專利名稱：一種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因及其表達(dá)純化方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA重組技術(shù)，特別是涉及編碼動(dòng)物蛋白的基因，更為具體的說(shuō)是涉及一種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因、及其表達(dá)純化方法和通途。
背景技術(shù)：
蜈蟻(centipede)是節(jié)肢動(dòng)物門Arthropoda唇足綱Chilopoda動(dòng)物的總稱，全世界約有 3300 種(Edgecombe, G.D.，Giribet, G.，Ann.Rev.Entomo1.2007.52，151-170.)。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣(以下所稱蜈蚣皆為此類)為其中最兇猛的捕食性動(dòng)物，主要以昆蟲(chóng)和小型無(wú)脊椎動(dòng)物為食；大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎動(dòng)物。蜈蚣通過(guò)向獵物注入毒液，直接殺死或麻痹獵物而捕食之。與蜘蛛、蝎等捕食性節(jié)肢動(dòng)物一祥，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，蜈蚣毒液系統(tǒng)發(fā)展出了一系列結(jié)構(gòu)獨(dú)特、性能高效且特異的毒素。然而，與對(duì)蜘蛛和蝎各近百種抗昆蟲(chóng)毒素的深入研究相比，人們對(duì)蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素的石開(kāi)究相當(dāng)薄弱(E.F.Schwartz, C.B.F.Mourao, K.G.Moreira, T.S.Camargos, M.R.Mortari,Pept Sc1.2012.98(4):385-405.)，迄今未見(jiàn)一例蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因的重組表達(dá)。最新的研究掲示，蜈蚣毒液中不僅含有高豐度的新型高分子量毒液蛋白/酶類，也含有分子骨架顯著不同于已知毒素的多肽類毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon57(2011)512-524)，包括多種離子通道毒素(Yang 等，Mol Cell Proteomics.2012 ;11 (9):640-50.)，因而被學(xué)界稱為“新型生物活性分子的豐富來(lái)源”。從蜈蚣毒液中分離獲得新的高效、特異的昆蟲(chóng)神經(jīng)毒素基因及其多肽，進(jìn)而重組表達(dá)或通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)入相應(yīng)的受體，在開(kāi)發(fā)新的神經(jīng)生物學(xué)研究試劑和農(nóng)業(yè)與環(huán)境害蟲(chóng)的生物防治中，具有廣闊的應(yīng)用前
旦
o

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)少棘蜈蚣天然毒素序列，設(shè)計(jì)了適合在大腸肝菌中表達(dá)的DNA序列，并在大腸桿菌中重組表達(dá)，獲得了具有明顯抗昆蟲(chóng)活性的少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了一種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因，是序列表中SEQ ID NOl的核苷酸序列，其具體序列為:CAG GTG CTG GTT GAA GAC GAT GTCCCG TTC CCG GAA MG MG TTC GCC GAC CGT GGT GAA TGT ATC CGT GCG TGT GCT GCC AAGTTT ACC GAT GGC GAC CTG AGC AAA ATC AAA GAT GTG CTG CCG CGT TAC TAC AAG TGTGTG TGT TGG TAT TAT CCG ACC TCG TAA。同時(shí),本發(fā)明還公開(kāi)了重組蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin_Ssm2.1基因突變形成至少含有64%的與SEQ ID NOl中的密碼子相同的突變體基因。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明目 的，發(fā)明人對(duì)預(yù)測(cè)的少棘蜈蚣天然毒素Sc0l0t0Xin-Ssm2a成熟肽的55個(gè)氨基酸殘基序列按大腸桿菌高表達(dá)基因簡(jiǎn)并密碼子的相對(duì)使用頻率作優(yōu)化設(shè)計(jì)，改造了其中36個(gè)密碼子(占55個(gè)密碼子的65.5% )的42個(gè)位點(diǎn)，使改造后的Scolotoxin-Ssm2.1更適于在大腸桿菌中表達(dá)。同時(shí)根據(jù)重組克隆的需要，在該基因的末端加上限制性內(nèi)切酶XhoI的識(shí)別序列,采用化學(xué)合成法合成了全長(zhǎng)的Scolotoxin-Ssm2.1成熟肽結(jié)構(gòu)基因，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)合成的基因與設(shè)計(jì)的完全一致。