專利名稱：油菜BnRabGDI3啟動(dòng)子的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜BnRab⑶13基因啟動(dòng)子(命名SPBnKabeDI3，以下相同)，同時(shí)還涉及一種甘藍(lán)型油菜BnRab⑶13啟動(dòng)子的制備方法。本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子或其實(shí)質(zhì)同源核苷酸序列的載體和涉及利用該啟動(dòng)子在油菜及其它植物基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物基因啟動(dòng)子在基因的表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用?；虮磉_(dá)的調(diào)控是多種因素綜合作用的結(jié)果。一般按照一個(gè)事件的先后順序，基因的調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控以及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控等?；蚓幋a的蛋白質(zhì)和RNA及其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)于維持生物體的整個(gè)生命活動(dòng)極其重要。任何基因表達(dá)調(diào)控的錯(cuò)誤都會(huì)對(duì)生命造成嚴(yán)重后 果。因此，對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理研究一直是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控最為重要。啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要組成部分。植物基因啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)、含有順式作用元件的一段DNA序列，決定著下游基因轉(zhuǎn)錄的特異性、方向和效率，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和表達(dá)模式中最關(guān)鍵的因子。此外，啟動(dòng)子在構(gòu)建能夠高水平表達(dá)異源表達(dá)載體的過程中起到關(guān)鍵作用，它決定了外源基因的基因表達(dá)的時(shí)空順序、表達(dá)強(qiáng)度、轉(zhuǎn)錄效率和基因的表達(dá)水平。所以，研究啟動(dòng)子的功能序列對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及日漸成熟的植物基因工程具有非常重要的科學(xué)意義。通過對(duì)多種植物基因啟動(dòng)子區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)功能蛋白基因的啟動(dòng)子都具有共同的結(jié)構(gòu)模式，一般由啟動(dòng)子核心元件和上游元件組成。位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-20—30bp處的TATA box為啟動(dòng)子核心元件，是富含有AT的保守序列區(qū)，與DNA雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇，是絕大多數(shù)植物啟動(dòng)子正確表達(dá)所必需的。TATAbox上游的保守序列稱為啟動(dòng)子上游元件，包括上游_75bp處的CAAT box和-80—110bp附近的GC box等一般上游啟動(dòng)子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答元件(JRE)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)等元件(張春曉等，植物基因啟動(dòng)子研究進(jìn)展。遺傳學(xué)報(bào)，2004，31 (12) :1455-1464 ;路靜等，高等植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用研究進(jìn)展。自然科學(xué)進(jìn)展，2004，14
(8):856862)。CAAT box是比較保守的序列，與RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有較強(qiáng)的激活作用。然而有些基因無此框，如禾谷類作物的貯藏蛋白基因中無CAAT框而被CATC框代替。GC box的保守序列是5‘GGGCGG3’，可有多個(gè)拷貝，并能以任何方向存在而不影響其功能(路靜，趙華燕，何奕昆，宋艷茹，高等植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用研究進(jìn)展。自然科學(xué)進(jìn)展，2004，14 (8):856862 ;夏江東，陳在全，吳渝生，季鵬章，高等植物啟動(dòng)子功能和結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21 (1):714)。只要具有了這些保守的結(jié)構(gòu)框，那么就可以具有相應(yīng)的啟動(dòng)下游基因表達(dá)的功能。根據(jù)植物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因在轉(zhuǎn)基因植株的所有發(fā)育時(shí)期和組織中穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)許多雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，通常都使用來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子或來自細(xì)菌的胭脂氨酸合成酶nos啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體，而在單子葉植物轉(zhuǎn)化中最常用的是含有水稻肌動(dòng)蛋白Act啟動(dòng)子，玉米泛素Ubi啟動(dòng)子及35S啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體(關(guān)麗英等，轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的有效表達(dá)及其安全評(píng)價(jià)。首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23 (2):52-56)。