專利名稱：糞腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種糞腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
糞腸球菌(Enterococcus faecalis)又叫糞鏈球菌,是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的球菌，是腸球菌屬的代表菌種，為條件致病菌，普遍存在于水環(huán)境中，由于其可以抵抗多邊的不利環(huán)境如氯處理、城市污水處理、高鹽和具有耐熱性，因此可以在水中存活很長時(shí) 間。糞腸球菌是水體受到糞便污染的重要指示菌，更能客觀地反映水質(zhì)的衛(wèi)生狀況，在各種淡水和海水中，糞腸球菌弓I起的疾病已超過了大腸菌群。為此，美國環(huán)境保護(hù)協(xié)會(huì)(USEPA )、國際食品法典委員會(huì)(CAC)、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)以及中華人民共和國城鎮(zhèn)建設(shè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在對(duì)城市供水、飲用水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中增加了水中糞腸球菌等致病菌檢測(cè)指標(biāo)。我國新修訂的GB8537-2008《飲用天然礦泉水》亦明確規(guī)定糞腸球菌不得檢出，即將出臺(tái)的包裝飲用水國家標(biāo)準(zhǔn)也需要檢測(cè)該指標(biāo)。國內(nèi)外已有因糞腸球菌污染引起的食物中毒報(bào)告，對(duì)糞腸球菌的耐藥性機(jī)制亦進(jìn)行了深入探索，但在飲用水中其污染狀況和快速檢測(cè)技術(shù)方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。目前，國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中通用的方法是KF鏈球菌培養(yǎng)基結(jié)合濾膜法。水樣過濾后將濾膜轉(zhuǎn)移到KF培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，若濾膜上有紅色或粉紅色菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)基和進(jìn)一步生化鑒定，檢測(cè)方法繁瑣，整個(gè)檢測(cè)過程大約3-5天，靈敏度低，且不能滿足現(xiàn)場快速檢測(cè)的需要，特別是大批量水樣的快速檢測(cè)。因此，十分必要研制新型快速檢測(cè)技術(shù)，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高水樣檢測(cè)效率。LAMP技術(shù)是2000年Notomi等開發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)待測(cè)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4-6條特異性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65°C左右等溫條件Ih內(nèi)可以進(jìn)行特異高效快速的核酸擴(kuò)增，達(dá)到IO9拷貝，擴(kuò)增結(jié)果可直接觀察焦磷酸鎂沉淀或者加入顯色劑進(jìn)行判斷。LAMP方法與PCR技術(shù)相比，檢測(cè)時(shí)間短，具有更高的靈敏度和特異性，操作簡單，僅僅需要普通水浴鍋就可以完成檢測(cè)。近年來已廣泛用于疾病預(yù)防和病原檢測(cè)等方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種快速、特異好、靈敏高的應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的檢測(cè)引物組,利用該檢測(cè)引物組可以特異性的檢測(cè)糞腸球菌。本發(fā)明在篩選糞腸球菌mtlF、EF0027和groES靶基因的基礎(chǔ)上，通過篩選和優(yōu)化引物，建立了一種LAMP擴(kuò)增方法，通過摸索樣品前處理?xiàng)l件(增菌)，將樣品處理技術(shù)結(jié)合LAMP技術(shù)有機(jī)結(jié)合，建立了糞腸球菌的快速檢測(cè)方法，該方法的應(yīng)用對(duì)于飲用水快速檢測(cè)和保障飲用水質(zhì)量安全具有重要意義，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的檢測(cè)引物組，其特征在于，由下列引物組成上游外引物為F3 :5’ -GCCATTCCTCATGGAACAG-3’(如 SEQ ID NO.1 所示)；下游外引物B3 :5’ -CCACGTTATCCATATCACTACA-3’(如 SEQ ID NO. 2 所示)；上游內(nèi)引物FIP : 5 ’ -CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3，(如SEQ ID NO. 3 所示)；下游內(nèi)引物BIP :5’ -TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’(如SEQ ID NO. 4 所示)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的糞腸球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細(xì)菌DNA，然后通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用上述檢測(cè)引物組對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。所述的樣品優(yōu)選為水樣品，進(jìn)一步優(yōu)選為飲用水樣品。所述的對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)優(yōu)選是將飲用水樣品過O. 45 μ m的濾膜，將濾膜移至腦心浸液肉湯(BHI)中培養(yǎng)，36°C ±1°C培養(yǎng)10h，獲得增菌液。所述的通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用上述檢測(cè)引物組對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系為體系總體積25 μ L,包括2. 5μ L IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、O. 4 μ L10mmol/LdNTPs、0. 5 μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物Β3、1μ L40ymol/L上游內(nèi)引物FIP、ly L 40 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0. 