專利名稱：來源于新疆野蘋果的蛋白質及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來源于新疆野蘋果的蛋白質及其編碼基因與應用。
背景技術：
在自然環(huán)境中，植物生長在開放的系統(tǒng)中，經(jīng)常會遇到冷、熱、旱、澇、鹽堿、大氣污染等不良環(huán)境的影響。不良環(huán)境作用于植物，將會引起植物體內發(fā)生一系列的生理代謝反應，表現(xiàn)為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引起不可逆?zhèn)?，導致整個植株死亡。在各種環(huán)境脅迫中，干旱、低溫、高熱和高鹽等非生物脅迫對植物的影響尤為突出，表現(xiàn)為不同程度地對植物體內水分狀況的影響，因此又成為水分脅迫，是制約植物生長和農作物產(chǎn)量的最主要非生物性逆境因子。植物在長期的進化中，逐漸形成了一系列應答逆境脅迫的生理、代謝以及防御系統(tǒng)。從植物中克隆與調控植物非生物脅迫抗性相關的基因將為提高植物對非生物脅迫的抗性奠定物質基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一個調控植物非生物脅迫抗性和/或調控植物生長的蛋白質及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的蛋白質，名稱為MsDREB2C，來源于新疆野蘋果(Malussieversii (Ledeb. ) Roem.),是如下 a)或 b)的蛋白質a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白質；b)將SEQ ID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物非生物脅迫抗性和/或植物生長相關的由a)衍生的蛋白質。其中，SEQ ID No. 2由398個氨基酸殘基組成。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
標簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II 8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
上述(b)中的MsDREB2C可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的MsDREB2C的編碼基因可通過將SEQ ID No. 1的第151-1347位核苷酸所示的DNA序列中缺失ー個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行ー個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼MsDREB2C的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
所述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)或4)所示的基因1)編碼 MsDREB2C 的 DNA 分子；2)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-1347位核苷酸的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼MsDREB2C的DNA分子；4)與1)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼MsDREB2C的DNA分子。上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 1 X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。其中，SEQ ID No. 1由1438個核苷酸組成，其編碼序列是第151-1347位，編碼SEQID No. 2所不的蛋白質。下述1) -4)中的任ー種生物材料也屬于本發(fā)明的保護范圍1)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的表達盒；2)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的重組載體；3)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的重組微生物；4)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的轉基因細胞系。上述生物材料中，1)所述的含有編碼MsDREB2C的核酸分子的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達MsDREB2C的DNA，該DNA不但可包括啟動MsDREB2C基因轉錄的啟動子，還可包括終止MsDREB2C轉錄的終止子。進ー步，所述表達盒還可包括增強子序列。2)所述的含有編碼MsDREB2C的核酸分子的重組載體具體可為在載體pCB302_3的多克隆位點插入MsDREB2C編碼基因得到的表達MsDREB2C的重組表達載體。3)所述重組微生物具體可為細菌，酵母，藻和真菌。其中，細菌可來自埃希氏菌屬(Escherichia),歐文氏菌(Erwinia),根癌農桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes),假單胞菌屬(Pseudomonas),芽胞桿菌屬(Bacillus)等。4)所述的轉基因細胞系不包括植物的繁殖材料。本發(fā)明還保護編碼MsDREB2C的核酸分子、編碼MsDREB2C的核酸分子或上述任一種生物材料在調控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長中的應用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少ー種。本發(fā)明還提供了ー種培育抗非生物脅迫和/或生長增加的轉基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗非生物脅迫和/或生長增加的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入編碼MsDREB2C的核酸分子得到所述轉基因植物的步驟所述轉基因植物與所述受體植物相比，對非生物脅迫的抗性提高和/或生長增加；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少ー種。上述應用和方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述生長可為營養(yǎng)生長和/或生埴生長。所述營養(yǎng)生長可為根系的生長、莖的生長和/或葉的生長。所述根系的生長具體可體現(xiàn)在主根長度和/或側根數(shù)量上，所述葉的生長具體可體現(xiàn)為葉面積上(葉長和/或葉寬增加)。所述植物為種子植物，所述生殖生長可體現(xiàn)在種
子重量上。在本發(fā)明的一個實施例中，所述調控植物非生物脅迫抗性為調控擬南芥非生物脅迫抗性，所述調控植物生長為調控擬南芥生長。所述轉基因植物為轉基因擬南芥。所述生殖生長體現(xiàn)在花薹高度、花薹數(shù)量和/或種子重量上。上述方法中，所述受體植物可為擬南芥，所述生長増加為花薹數(shù)量増加和/或種