但是很多時(shí)候外源基因在受體植物中的持續(xù)高效表達(dá)不僅造成生物體內(nèi)能源的浪費(fèi)，而且在所有組織中的表達(dá)有可能對(duì)植株本身具有毒害作用，甚至引起轉(zhuǎn)基因安全問題(JiaS-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced ofBioengineer· 1997，17:37-42 ;Moris S H，Adley C. C. Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology:an overview with a focus on GM foods. Trendsin Biotechnology. 2001，19:43-48)。因此，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用日益受到育種工作者的重視。在轉(zhuǎn)基因植物中鑒定的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子主要包括非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等(聶麗娜等，植物基因啟動(dòng)子的克隆及其功能研究進(jìn)展。植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008,9 (3) : 385-391 )。但是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的應(yīng)用也具有一定限制，對(duì)受體植物進(jìn)行的外在條件處理，如熱激，激素處理等可能引起生物 體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)而不利于植株的正常生長(zhǎng)。此外，化學(xué)調(diào)控系統(tǒng)中用作誘導(dǎo)物的甲基脫氫!皮質(zhì)醇(dex, dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四環(huán)素(tetracycline)都對(duì)生態(tài)環(huán)境有害，不宜用于生產(chǎn)實(shí)踐。使用植物體內(nèi)本身的組織特異性啟動(dòng)子就可以避免這種問題，顯然，外源基因的組織特異性表達(dá)必將有效提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。(宋揚(yáng)等，植物組織特異性啟動(dòng)子研究。生物技術(shù)通報(bào)，2007，(4) :21-24).近些年來，關(guān)于組織特異性啟動(dòng)子研究取得了很大的進(jìn)步，這些組織特異性啟動(dòng)子主要包括葉片、韌皮部、維管束和根等器官特異表達(dá)啟動(dòng)子和花粉、花器官、果實(shí)、種子等生殖器官特異表達(dá)啟動(dòng)子(宋揚(yáng)等，植物組織特異性啟動(dòng)子研究。生物技術(shù)通報(bào)，2007，(4) :21-24)。如Ariizumi等分離了 LTP12, XTH3和PGA4的啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)化擬南芥，GUS染色表明這3個(gè)啟動(dòng)子為花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子，且在不同的時(shí)期表達(dá)存在差異(Ariizumi et al, Comparative study of promoter activity of three anther-specificgenes encoding lipidtransfer protein, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and polygalacturonase in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant CellReport. 2002, 21:90 - 96) 0在芝麻中克隆得到微粒體油酸脫氫酶基因(FAD2)的啟動(dòng)子，預(yù)測(cè)分析顯示此啟動(dòng)子中的E-box和G-box元件與三酰甘油的生物合成有關(guān)。通過轉(zhuǎn)化擬南芥后檢測(cè)⑶S基因表達(dá)，結(jié)果顯示該啟動(dòng)子在種子中特異表達(dá)(Mi Jung Kimetal. Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase iscontrolled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elementsin the SeFAD2promoter and enhancers in the5’-UTR intron. Molecular Genetics andGenomics. 2006,276:351-368)。耿安奇等從白菜型油菜、甘藍(lán)型油菜、菜苔、甘藍(lán)中分離了 4個(gè)啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)化煙草，GUS染色分析表明其為花器官特異表達(dá)的啟動(dòng)子(Geng etal.Expression analysis of four flower-specific promoters of Brassica spp.in theheterogeneous host tobacco. African Journal of Biotechnology. 2009, 8(20):51935200)。此外，Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達(dá)基因啟動(dòng)子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseTl融合后轉(zhuǎn)化植物，核酸酶基因在花藥中特異表達(dá)，并破壞絨氈層，獲得雄性不育煙草和油菜(Mariani C. etal. Induction of male sterility in plants by a chimaericribonuclease gene. Nature, 1990，347:737741 )。目前 TA29 啟動(dòng)子已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上應(yīng)用并獲得成功(宋揚(yáng)等，植物組織特異性啟動(dòng)子研究。生物技術(shù)通報(bào)，2007，(4):2124)。由此可見，即使不同的植物之間的體內(nèi)環(huán)境不同以及基因間存在互作差異，即使是與擬南芥性質(zhì)差異較大的植物，只要具有保守的核心啟動(dòng)區(qū)域和相應(yīng)保守的調(diào)控元件，就可以在其他不同植物中發(fā)揮啟動(dòng)下游基因表達(dá)的生物學(xué)功能。