合物與親和力(affinity)和容力(capacity)不同的兩種蛋白結(jié)合的差異導(dǎo)致了刺激和抑制兩種相反的效應(yīng)，低濃度時(shí)化合物與具有高親和力的蛋白起作用，對(duì)機(jī)體表現(xiàn)出刺激效應(yīng)；高濃度時(shí)，隨著化合物的分子增加，親和力低但卻具備更高容力(如，數(shù)目更多)的蛋白受體漸漸占據(jù)主導(dǎo)作用，從而表現(xiàn)出與低濃度相反的抑制作用。本發(fā)明根據(jù)受體機(jī)制假說，將步驟(4)毒性表征擬合得到的劑量-效應(yīng)曲線h(x)拆分為兩條S型曲線，分別為代表刺激作用的f(x)和抑制作用的g(x)?？紤]到S型曲線在生物模型中的普遍性，嘗試用Logistic模型分別擬合f(x)和g(x)兩種作用的曲線，將f (X)和g(x)這兩種效應(yīng)相加從而得到Bilogistic模型h (X)。所述的刺激作用曲線f (X)模型為
權(quán)利要求
1.一種建立Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)分析化合物的穩(wěn)定性； (2)菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)； (3)毒性測試，包括步驟(I)所分析的化合物對(duì)步驟(2)培養(yǎng)的菌株的急性毒性測試及慢性毒性測試； (4)應(yīng)用步驟(3)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算步驟(I)分析的化合物對(duì)步驟(2)復(fù)蘇培養(yǎng)的菌株的抑制率，以抑制率為指標(biāo)進(jìn)行毒性表征； (5)基于受體機(jī)制假說對(duì)步驟(4)得到的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到Bilogistic模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中化合物的穩(wěn)定性分析，具體包括以下步驟 采用高效液相色譜對(duì)化合物進(jìn)行穩(wěn)定性分析，檢測化合物在試驗(yàn)條件下24h后濃度變化；其中高效液相色譜條件的分析條件如下高效液相色譜儀的色譜柱反相柱α8，5μπι，250mmX4. 5mm,柱溫 25° C ;流動(dòng)相乙腈=80%,水=20%, pH=7,流速1. Oml/min ;檢測波長265nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中的菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)，具體包括以下步驟 (2a)菌種復(fù)蘇 菌種復(fù)蘇及傳代在固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行；將明亮發(fā)光桿菌的凍干粉溶解，接種到斜面上傳代3次后獲得穩(wěn)定發(fā)光性能的菌株備用； 其中所述的固體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g，NaC13g,蒸餾水 lOOmL，瓊脂 2g ； (2b)菌種培養(yǎng) 將傳代好的菌種用接種環(huán)接種到液體培養(yǎng)基作為工作菌液用，在溫度為20°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)12h ； 其中所述的液體培養(yǎng)基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g, NaC13g，蒸餾水 IOOmL ； 其中所述固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)中的毒性測試，包括以下步驟 (3a)菌液的平衡 移取步驟(2)適量工作菌液到20mL3%NaCl溶液中，控制光值測定范圍在20萬左右，.20 °C條件下攪拌40min ； (3b)毒性測試 急性毒性測試基于Micortox的測定原理，每個(gè)小試管先加入800 μ L不同濃度測試溶液其中，空白為含1%DMS0的NaCl溶液，統(tǒng)一震蕩Imin混勻；再加入200 μ L菌液，統(tǒng)一震蕩Imin混勻后,置于20° C室溫下等候15min后測定光值； 慢性毒性測試基于Micortox的測定原理，每個(gè)小試管先加入400 μ L不同濃度測試溶液其中，空白為含1%DMS0的NaCl溶液，再加入400 μ L高倍液體培養(yǎng)基，統(tǒng)一震蕩Imin混勻；再加入200 μ L菌液，統(tǒng)一震蕩Imin混勻后，置于20° C恒溫培養(yǎng)箱中180r/min恒溫培養(yǎng)24h再取出采用發(fā)光儀測定光值。重復(fù)權(quán)利要求序號(hào)4，.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的高倍液體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨.O.5g，酵母膏 O. 5g，甘油 O. 3g，KH2PO4O. lg, Na2HPO4O. 5g，NaC13g，蒸餾水 40mL ;且高倍液體培養(yǎng)基用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(4)中毒性表征是指對(duì)于步驟(3)得到的毒性測試數(shù)據(jù)，用毒物對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光值的抑制率表征，計(jì)算如下 抑制率％=100%X (對(duì)照抑制率一樣品抑制率)/對(duì)照抑制率； 其中，對(duì)照抑制率指的是樣品前后的空白平均抑制率。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將步驟(4)毒性表征擬合得到的劑量-效應(yīng)曲線h(x)拆分為兩條S型曲線，分別為代表刺激作用的刺激作用曲線f(x)和抑制作用的抑制作用曲線g(x);用Logistic模型分別擬合f(x)和g(x)兩種作用的曲線，將f(x)和g(x)這兩種效應(yīng)相加從而得到Bilogistic模型h(x)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的刺激作用曲線f(x)為
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的抑制作用曲線g(x)為
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的建立的Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型Bilogisti模型為
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境污染檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種建立Hormesis劑量-效應(yīng)擬合模型即Bilogistic模型的方法。該方法包括以下步驟(1)分析化合物的穩(wěn)定性；(2)菌種復(fù)蘇與培養(yǎng)；(3)毒性測試，包括急性毒性測試及慢性毒性測試；(4)應(yīng)用步驟(3)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算步驟(1)分析的化合物對(duì)步驟(2)復(fù)蘇培養(yǎng)的菌株的抑制率，以抑制率為指標(biāo)進(jìn)行毒性表征；(5)對(duì)毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到Bilogistic模型。本發(fā)明的模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合更為方便；模型中的參數(shù)初始化更為簡單；模型的建立基于受體機(jī)制假說，更具生物學(xué)意義；對(duì)于刺激效應(yīng)過大的情況亦能良好地?cái)M合；可有效指導(dǎo)Hormesis效應(yīng)在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK103014116SQ201210476949
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者林志芬, 陳瑞, 鄧子卿, 叢永平, 尹大強(qiáng) 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)