進(jìn)ー步地，本發(fā)明公開(kāi)了ー種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表達(dá)純化方法，包括如下步驟:A，構(gòu)建含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)韋素 Scolotoxin_Ssm2.1 突變體基因的重組質(zhì)粒 pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1 ；B，將重組質(zhì)粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株；C，上述工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素的菌體；D，將上述菌體清洗、離心、超聲破碎，收集上清液；E，將上清液反復(fù)通過(guò)Ni2+-1DA親和層析柱純化，得到融合蛋白；F，上述融合蛋白經(jīng)過(guò)SUMO蛋白酶酶切，得到重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rbcolotoxin-Ssm2a0特別地，本發(fā)明還公開(kāi)了上述步驟c的具體步驟為:將重組質(zhì)粒的工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6tltl達(dá)到0.6 0.8吋，逐步加入IPTG至終濃度0.5mol/L,于18°C表達(dá)6小時(shí),獲得含有重組蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素的菌體。進(jìn)ー步地，本發(fā)明還公開(kāi)了所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21(DE3)。

利用本發(fā)明所公開(kāi)的表達(dá)純化方法，可以獲得重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素，根據(jù)SDS-PAGE和膠圖掃描灰度分析，蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的24.79%。更進(jìn)一歩地，本發(fā)明還公開(kāi)了由重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因表達(dá)得到的重組蜈蚣抗Si蟲(chóng)讀素 rScolotoxin_Ssm2a0以及上述毒素rScolotoxin-Ssm2a在制備神經(jīng)毒性類制劑中的應(yīng)用，特別是在制備殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。利用本發(fā)明獲得的重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a對(duì)昆蟲(chóng)具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性和致死作用?？捎糜谥苽渖窠?jīng)生物學(xué)研究試劑和生物殺蟲(chóng)劑，也可用于蜈蚣神經(jīng)毒素空間結(jié)構(gòu)及藥理學(xué)活性等研究。最后，本發(fā)明還公開(kāi)了所述重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2a中含有兩對(duì)正確連接的共價(jià)ニ硫鍵，這一高活性重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素的蛋白結(jié)構(gòu)形式。本發(fā)明實(shí)施中對(duì)昆蟲(chóng)神經(jīng)毒性的活性檢測(cè)采用昆蟲(chóng)整體活性測(cè)定法，對(duì)三種不同昆蟲(chóng)作腹腔注射鑒定，結(jié)果(見(jiàn)表1、2和圖9)表明基因工程產(chǎn)生的重組多肽rScolotoxin-Ssm2a具有明顯的昆蟲(chóng)神經(jīng)毒性和殺蟲(chóng)效果。


圖1少棘蜈蟻天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列測(cè)定圖譜。圖2重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1與天然Scolotoxin-Ssm2.1基因及其編碼的氨基酸序列比對(duì)圖；其中第一行為少棘蜈蟻天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列，為了方便標(biāo)示，僅給出與人工設(shè)計(jì)序列不同的堿基，其余未標(biāo)出部分與第二行中的堿基相同；第二行為重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列；第三行為對(duì)應(yīng)的重組少棘蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin_Ssm2a的多肽序列。圖3重組少棘蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素合成基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列測(cè)定圖レ曰。圖4表達(dá)載體pSUMO-Mutant的物理圖譜和多克隆位點(diǎn)示意。圖5重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1的構(gòu)建流程圖6重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳中M:分子量標(biāo)記，1:重組質(zhì)粒Xhol/Xbal酶切結(jié)果，2:空載質(zhì)粒Xhol/Xbal酶切結(jié)果。