近年來，對(duì)啟動(dòng)子的功能研究，大量文獻(xiàn)報(bào)道采用的方法通常是先用生物信息學(xué)初步預(yù)測(cè)和分析啟動(dòng)子序列后，再將啟動(dòng)子片段與報(bào)告基因融合構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥、煙草、水稻等的離體培養(yǎng)細(xì)胞或植物體，再通過檢測(cè)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中的表達(dá)情況分析啟動(dòng)子的功能并加以利用。大量的文獻(xiàn)報(bào)道顯示其他植物的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化到上述植物中均可正常的行使其生物功能，如在芝麻中克隆的微粒體油酸脫氫酶基因(FAD2)的啟動(dòng)子，此啟動(dòng)子中的E-box和G-box元件與三酰甘油的生物合成有關(guān)。在轉(zhuǎn)基因擬南芥和其他轉(zhuǎn)基因植物中也顯示出了種子特異性的表達(dá)(Mi Jung Kim, Heeja Kim, Mi Chung Suh. Seed-specific expression of sesame microsomal oleicacid desaturase is controlledby combinatorial properties between negativecis-regulatory elements in the SeFAD2promoter and enhancers in the5 ' -UTRintron. Molecular Genetics and Genomics. 2006，276 (4) : 351-368)。從玉米中克隆的ZmGLUl基因啟動(dòng)子，連接⑶S報(bào)告基因后轉(zhuǎn)化至煙草中，檢測(cè)分析結(jié)果玉米的ZmGLUl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了 GUS基因在煙草根部高效表達(dá)(Riliang Gu, Li Zhao, Guoying Wang. Isolationof a maize beta—glucosidase gene promoter and characterization of its activityin transgenic tobacco. Plant Cell Reports. 2006，25 (11) : 1157-1165)。從馬鈴薯中分離的一個(gè)與乙醇脫氫酶非常相似的TDF511 (tran-script derived fragment)基因Stgan的啟動(dòng)子。構(gòu)建Stgan啟動(dòng)子-GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，GUS組織化學(xué)染色顯示該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因在煙草莖結(jié)節(jié)處特異表達(dá)，可能參與塊莖形成過程(Trindade L M, etal. Isolation and functional characterization of a stolon specific promoter frompotato (Solanum tuberosum L.). Gene, 2003, 303:77-84.)。以上這些報(bào)道都是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不同的植物間進(jìn)行啟動(dòng)子功能分析的例子，這些實(shí)例表明利用模式植物擬南芥、煙草等作為載體，通過轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析證實(shí)來自于其他植物的啟動(dòng)子的功能是被廣泛認(rèn)可和接受的。油菜作為中國(guó)主要的油料作物，在長(zhǎng)江流域廣泛種植，對(duì)國(guó)計(jì)民生具有重要影響。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)基因油菜必然會(huì)面臨轉(zhuǎn)基因安全風(fēng)險(xiǎn)的輿論。用在油菜種子中完全不表達(dá)的啟動(dòng)子來啟動(dòng)目的基因的表達(dá)是解決這個(gè)問題的一個(gè)可行方法，既達(dá)到既提高油菜各方面品質(zhì)，又不引起食用油安全風(fēng)險(xiǎn)的目的。因此，本發(fā)明開發(fā)了一個(gè)甘藍(lán)型油菜內(nèi)源啟動(dòng)子。通過檢測(cè)報(bào)告基因⑶S的表達(dá)特征證明啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在根、莖、葉片、角果、種子中不表達(dá)，在花藥和花粉粒中高量表達(dá)。我們的結(jié)果預(yù)示著該基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中具有良好的應(yīng)用前景
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜PBnKabeDI3啟動(dòng)子，其優(yōu)點(diǎn)在于二個(gè)方面首先，來源于油菜內(nèi)源的組織特異性啟動(dòng)子能夠精確定位所調(diào)控的基因，驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因油菜的特定組織或時(shí)期表達(dá)，避免造成植物自身能源和物質(zhì)的浪費(fèi)。其次，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)效率，限制其表達(dá)部位。因此，該啟動(dòng)子可應(yīng)用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全轉(zhuǎn)基因研究。本發(fā)明的第二個(gè)目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜PBnKabeDI3啟動(dòng)子的制備方法。該方法以甘藍(lán)型油菜基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得甘藍(lán)型油菜PBnEabeDI3序列。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。本發(fā)明的第三個(gè)目的是在于提供了一種含有植物高效表達(dá)啟動(dòng)子的重組載體，其含有所述的啟動(dòng)子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的標(biāo)記基因GUS表達(dá)強(qiáng)度高，容易檢測(cè)。通過這個(gè)載體轉(zhuǎn)化擬南芥可以獲得GUS基因在植物中高效表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明第四個(gè)目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜PBnKabeDI3啟動(dòng)子在花藥、花粉粒 中的應(yīng)用。