6 μ LlOOmmol/L MgS04、12. 5yL2mol/L 甜菜堿、2 4 1^滅菌雙蒸水(1(1!120，14 1^ Bst DNA 聚合酶(8U/μ L )和3 μ L細(xì)菌DNA模板，反應(yīng)條件為在溫度為6(T65°C孵育45 60min。所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用電泳檢測(cè)、熒光顯色檢測(cè)或濁度檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是否具有擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選用熒光顯色檢測(cè)，具體是在80°C終止反應(yīng)f2min，在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入SYBR Green I顯色劑，I飛min后觀察結(jié)果，如果顏色為橙色，則樣品糞腸球菌陰性，無糞腸球菌，如果顏色為綠色，則樣品糞腸球菌陽性，含有糞腸球菌。所述的lOXThermopol反應(yīng)緩沖液是現(xiàn)有技術(shù)中的物質(zhì)，可以從試劑公司購買至丨J，其含有200mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化鉀(KCl)、100mmol/L 硫酸銨(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量為水。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種糞腸球菌的檢測(cè)試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑和檢測(cè)引物組，其特征在于，所述的檢測(cè)引物組由下列引物組成上游外引物為F3 :5’ -GCCATTCCTCATGGAACAG-3’ ；下游外引物B3 :5 ’ -CCACGTTATCCATATCACTACA-3，；上游內(nèi)引物 FIP : 5 ’ -CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3 ’ ；下游內(nèi)引物BIP :5’ -TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。所述的糞腸球菌的檢測(cè)試劑盒還包括腦心浸液肉湯(BHI)。本發(fā)明針對(duì)糞腸球菌的mtlF特異性基因設(shè)計(jì)特異性引物，具有較強(qiáng)的特異性，適于糞腸球菌的檢測(cè)。本發(fā)明針對(duì)糞腸球菌的mtlF基因，設(shè)計(jì)和篩選了一套特異性檢測(cè)引物組以及含有該檢測(cè)引物組的檢測(cè)試劑盒和利用該檢測(cè)試劑盒通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的檢測(cè)方法，進(jìn)而確定待檢測(cè)樣品中是否存在糞腸球菌的檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率好、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，從樣品處理到報(bào)告結(jié)果只需花12h，不需要PCR儀和電泳儀，操作過程簡單，比其他PCR技術(shù)具有更高的特異性(PCR不能屎腸球菌)，特別適合基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和飲用水加工企業(yè)自檢使用，對(duì)于飲用水快速檢測(cè)和保障飲用水質(zhì)量安全具有重要意義。


圖1是純菌靈敏度實(shí)驗(yàn)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果1 :陰性對(duì)照；2 7. 4 X 10°CFU/ml ；3 :7. 4xl01CFU/ml ；4 :7. 4xl02CFU/ml ；5 :7. 4xl03CFU/ml ；6 :7. 4x104CFU/ml ；7 -J. 4xl05CFU/ml ；8 :陽性對(duì)照；9 DL2000 ；圖2是mtlF-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果1 :7. 4 x 10°CFU/ml ；
27. 4 X Io1CFUAiI ；3 :7. 4 x 102CFU/ml ；4 :7. 4 x 103CFU/ml ；5 :7. 4 x 104CFU/ml ；6 7. 4 X 105CFU/ml ；7 DL2000 ；8 :陽性對(duì)照；9 :陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 :水源水中糞腸球菌檢測(cè)1、水樣過濾取250mL水樣無菌操作濾過0.45μπι濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到30ml腦心浸液肉湯(BHI)中培養(yǎng)，36°C ±1°C培養(yǎng)10h，獲得細(xì)菌培養(yǎng)物。2、細(xì)菌DNA的提取取ImL細(xì)菌培養(yǎng)物于12000r/min離心5min，棄上清，收集菌體，加入50 μ L TE充分懸浮混勻，于100°C水浴IOmin,冰浴3min, 12000r/min離心5min,取上清備用，即得到細(xì)菌 DNA。3、LAMP 擴(kuò)增環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系為體系總體積25 μ L,包括2. 5 μ L IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L10mmol/L dNTPs.O. 5μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物Β3、1μ L40ymol/L上游內(nèi)引物FIP、ly L 40 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0. 6 μ LlOOmmol/L MgS04、12. 5yL2mol/L 甜菜堿、2 4 1^滅菌雙蒸水(1(1!120，14 1^ Bst DNA 聚合酶(8U/μ L )和