圖7經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的工程菌表達(dá)融合蛋白的SDS-PAGE分析圖譜圖中M:分子量標(biāo)記；1:未誘導(dǎo)菌總蛋白；2、3:誘導(dǎo)菌總蛋白；4:誘導(dǎo)菌超聲沉淀；5:誘導(dǎo)菌超聲上清。圖8重組融合蛋白與目標(biāo)多肽rScolotoxin_Ssm2a分離的SDS-PAGE分析圖譜圖中M:分子量標(biāo)記；1:超聲上清；2:鎳柱純化上樣流出液；3:鎳柱純化洗脫液；4:酶切混合液；5:酶切液再過(guò)柱的流出液(目標(biāo)肽)；6:酶切液再過(guò)柱的洗脫液(標(biāo)簽蛋白)。圖9重組少棘蜈蟻抗昆蟲(chóng)神經(jīng) 毒素rScolotoxin_Ssm2a對(duì)家蜆的毒性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果中A:10ug/ml 組，B:lug/ml 組，C:0.lug/ml 組，D:0.01ug/ml 組，E:0.0Olug/ml組，F(xiàn):對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于說(shuō)明本發(fā)明而不以任何形式限制本發(fā)明。在本實(shí)施例中，選用少棘蜈蚣的天然毒素基因作為原料。實(shí)施例1:蜈蚣毒腺總RNA的提取與少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1cDNA克隆及序列測(cè)定活體解剖分離蜈蚣毒腺并立即投入液氮中。于液氮中磨碎毒腺后，用Trizol試齊[I (Invitrogen 公司)試劑盒提取總 RNA,按 SMART cDNA Library Construction Kit 說(shuō)明書操作進(jìn)行cDNA第一鏈合成，LD-PCR擴(kuò)增合成第二鏈，蛋白酶K消化、SfiI酶切和柱回收cDNA,與載體入TriplEx2連接、包裝。帶有插入片斷的載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化倒入E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞，SOC培養(yǎng)基37°C Ih IOOrpm恢復(fù)，涂于帶有誘導(dǎo)劑IPTG和X-Gal顯色劑的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白斑，PCR快速鑒定插入片斷大小。檢驗(yàn)合格的cDNA文庫(kù)大規(guī)模培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法提取模板，ABI 3730測(cè)序儀測(cè)序，獲得少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1cDNA序列，測(cè)序結(jié)果參見(jiàn)附圖1。實(shí)施例組2實(shí)施例2-1重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1的構(gòu)建(I)重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1的優(yōu)化與合成按照大腸桿菌的密碼子偏好將少棘蜈蟻天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的cDNA序列優(yōu)化，并在該基因的末端加上限制性內(nèi)切酶Xho I的酶切位點(diǎn)，合成出全長(zhǎng)的重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.1，其核苷酸序列與天然毒素的核苷酸序列比對(duì)參見(jiàn)附圖2。(2)重組表達(dá)載體 pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1 的構(gòu)建:將合成的Scolotoxin-Ssm2.1DNA經(jīng)限制酶XhoI酶切后連接到表達(dá)載體pSUMO-Mutant中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序。結(jié)果正確，說(shuō)明克隆成功，得到重組表達(dá)載體質(zhì)粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1,重組基因序列參見(jiàn)附圖3。實(shí)施例2-2重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a的高效原核表達(dá)(I)重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素融合蛋白的表達(dá)制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1利用熱休克法(42°C熱激45秒)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株，其構(gòu)建基礎(chǔ)及構(gòu)建流程參考圖4與圖5，構(gòu)建結(jié)果檢測(cè)參見(jiàn)圖6。挑取工程菌株單菌落接種于Kan+LB液體豐富培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日取該過(guò)夜菌按1: 100體積比接種于新鮮的Kan+LB豐富培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩放大培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,于18°C誘導(dǎo)表達(dá)6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4°C、