在該啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，目的基因主要在植株的花藥中精細(xì)表達(dá)，在其它部位不表達(dá)。這一具有組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子在創(chuàng)建不育系、人工創(chuàng)建種質(zhì)資源等基因工程和轉(zhuǎn)基因安全(食用、花粉漂流)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對(duì)油菜發(fā)育過程中的相關(guān)基因進(jìn)行了深入和全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種新的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源基因在擬南芥的花藥和花粉粒中高效表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，上述目的可以通過提供一種啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子能夠特異性驅(qū)動(dòng)下游基因在擬南芥中高效表達(dá)，所述啟動(dòng)子含有SEQ ID No. I核苷酸序列或與SEQ ID No. I實(shí)質(zhì)上同源的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供含有所述啟動(dòng)子的核苷酸序列的重組載體來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的微生物來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供用所述微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥來實(shí)現(xiàn)。I 一種甘藍(lán)型油菜啟動(dòng)子PBnEabeDI3的制備方法，其步驟是I. I同源序列法克隆
PBnEabGDI3 序列I. I. I油菜啟動(dòng)子
PBnEabGDI3 的引物序列根據(jù)油菜全基因組測(cè)序獲得的BnRab⑶13基因序列信息，在其ATG起始密碼子處上游2kb位置序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此序列包括甘藍(lán)型油菜BnRab⑶13基因的起始密碼子和該基因的啟動(dòng)子序列。采用的引物為PBnRab⑶I3S :5' -(Kpn I)CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3'和 PBnRab⑶I3A :5' -(Xba I)GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3/。所用正向引物PBnRab⑶I3S含有Kpn I酶切位點(diǎn)，反向引物PBnRab⑶I3A含有Xba I酶切位點(diǎn)。I. 2. 2油菜啟動(dòng)子
PBnEabGDI3 的制備
本發(fā)明所用油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)中雙九號(hào)(油料作物研究所王新發(fā)副研究員提供，以下相同)。中雙九號(hào)播種于大田，正常田間管理。利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取中雙九號(hào)油菜葉片基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟是提取基因組DNA25y 1，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μ 1，分別添加IOXEx Taq buffer5y I,dNTP4 μ 1，5，引物 I μ 1，3，引物 I μ I,ExTaqO. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 約 50ng, ddH2037. 5 μ I。引物為根據(jù)油菜全基因組測(cè)序獲得的BnRab⑶13基因上游2kb序列設(shè)計(jì)的PBnRab⑶I3S和PBnRab⑶13A (前面已述)。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2064bp，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5分鐘，94°C I分鐘，60。。I分鐘，720C 2分鐘，33個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，16°C 3小時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質(zhì)量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨芐青霉素50μ g/mL (質(zhì)量體積比，以下相同)的LB固體培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解 于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養(yǎng)皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，挑選白斑6個(gè)。采用 M13 引物5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'和 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落PCR檢測(cè)。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應(yīng)體系為 10 μ L 內(nèi)含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I, I. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’引物(10ymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ l,Taq(5U/y 1)0. 5 μ l，ddH206. 5 μ I。反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，550C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為2064bp，I. 0%(前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小正確后。將PCR檢測(cè)大小正確的菌斑接種到含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取質(zhì)粒，I. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA大小正確后(為2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2種酶購(gòu)自TaKaRa公司，以下相同)切對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(以下相同),酶切體系(以下相同)為 10 μ 1，包含質(zhì)粒 DNA5y I, Kpn I O. 5 μ I, Xba 10. 5 μ l,ddH204y 1，37°C 過夜，