3μ L細(xì)菌DNA模板，反應(yīng)條件為在溫度為60°C孵育60min。LAMP檢測(cè)引物為上游外引物為F3 :5’ -GCCATTCCTCATGGAACAG-3’下游外引物B3 :5 ’ -CCACGTTATCCATATCACTACA-3，上游內(nèi)引物FIP : 5 ’ -CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3 ’下游內(nèi)引物BIP :5’ -TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。80°C終止反應(yīng)l_2min，取出反應(yīng)管。4、顯色劑觀察在反應(yīng)管中加入IyL 10%的SYBR Green I顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色[陰性對(duì)照(大腸桿菌8099的基因組DNA)橙色，陽性對(duì)照(糞腸球菌ATCC29212的基因組DNA)綠色]，說明樣品有糞腸球菌污染。這與傳統(tǒng)生化鑒定方法檢測(cè)結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠。實(shí)施例2 :瓶裝水中糞腸球菌檢測(cè)取250ml瓶裝水水樣按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行LAMP檢測(cè)，只是LAMP的反應(yīng)溫度為65°C孵育45min，其他與實(shí)施例1相同。結(jié)果為反應(yīng)管顏色變?yōu)槌壬?陰性對(duì)照(大腸桿菌8099的基因組DNA)橙色，陽性對(duì)照(陽性菌株糞腸球菌ATCC29212的基因組DNA)綠色)，說明樣品沒有糞腸球菌污染。這與傳統(tǒng)生化方法檢測(cè)結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠。實(shí)施例3 一、LAMP方法靶基因的篩選本發(fā)明以糞腸球菌的mtlF、EF0027和groES共3個(gè)靶基因設(shè)計(jì)LAMP引物，如表I所示，利用這些LAMP引物對(duì)糞腸球菌(CMCC32223、ATCC29212)和屎腸球菌(E. Faecium)ATCC19434進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，具體步驟如下表1:LAMP 引物
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的檢測(cè)引物組, 其特征在于，由下列引物組成上游外引物為 F3 :5’ -GCCATTCCTCATGGAACAG-3’ ；下游外引物 B3 :5’ -CCACGTTATCCATATCACTACA-3’ ；上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’ ；下游內(nèi)引物 BIP :5’ -TGCTACCGTATTAITTGGGATTGCAAAGTGCAAITTGTTGGACTA-3’。
2.一種非疾病的診斷和治療目的的糞腸球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細(xì)菌DNA，然后通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的樣品為水樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的水樣品為飲用水樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)是將飲用水樣品過O. 45 μ m的濾膜，將濾膜移至腦心浸液肉湯中培養(yǎng)，360C ± 1°C培養(yǎng)10h，獲得增菌液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系為體系總體積 25 μ L，包括 2. 5μ L IOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L I Ommo I/LdNTP S、O.5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L 40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、lyL 4(^11101/1下游內(nèi)引物81 、0.6 4 1^100_01/1 MgS04U2. 5μ L 2mol/L 甜菜堿、2 μ L滅菌雙蒸水ddH20,1 μ L 8U/μ L Bst DNA聚合酶和3 μ L細(xì)菌DNA模板,反應(yīng)條件為在溫度為60 65°C孵育45 60min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物選用熒光顯色檢測(cè)，具體是在80°C終止反應(yīng)f2min，在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入SYBR Green I顯色劑，Γδπι η后觀察結(jié)果，如果顏色為橙色，則樣品糞腸球菌陰性，無糞腸球菌，如果顏色為綠色，則樣品糞腸球菌陽性，含有糞腸球菌。
8.一種糞腸球菌的檢測(cè)試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑和檢測(cè)引物組，其特征在于， 所述的檢測(cè)引物組由下列引物組成上游外引物為 F3 :5’ -GCCATTCCTCATGGAACAG-3’ ；下游外引物 Β3 :5’ -CCACGTTATCCATATCACTACA-3’ ；上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’ ；下游內(nèi)引物 BIP :5’ -TGCTACCGTATTAITTGGGATTGCAAAGTGCAAITTGTTGGACTA-3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的糞腸球菌的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的糞腸球菌的檢測(cè)試劑盒還包括腦心浸液肉湯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種糞腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組、檢測(cè)方法和試劑盒。該檢測(cè)引物組為上游外引物為F35’-GCCATTCCTCATGGAACAG-3’；下游外引物B35’-CCACGTTATCCATATCACTACA-3’；上游內(nèi)引物FIP5’-CGGTGCCAAAATTAACACCCTTTAGTGAAAAAATCAGGAATCTGTG-3’；下游內(nèi)引物BIP5’-TGCTACCGTATTATTTGGGATTGCAAAGTGCAATTTGTTGGACTA-3’。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率好、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，從樣品處理到報(bào)告結(jié)果只需花12h，不需要PCR儀和電泳儀，操作過程簡單，比其他PCR技術(shù)具有更高的特異性，適合基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和飲用水加工企業(yè)自檢使用。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103014156SQ201210506390
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者徐曉可, 吳清平, 張菊梅, 張淑紅, 郭偉鵬, 周錦禎, 程健恒 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司