子重量増加。其中所述MsDREB2C基因可先進行如下修飾，再導入受體植物中，以達到更好的表·達效果1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述MsDREB2C基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調節(jié)、發(fā)育調節(jié)、化學調節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；4)與適合的轉錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接；5)引入增強子序列，如內含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。所述MsDREB2C基因可通過MsDREB2C基因表達盒或含有所述MsDREB2C基因表達盒的MsDREB2C基因表達載體導入目的植物。 本發(fā)明中所述MsDREB2C基因表達盒均可含有所述MsDREB2C基因和啟動所述MsDREB2C基因轉錄的啟動子。本發(fā)明中所述MsDREB2C基因表達盒均指能夠在宿主細胞中表達SEQ ID No. 2所示的MsDREB2C的DNA，該DNA不但可包括啟動所述MsDREB2C基因轉錄的啟動子，還可包括終止所述MsDREB2C基因轉錄的終止子。進ー步，所述MsDREB2C基因表達盒還可包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S;來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("LAP" ,Chao等人(1999)Plant Physioll20:979-992);來自煙草的化學誘導型啟動子，發(fā)病機理相關1 (PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻ニ唑-7-硫代羥酸S-甲酷)誘導);西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸￥酯誘導)；熱休克啟動子(美國專利5，187，267);四環(huán)素誘導型啟動子 (美國專利5，057，422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的啟動子(Beachy等人(1985)EMB0 J. 4:3047-3053))。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉錄終止子包括但不限于農桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如Odell 等人(I985)Nature 313:810 ；Rosenberg 等人(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mo1. Gen. Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 GenesDev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ；Joshi 等人(1987)Nucleic AcidRes.，15:9627)。在本發(fā)明的實施例中，所述MsDREB2C基因表達盒中啟動所述MsDREB2C基因轉錄的啟動子為花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S)，終止所述MsDREB2C基因轉錄的終止子為N0S終止子。可用現(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述MsDREB2C基因表達盒的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因(如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。在本發(fā)明的實施例中，所述選擇標記基因為賦予對抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸轉移酶(hph)基因hyg。在本發(fā)明的實施例中，所述MsDREB2C基因通過含有所述MsDREB2C基因表達盒的MsDREB2C基因表達載體導入目的植物。所述MsDREB2C基因表達載體是載體PCB302-3的多克隆位點插入MsDREB2C編碼基因得到的表達MsDREB2C的重組表達載體 pCB302-3-MsDREB2C。所述MsDREB2C基因表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒栽體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞(Weissbach, 1998, MethodforPlant Molecular Biology VIII, Academy Press,New York,pp. 411-463;GeisersonandCorey,1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。當所述目的植物為擬南芥等雙子葉植物時，所述轉基因植物與受體植物相比，具有如下1)-11)中的至少ー種特性1)抗熱脅迫；2)抗干旱脅迫；3)抗冷脅迫；4)主根長度增加；5)側根數(shù)量増加；6)葉長增加；7)葉寬増加；8)葉片重量；9)花薹數(shù)量増加；10)種子重量増加；11)花薹高度降低。所述方法還包括從導入SEQ ID No. 2所示的MsDREB2C的編碼基因的植株中篩選表達所述編碼基因的植株，得到所述轉基因植物的步驟。所述轉基因植物理解為不僅包含將所述基因轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。 實驗證明，導入SEQ ID No. 2所示的MsDREB2C的編碼基因的轉基因擬南芥與受體擬南芥相比，具有如下1)-11)的特性1)抗熱脅迫；2)抗干旱脅迫；3)抗冷脅迫；4)主根長度增加；5)側根數(shù)量増加；6)葉長增加；7)葉寬增加；8)葉片重量；9)花薹數(shù)量増加；10)種子重量増加；11)花薹高度降低。說明MsDREB2C及其編碼基因可用于調控植物非生物脅迫抗性以及植物生長。


圖1為pCB302-3_MsDREB2C重組質粒酶切驗證電泳圖譜。Μ 為 DNA Marker III，1，2 為重組質粒 pCB302_3_MsDREB2C 酶切結果。圖2為轉基因擬南芥的PCR鑒定圖譜。Μ為DNA Marker III ;WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；V:擬南芥col/pCB302_3 ；1，2，3，4 為擬南芥 col/pCB302-3-MsDREB2C 株系。圖3 為 T3 代擬南芥 col/pCB302-3-MsDREB2C 株系 L_1、L_2 和 L-3 中 MsDREB2C 基因表達檢測。WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖4 為 T3 代擬南芥 col/pCB302-3-MsDREB2C 株系 L_l、L-2 和 L-3 在 1/2MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表型分析。在1/2MS培養(yǎng)基中生長11天，測量主根長度，側根數(shù)量(B，D，E)，其中，側根數(shù)量為每厘米主根長度上的側根數(shù)；在1/2MS培養(yǎng)基中生長21天，測量植株高度和鮮重(C，F(xiàn)，G)。平均值和標準差取自3次重復，毎次重復至少20株幼苗(Student’ st-test, #Ρ〈0· 01, *Ρ〈0· 05) ；WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖5為T3代擬南芥col/pCB302-3-MsDREB2C株系L_l、L-2和L-3在土壤中培養(yǎng)的表型分析。