I.0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將檢測(cè)正確的陽(yáng)性重組克隆命名為pMD18-PBnEabeDI3(將目的片段PBnKabeDI3連入PMD18-T載體構(gòu)建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動(dòng)子的序列信息，將pMD18-PBnKabeDI3送上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序，分析結(jié)果顯示，獲得了一種分離的油菜BnRab⑶13基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO: I所示核苷酸序列。命名為PBnKaM)I3。將所克隆并測(cè)序得到的BnRab⑶13上游序列PBnKab_用啟動(dòng)子核心元件和上游順式作用兀件用預(yù)測(cè)軟件 PLACE 中的 Signal Scan Search (Higo et al. , Plant cis-actingregulatoryDNA elements(PLACE) database. Nucleic Acids Research. 1999,27:297 300. http ://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)、PlantCARE (MagaliLescot, Patrice DAehais,Gert Thijs,et al. PlantCARE,a database of plantcis-acting regulatory elements and a portal to tools for in siIico analysis ofpromoter sequences. Nucleic Acids Res, 2002, 30(I):325-327. http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 和 Softberry 的 PlantPromDB (IIhamA. Shahmuradov, Alex J. Gammerman, John M. Hancock, et al. PlantProm:a database ofplant promoter sequences. Nucleic Acids Res.,2003,31 (I):114-117. http://linuxl.softberry.com/berry, phtml topic=pIantprom&group=data&subgroup=pIantprom)這些在線軟件進(jìn)行BnRabGDI3啟動(dòng)子核心元件和上游順式作用元件的在線預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明，BnRab⑶13啟動(dòng)子序列PBnKab_含有真核生物啟動(dòng)子必須的核心元件TATA-box 和 CAAT-box，與 TATA-box 相距 30bp。與 CAAT-box 相距 60bp 處的 A 為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這與真核生物的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多為A這一規(guī)律一致。進(jìn)一步分析該啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)，除了必須的核心元件之外，BnRabGDI3啟動(dòng)子序列中還存在多種已知的啟動(dòng)子功能元件(I) P0LLENILELAT52 (AGAAA)、LAT enhancer element (TGTGA)、GTGA-motif (GTGA) 和TTTCT元件，這些是花粉特異啟動(dòng)子的功能元件；(2 ) CCGTCC-box (CCGTCC )，為分裂組織特異表達(dá)元件；(3) Skn-Ijnotif (GTCAT),為胚乳高水平表達(dá)的順式調(diào)控元件；(4)MBS (TAACTG)，為響應(yīng)干旱脅迫的MYB蛋白結(jié)合位點(diǎn)；(5) TCA_element (GAGAAGAATT)，為水楊酸順式調(diào)控元件；(6)CGTCA-motif (CGTCA)，為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件；(7) 02-site(GATGATGTAG)，為代謝調(diào)控位點(diǎn)；(8)D0FC0REZM (AAAG)，是Dof轉(zhuǎn)錄因子的作用位點(diǎn)(BateN,Twell D. Functional architecture of a late pollen promoter:pollen-specifictranscription is developmentalIy regulated by multiple stage-specific andcodependent activator elements.Plant Molecular Biology. 1998, 37, 859 - 869 ；Park, J. I. , Hakozaki, H. , Endo, M. , et al. Molecular characterization of maturepollen-specific genes encoding novelsmalI cysteine-rich proteins inrice (Oryza sativa L·)· Plant Cell Reports,2006, 25 (5):466-474 ；Rogers, H.J. , Bate, N. , Combe, J. , et al.Functional analysis of cis-regulatory elementswithin the promoter of the tobacco late pollen gene glO[J]. PlantMolecularBiology, 2001, 45(5) :577 - 585.)(圖 2)。由此申請(qǐng)人預(yù)測(cè) BnRab⑶ 13 的啟動(dòng)子可能是一個(gè)花藥特異啟動(dòng)子，而且由于多個(gè)成熟花粉特異元件和增強(qiáng)子的存在，它可能在花藥的成熟花粉細(xì)胞中表達(dá)量最高。