一種來源于枝孢霉的脂肪酶、其編碼基因序列及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種來源于枝孢霉的脂肪酶、其編碼基因序列及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種基因序列，其編碼(i)具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列；或(i)的第22-464位所示的氨基酸序列；或由(i)所示序列的衍生蛋白序列，或(i)的第22-464位序列的衍生蛋白序列。本發(fā)明還涉及包含SEQ?ID?NO:2所示序列的蛋白或SEQ?ID?NO:2所示序列的衍生蛋白。本發(fā)明的脂肪酶具有耐有機(jī)溶劑、寬廣的pH穩(wěn)定性、較好的溫度穩(wěn)定性等特點(diǎn)，在生物柴油、醫(yī)藥工業(yè)、食品加工、油脂化工、環(huán)境保護(hù)、洗滌劑、紡織、造紙等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種來源于枝孢霉的脂肪酶、其編碼基因序列及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程和酶工業(yè)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及一種脂肪酶、其編碼基因序列及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)即三酰基甘油?；饷?，是一類特殊的酯鍵水解酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體中。脂肪酶的基本構(gòu)成單位為氨基酸，多為一條多肽鏈，其催化活性由其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定。脂肪酶可催化疏水性的天然底物油脂變成水溶性的脂肪酸、甘油或單甘脂或甘二酯，在無機(jī)溶劑中保持高催化活力和極強(qiáng)的穩(wěn)定性，在有機(jī)溶劑中脂肪酶多會(huì)變性或活力下降；但在適宜酶活環(huán)境下，脂肪酶對(duì)底物具有廣譜性或特殊專一性的特點(diǎn)，這促使其被廣泛運(yùn)用于精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等領(lǐng)域。
[0003]在油脂加工及油脂化工行業(yè)多利用脂肪酶制取脂肪酸和甘油、進(jìn)行油脂改性、制備特種油脂、提高中性油得率和制備單甘酯等，而且油脂加工或化工行業(yè)中不同作業(yè)環(huán)境，對(duì)脂肪酶的溫度、催化活性、底物選擇性以及有機(jī)溶劑耐受性等方面的特性的要求也各不相同。
[0004]在洗滌劑工業(yè)中，通過脂肪酶的加入，可提高洗滌劑的去污能力、減少表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量、減輕環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。洗滌行業(yè)對(duì)脂肪酶特性的要求，包括在洗滌體系中良好的酶催化活性、穩(wěn)定性、最適PH和pH適用區(qū)間需在堿性范圍內(nèi)等。
[0005]在生物柴油工業(yè)中，酶法生產(chǎn)生物柴油是生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)的行之有效的選擇。目前其主要瓶頸在于對(duì)脂肪酶的熱穩(wěn)定性和對(duì)甲醇等短鏈有機(jī)醇的耐受性提出更高的要求(李宇揚(yáng)，孫佩慧，胡基埂等.中國生物工程雜志.2008.28(10): 136-140)。
[0006]在醫(yī)藥工業(yè)上，多用脂肪酶來催化有機(jī)合成反應(yīng)，如合成手性胺、硫氮酮等(Jaeger K.E., Reetz Μ.T.Trends in Biotechnology.1998, 16:39-6403)，這要求脂肪酶具有較強(qiáng)的有機(jī)溶劑耐受性、較強(qiáng)的催化活性等。
[0007]對(duì)于近年已發(fā)現(xiàn)的具有機(jī)溶劑穩(wěn)定性的脂肪酶，通常由耐有機(jī)溶劑極端微生物產(chǎn)生，該類微生物由于能適應(yīng)有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性或結(jié)構(gòu)破壞而具有獨(dú)特的抵抗惡劣環(huán)境的能力；因此這類微生物生產(chǎn)的脂肪酶，尤其是胞外酶，多數(shù)具有有機(jī)溶劑耐受性的特點(diǎn)。盡管如此，但這些脂肪酶的有機(jī)溶劑耐受能力不足，脂肪酶的產(chǎn)量較低。
[0008]綜上所述，脂肪酶已廣泛應(yīng)用在精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等多個(gè)行業(yè)，不同的工業(yè)條件對(duì)脂肪酶性質(zhì)的要求也各不相同，沒一種脂肪酶產(chǎn)品能適用所有的工業(yè)環(huán)境或條件，因而尋找和開發(fā)不同性質(zhì)的產(chǎn)量適宜的脂肪酶產(chǎn)品成為酶工業(yè)中的一種共識(shí)。