植株在1/2MS培養(yǎng)基中生長11天后轉移至土中生長11天(A)，24天(B)，60天(C)。24天測量葉長，葉寬，葉重(D，F(xiàn)，H)以及60天測量花薹高度，花薹數(shù)量，種子重量(E，G，I)。轉基因株系及野生型擬南芥平均值及標準差取自20棵植株(D，E，F(xiàn)，G);平均值及標準差來自三次重復，每次重復選取10片葉子稱重和10棵植株稱種子重量(Student’ st-test, #Ρ〈0· 01, *Ρ〈0· 05) ；WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖6為T3代擬南芥col/pCB302-3-MsDREB2C株系L_1、L-2和L-3對非生物脅迫抗性照片。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。其中，Prybest DNA 聚合酶、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase-Free DNase I、限制性內切酶BamH I與Xba I，T4DNA連接酶，購自TAKARA公司，M-MLV反轉錄酶購自Promega公司，DNA Marker購自中科瑞泰北京生物技術有限公司。氨節(jié)青霉素、硫酸卡鈉酶素、利福平購自北京新經(jīng)科生物技術有限公司。離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京匯 天東方科技有限公司，離心柱型質粒小量提取試劑盒購自北京博大泰恒生物技術有限公司。根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105購自北京博大泰恒生物技術有限公司。根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105購自北京博大泰恒生物技術有限公司。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Analysis of the genome sequenceof the flowering plantArabidopsis thaliana. NATURE. VOL 408. 14DECEMBER 2000· www. nature, com)、雙兀植物轉化載體 pCB302_3 (Chengbin Xiang, etal. A mini binaryvector series for planttransformation. Plant Molecular Biology 40:711 - 717，1999)公眾可從中國農業(yè)大學獲得，以重復本申請實驗。實施例l、MsDREB2C基因的克隆及轉基因載體的構建一、MsDREB2C 基因的克隆以新疆野蘋果(Malus sieversii (Ledeb. ) Roem.)水培苗為材料,CTAB法提取其葉片總RNA，以RNA為模板，反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板，在5'和3'非編碼區(qū)設計特異引物擴增新疆野蘋果MsDREB2C cDNA全長。
リ丨物名稱リ丨物げ列
!:) 1 -FS'-GGATa 丁 (:Γ ..(7
(F劃線為海切位點βωηΗ I )
Ρ1-R51- TCTAGAAATCTGTTTCTTTGCTTTCG-3t
(ド劃線為陶切位點Xba I )PCR反應體系如下在200ul離心管中加入下列組分(25ul體系)
權利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質 a)氣基酸序列如SEQID No. 2所不的蛋白質； b)將SEQID No. 2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物非生物脅迫抗性和/或植物生長相關的由a)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述蛋白的核酸分子。
3.根據(jù)權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為如下I)-4)中任一所述的基因 1)編碼權利要求I所述蛋白的DNA分子； 2)其編碼序列是SEQID No. I的第151-1347位核苷酸的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求I所述蛋白的DNA分子； 4)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權利要求I所述蛋白的DNA分子。
4.下述I)-4)中的任一種生物材料 1)含有權利要求2或3所述核酸分子的表達盒； 2)含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體； 3)含有權利要求2或3所述核酸分子的重組微生物； 4)含有權利要求2或3所述核酸分子的轉基因細胞系。
5.權利要求I所述的蛋白質在調控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長中的應用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長為營養(yǎng)生長和/或生殖生長。
6.權利要求2或3所述的核酸分子在調控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長中的應用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長為營養(yǎng)生長和/或生殖生長。
7.權利要求4所述的生物材料在調控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長中的應用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長為營養(yǎng)生長和/或生殖生長。
8.培育抗非生物脅迫和/或生長增加的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入權利要求3所述核酸分子得到所述轉基因植物的步驟所述轉基因植物與所述受體植物相t匕，對非生物脅迫的抗性提高和/或生長增加；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長為營養(yǎng)生長和/或生殖生長。
9.擴增權利要求2或3所述的核酸分子全長或其任一片段的引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于新疆野蘋果的蛋白質及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的蛋白質是如下a)或b)的蛋白質a)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白質；b)將SEQ ID No.2中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物非生物脅迫抗性和/或植物生長相關的由a)衍生的蛋白質。該蛋白及其基因具有調控植物非生物脅迫抗性和調控植物生長的功能。
文檔編號C12N1/21GK102952182SQ20121051756
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權日2012年12月5日
發(fā)明者李天紅, 趙凱, 沈欣杰, 廖雄, 王琪, 劉琳琳 申請人:中國農業(yè)大學