10,OOOrpm 離心 IOmin,收菌。 所得菌體用預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌ー次，離心，再用預(yù)冷的LysisBuffer (50mmol/L NaH2P04，300mmol/LNaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0)以 I: 10 的比例重懸。以200W功率在冰浴下超聲20min破碎細(xì)菌細(xì)胞。超聲結(jié)束后，用4°C、12，OOOg離心20min，收集含重組融合蛋白的上清液。含空載質(zhì)粒PSUMO-M的對(duì)照菌株BL21 (DE3)同樣處理，收集含標(biāo)簽蛋白的上清液。SDS- PAGE電泳檢測(cè)到該基因的表達(dá)產(chǎn)物占全菌蛋白的24.79%,電泳結(jié)果見(jiàn)附圖7。(2)重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a的制備(2.1)重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素融合蛋白的親和層析采用Biologic LP層析系統(tǒng)對(duì)重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素融合蛋白進(jìn)行層析。首先米用20mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl,5mmol/L imidazole,6mol/Lguanidine-HCl,, pH8.0 的緩沖液預(yù)平衡 Ni2+-1DA Sepharose CL-6B 親和層析柱(0.8cm X 2cm)。將含重組融合蛋白的上清液以0.5ml/min流速上樣至上述已經(jīng)預(yù)平衡的Ni2+-1DASepharose CL-6B 親和層析柱；用Ni2+-1DABinding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，5mmol/Limidazole, 6mol/L guanidine-HCl,, pH8.0)以 0.5ml/min 流速洗脫，至流出液 OD28c!值到達(dá)基線，收樣留以電泳，參看附圖8中的第一泳道；用Ni2+-1DA Washing Buffer(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0)以0.5ml/min流速?zèng)_洗,至流出液OD28c!值到達(dá)基線,收樣留以電泳,參看附圖8中的
第二泳道；用Ni2+-1DA Elution Buffer(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mM imidazole,pH8.0)以0.5ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD28tl值到達(dá)基線，收樣。通過(guò)上述親和層析步驟對(duì)上述重組融合蛋白作進(jìn)ー步純化，收集，多次純化后產(chǎn)品參看附圖8中的第三泳道。對(duì)照樣品同樣處理獲得純化后的標(biāo)簽蛋白——SUMO蛋白。(2.2)重組少棘蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin_Ssm2a的制備取上述收集的純化后重組融合蛋白按20: 1(V/V)比例加入SUMO蛋白酶，30°C切割半小時(shí)，混合液參看附圖8中第四泳道，獲得目標(biāo)蛋白——重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a多肽(附圖8中的第五泳道)與標(biāo)簽SUMO蛋白的混合物(見(jiàn)附圖8中的第六泳道)。對(duì)照樣品同樣處理，僅含標(biāo)簽SUMO蛋白。實(shí)施例3重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a對(duì)鱗翅目模式昆蟲(chóng)家蠶的毒性鑒定基本方案:體腔注射法。本實(shí)施例中通過(guò)對(duì)鱗翅目模式昆蟲(chóng)家蠶幼蟲(chóng)的體腔注射實(shí)驗(yàn)鑒定由重組少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.1編碼的多肽rScolotoxin-Ssm2a的昆蟲(chóng)神經(jīng)毒性。實(shí)驗(yàn)步驟:實(shí)驗(yàn)對(duì)象為鱗翅目模式昆蟲(chóng)家蠶多化性品種大造(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所張國(guó)政研究員提供)的三齡幼蟲(chóng)，每組30頭，重復(fù)3次。待測(cè)藥品為經(jīng)過(guò)濾除菌的rScolotoxin_Ssm2a多肽與SUMO標(biāo)簽蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin_Ssm2a的工作濃度為lug/ml，對(duì)照試劑為同樣處理的SUMO標(biāo)簽蛋白。從蠶體第8和第9腹節(jié)右側(cè)的節(jié)間膜處注入試藥IOul后，觀察并記載蟲(chóng)體的活動(dòng)狀況，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率。結(jié)果分析:注入毒液后2-10秒，蠶體即劇烈扭轉(zhuǎn)、痙攣，迅速吐液，持續(xù)數(shù)分鐘后，家蠶頭胸伸出、軀體收縮、肛門拖糞、腹足失去抓握力而側(cè)翻倒地、軟癱至死。10分鐘內(nèi)，3個(gè)給藥組的死亡率皆達(dá)100% (表I)。而注射SUMO標(biāo)簽蛋白的對(duì)照組家蠶僅在注射后數(shù)分鐘內(nèi)靜伏，I小時(shí)后全部恢復(fù)正常爬動(dòng)，無(wú)任何中毒癥狀；24小時(shí)內(nèi)也無(wú)一死亡。由此可得，多肽rSC0l0t0Xin-Ssm2a對(duì)鱗翅目模式昆蟲(chóng)家蠶具有顯著的神經(jīng)毒性及致死作用，可用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑及生物殺蟲(chóng)劑。表I rScolotoxin_Ssm2a對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的神經(jīng)毒性與致死性