[0009]在酶工業(yè)上，酶制劑多源自微生物，脂肪酶也無例外。用于脂肪酶生產(chǎn)的微生物多培養(yǎng)簡單、生產(chǎn)周期短、脂肪酶產(chǎn)量大。已知大約有2%的微生物可生產(chǎn)脂肪酶，囊括至少65個(gè)屬，其中細(xì)菌28個(gè)屬、放線菌4個(gè)屬、酵母菌10個(gè)屬、其它真菌23個(gè)屬(汪小鋒，王俊，楊江科等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào).[0010]2008, (4):47-53.) O在這些微生物中，研究較多的為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、地霉屬(Geotrichum)、假絲酵母屬(Candida)、青霉屬(PeniciIlium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)和毛霉屬(Mucor)等。雖然有很多微生物可生產(chǎn)脂肪酶，但在實(shí)際使用條件下應(yīng)用并能通過微生物發(fā)酵高產(chǎn)的脂肪酶即商品化的脂肪酶卻依然很少。因而本領(lǐng)域中依然急需各種鑒定過的特性不同的備選脂肪酶，以待進(jìn)一步開發(fā)。
[0011]本發(fā)明所提供的一種新穎的脂肪酶，經(jīng)過鑒定其具有很強(qiáng)的有機(jī)溶劑耐受性、寬廣的PH穩(wěn)定性、較好的溫度穩(wěn)定性等性質(zhì)，無疑將在精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的:提供一種脂肪酶，及編碼該脂肪酶的基因序列。所述脂肪酶具有耐有機(jī)溶劑的脂肪酶活性、寬廣的PH穩(wěn)定性、較好的溫度穩(wěn)定性等特點(diǎn)，在精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0013]本發(fā)明提供一種編碼脂肪酶的基因序列，所述基因序列編碼:
[0014]⑴具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或
[0015](ii)具有SEQ ID N0:2的第22_464位所示的氨基酸序列；或
[0016](iii)在⑴或(ii)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
[0017]本發(fā)明提供一種脂肪酶基因序列，所述基因序列選自:
[0018](i')具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的序列；或
[0019](ii')具有SEQ ID NO:1的第64-1392位所示的核苷酸序列；或
[0020](iii')在嚴(yán)格條件下與(i')或(ii')限定的序列雜交、且編碼脂肪酶或具有脂肪酶活性的衍生蛋白的序列。
[0021]本發(fā)明提供一種脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列選自:
[0022](a)具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或
[0023](b)具有SEQ ID N0:2中第22-464位所示的氨基酸序列；或
[0024](c) (a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有脂肪酶活性的衍生蛋白質(zhì)；或
[0025](d) (a)或(b)或(C)中蛋白質(zhì)的活性片段或其保守性變異蛋白。
[0026]本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明所述脂肪酶基因序列的載體。
[0027]本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明所述脂肪酶基因序列的宿主細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明提供一種生產(chǎn)本發(fā)明所述脂肪酶的方法，包括:采用包含所述脂肪酶基因序列的宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述的脂肪酶的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；以及，分離由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的所述脂肪酶。
[0029]本發(fā)明提供一種進(jìn)行脂肪酶催化反應(yīng)的方法，包括:[0030](A)使本發(fā)明所述的脂肪酶、宿主細(xì)胞與反應(yīng)體系接觸；以及
[0031](B)在適宜所述脂肪酶進(jìn)行催化的條件下，進(jìn)行催化反應(yīng)。
[0032]本發(fā)明提供一種進(jìn)行本發(fā)明所述脂肪酶催化反應(yīng)的方法，還包括:本發(fā)明所述催化反應(yīng)在有機(jī)溶劑環(huán)境中進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑濃度為0-50%，優(yōu)選為5~45%，優(yōu)選為10-40%，更優(yōu)選為15~35%。優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、DMS0、苯、甲苯、正己烷和異辛烷中的一種或多種。