本發(fā)明通過將轉(zhuǎn)PBnKabeDI3連接報(bào)告基因⑶S構(gòu)建的植物表達(dá)載體pBI-PBnKabeDI3轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行活性檢測(cè)的結(jié)果表明該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因僅在擬南芥的花藥中高效表達(dá)，在種子、葉片、根及莖中均不表達(dá)。因此，PBnEabGDI 3具有驅(qū)動(dòng)下游基因在擬南芥花藥中聞效表達(dá)，而在種子和其他部位不表達(dá)的功能。這一具有組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子在植物基因工程和轉(zhuǎn)基因安全(食用)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。2、一種甘藍(lán)型油菜啟動(dòng)子PBnKabeDI3在轉(zhuǎn)基因植株的花藥中的應(yīng)用，其步驟是2. lPBnEabGDI3植物表達(dá)載體的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 (購(gòu)于上海滬尚生物科技有限公司，以下相同)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組載體是將質(zhì)粒pBI121(購(gòu)自TaKaRa公司，以下相同)上的35S啟動(dòng)子用技術(shù)方案I中克隆得到PBnEabeDI3片段替換而來。為完成此目的，首先用Xba Ι/Κρη I(Chen, P. Y. , Wang, C. K. , Soong, S. C. To, Κ. Y. Complete sequence of the binary vectorpBI121and itsapplication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol.Breed. 11，287-293)雙酶切克隆載體pMD18-PBnEaM)I3的啟動(dòng)子片段，同時(shí)用Xba I/Kpn I(前面已述)酶切PBI121質(zhì)粒。酶切體系(前面已述)為10 μ 1，酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個(gè)小時(shí)之后，用I. 0% (前面已述)瓊脂糖膠電泳檢測(cè)。將克隆載體pMD18-PBnEabeDI3酶切下的大片段(大小為2064bp，和pBI121 (前面已述)酶切下的小片段(約1400bp)用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnEabeDI3酶切下的大片段和pBI121 (前面已述)酶切下的小片段(150ng大片段50ng小片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，力口入T4DNA連接酶I μ 1，IOX反應(yīng)緩沖液I μ 1，無菌的ddH20補(bǔ)充體積至10 μ L，16°C連接過夜。熱激法(前面已述)轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細(xì)胞(前面述)后,在含有卡那霉素(50μ g/mL)的固體LB培養(yǎng)基(前面述)平板上篩選，挑取白色菌斑做菌落PCR (前面述)，提取質(zhì)粒(前面已述)，經(jīng)酶切驗(yàn)證大小正確(酶切片段為2064bp)的重組質(zhì)粒命名為pBI-PBnKabeDI3 (圖3)。利用凍融法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)步驟如下I :取0. 2ml農(nóng)桿菌感受態(tài)，于冰中緩慢融化。 2 :加入約2 μ g重組質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細(xì)胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液體培養(yǎng)基(前面已述)，28°C輕搖培養(yǎng)4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，細(xì)胞重懸于0. 2ml LB液體培養(yǎng)基(前面已述)培養(yǎng)基。5 :將培養(yǎng)物均勻涂布在含Rif (50mg/L),Str (50mgL)和Kan (50mgL)的LB固體培養(yǎng)基(前面已述)雙抗瓊脂板上，280C培養(yǎng)2天，待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)驗(yàn)證(前面已述)。2. 2PBnEabGDI3 的功能分析2. 2. lPBnEabGDI3植物表達(dá)載體pBI-PBnEabeDI3在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選米用花序侵染法(ZhangX. R. et al. Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。制備含有重組載體pBI-PBnEabeDI3的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基(前面已述)中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEK0L1300)于276nm納米波長(zhǎng)下檢測(cè)菌液的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在I. 6-2. O之間時(shí)取出。室溫(20-25°C，以下相同)下以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質(zhì)量體積t匕，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwet 1-77 (購(gòu)自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個(gè)花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個(gè)黑色塑料袋包好，放在生長(zhǎng)箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個(gè)月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0. 1% (質(zhì)量比)的升汞分別表面消毒3分鐘和10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到含有濃度為50mg/L卡那霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液10ml ；MS有機(jī)母液10ml ；MS鐵鹽IOml ；肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小時(shí)，溫度白天22°C，暗周期20°C)培養(yǎng)，篩選得到的轉(zhuǎn)化植株，稱Tl代轉(zhuǎn)化植株(以下相同)。