權(quán)利要求
1.一種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因，其特征是:SEQ ID NOl的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因，其特征是:重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因突變形成至少含有64%的與SEQ ID NOl中的密碼子相同的突變體基因。
3.一種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表達(dá)純化方法，其特征是包括如下步驟: A，構(gòu)建含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素 Scolotoxin_Ssm2.1 突變體基因的重組質(zhì)粒 pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1; B,將重組質(zhì)粒pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株； C，上述工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素的菌體； D，將上述菌體清洗、離心、超聲破碎，收集上清液； E，將上清液反復(fù)通過(guò)Ni2+-1DA親和層析柱純化，得到融合蛋白； F，上述融合蛋白經(jīng)過(guò)SUMO蛋白酶酶切，得到重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rbcolotoxin-Ssm2a0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因的表達(dá)純化方法，其特征是所述步驟c 的具體步驟為:將重組質(zhì)粒的工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6tltl達(dá)到0.6^0.8吋，加入IPTG至終濃度0.5mol/L,于18°C表達(dá)6小時(shí)，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素的菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因的表達(dá)純化方法，其特征是:所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21 (DE3)。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求3至5中任意一項(xiàng)所述的重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表達(dá)純化方法得到的重組蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin_Ssm2a。
7.組蜈蟻抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a在制備神經(jīng)毒性類制劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的應(yīng)用，特別是重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a在制備殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2a在制備神經(jīng)毒性類制劑中的應(yīng)用，其特征是所述重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a中含有兩對(duì)正確連接的共價(jià)ニ硫鍵。
全文摘要
本發(fā)明屬于DNA重組技術(shù)，特別是涉及編碼動(dòng)物蛋白的基因，更為具體的說(shuō)是涉及一種重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素基因、及其表達(dá)純化方法和通途。根據(jù)少棘蜈蚣天然毒素序列，設(shè)計(jì)了適合在大腸肝菌中表達(dá)的DNA序列，并在大腸桿菌中重組表達(dá)，獲得了具有明顯抗昆蟲(chóng)活性的少棘蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素。利用本發(fā)明獲得的重組蜈蚣抗昆蟲(chóng)毒素rScolotoxin-Ssm2a對(duì)昆蟲(chóng)具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性和致死作用?？捎糜谥苽渖窠?jīng)生物學(xué)研究試劑和生物殺蟲(chóng)劑，也可用于蜈蚣神經(jīng)毒素空間結(jié)構(gòu)及藥理學(xué)活性等研究。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103088030SQ20121051822
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者華衛(wèi)建 申請(qǐng)人:江蘇教育學(xué)院