根據(jù)表達(dá)載體上特有的卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性植株。葉片長(zhǎng)到足夠大小時(shí)(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)化材料的 PCR 陽(yáng)性檢測(cè)(以下相同)。引物為 NPT II F :5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和 NPT II R 5 ' -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '，反應(yīng)體系為 10 μ I 內(nèi)含模板 DNA 模板 I μ L (約 50ng)，IOXTaq buffer (含 MgCl2) I μ 1，I. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 弓丨物(lOymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH205. 5 μ I。反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，32個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為800bp(圖4)。結(jié)果表明獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(含有檢測(cè)目的片段的植株稱陽(yáng)性植株，以下相同)。表IMS培養(yǎng)基母液配方
權(quán)利要求
1.一種分離的啟動(dòng)子PBnRab⑶13，其序列為SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離的啟動(dòng)子，其特征在于所述的啟動(dòng)子含有重組載體 PBI- PBnRab⑶I3。
3.權(quán)利要求I所述的一種甘藍(lán)型油菜啟動(dòng)子PBnRabGDI3的制備方法，其步驟是 (O油菜啟動(dòng)子PBnRab⑶13的引物序列 根據(jù)油菜全基因組測(cè)序獲得的Bn Rab⑶13基因上游2kb序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得油菜BnRab⑶13的5’上游啟動(dòng)子序列，所用引物為PBnRab⑶I3S 5丨CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3 '和 PBnRab⑶I3A :5' - GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3 '; (2)油菜啟動(dòng)子PBnRab⑶13的制備 根據(jù)油菜全基因組測(cè)序獲得的BnRab⑶13的5’上游2kb序列設(shè)計(jì)所用的引物PBnRab⑶I3S和PBnRab⑶I3A，利用SDS裂解法提取油菜葉片基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟是提取油菜基因組DNA 25 μ 1，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μ I,分別添加 IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，5’ 引物 I μ 1，3’ 引物 I μ 1，ExTaq0.5 μ 1，DNA模版I yl50ng，ddH20 37. 5μ I,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2064 bp，PCR反應(yīng)程序?yàn)?40C 5分鐘，94°C I分鐘，60°C I分鐘，72°C 2分鐘，33個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，16°C 3小時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%質(zhì)量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠回收試劑盒純化回收后，連接到PMD18-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，PCR檢測(cè)陽(yáng)性和酶切驗(yàn)證后測(cè)序，得到目的基因上游2kb側(cè)翼序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析此序列為BnRab⑶13的啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，命名為PBnRab⑶13。
4.權(quán)利要求I中所述的一種分離的啟動(dòng)子PBnRabGDI3在擬南芥花藥中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I中所述的一種分離的啟動(dòng)子PBnRabGDI3在擬南芥花粉粒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)型油菜BnRabGDI3啟動(dòng)子的制備方法及應(yīng)用。其步驟1、獲得啟動(dòng)子PBnRabGDI3擴(kuò)增的引物序列根據(jù)油菜全基因組測(cè)序獲得的PBnRabGDI3基因上游2kb序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2、利用SDS裂解法提取油菜葉片基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠回收試劑盒純化回收后，連接到pMD18-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，得到目的基因上游2kb側(cè)翼序列，序列為PBnRabGDI3。GUS染色結(jié)果表明PBnRabGDI3在油菜花藥、花粉粒中高效表達(dá)，在根、莖、葉、角果和種子等組織中不表達(dá)。該啟動(dòng)子在油菜轉(zhuǎn)基因食用油安全性，提高作物品質(zhì)和人工創(chuàng)建種質(zhì)資源等方面，具有良好的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102965374SQ20121049138
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者劉勝毅, 董彩華, 黃軍艷, 李振波, 劉越英, 程曉輝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所