[0033]本發(fā)明提供一種增強(qiáng)本發(fā)明所述脂肪酶催化活性的方法，包括:所述的脂肪酶或所生產(chǎn)的脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，添加Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+、Ni2+、Triton X-100或AEO-9中的一種或多種，優(yōu)選的，所述Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+的添加濃度為(T50mM，所述的Triton X-100 或 AE0-9 的濃度為 0~2%。
[0034]本發(fā)明提供一種抑制本發(fā)明所述脂肪酶催化活性的方法，包括:采用本發(fā)明所述的脂肪酶或生產(chǎn)的脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，添加Zn2+、Co2+、SDS或CTAB中的一種或多種，優(yōu)選的，所述Zn2+、Co2+的濃度為(T50mM，添加的SDS或CTAB的濃度為0~2%。
[0035]本發(fā)明還提供一種本發(fā)明所述的基因序列、脂肪酶、載體、宿主細(xì)胞在脂肪酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明還提供一種脂肪酶制劑，所述制劑包含:
[0037]a)本發(fā)明所述的脂肪酶或制備的脂肪酶；
[0038]b)包裝物；和
[0039]c)任選的，可接受的輔料。
[0040]本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的脂肪酶或制備的脂肪酶在精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成或手性藥物合成領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0041]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。并且，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對(duì)本文中所述的各種特征和方面進(jìn)行有效的組合，這些組合仍然在本申請(qǐng)所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中以下附圖顯示僅為了圖示說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。
[0043]圖1:本發(fā)明脂肪酶的表達(dá)載體(pPIC9k-lipcS)圖；
[0044]圖2:反應(yīng)溫度曲線；
[0045]圖3:溫度穩(wěn)定性曲線；
[0046]圖4:反應(yīng)pH曲線；
[0047]圖5:pH穩(wěn)定性曲線；
[0048]圖6:本發(fā)明脂肪酶在不同濃度甲醇中的穩(wěn)定性；
[0049]圖7:本發(fā)明脂肪酶在不同有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性；
[0050]圖8:0.5%濃度的不同表面活性劑對(duì)本發(fā)明脂肪酶活性的影響；
[0051]圖9:不同金屬離子對(duì)本發(fā)明脂肪酶活性的影響。
[0052]菌種保藏[0053]本發(fā)明中所使用的枝孢霉菌株WBRD3.10062425于2011年6月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.4962。
【具體實(shí)施方式】
[0054]本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，從枝孢霉菌株WBRD3.10062425中獲得了脂肪酶編碼基因序列，并采用基因工程方法使得該基因序列在合適的宿主細(xì)胞(如畢赤酵母)中重組表達(dá)，并獲得了相應(yīng)的重組脂肪酶。本發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)該重組脂肪酶的性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明該重組脂肪酶具有耐有機(jī)溶劑、寬廣的PH穩(wěn)定性、較好的溫度穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上,本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0055]發(fā)明人進(jìn)一步在patentLens、EMBL和NCBI等數(shù)據(jù)庫中展開檢索，在NCBI中檢索到與本發(fā)明SEQ ID N0:2的氨基酸序列同源性最高的序列，即編碼金龜子綠僵菌推定蛋白的氨基酸序列，但其同源性也僅為62%，而其核苷酸片段與本發(fā)明SEQ ID N0:1的核苷酸序列同源性更低，僅為6%。EMBL中的結(jié)果也來源于金龜子綠僵菌推定蛋白的氨基酸的序列，但沒有具體功能說明；在Patentlens等數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)檢索中，未發(fā)現(xiàn)與該脂肪酶有顯著同源性的相關(guān)核酸序列的報(bào)道。由此，進(jìn)一步證明了本發(fā)明的基因和脂肪酶序列的獨(dú)特性。
[0056]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”
屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0057]可對(duì)本發(fā)明提到的特征或?qū)嵤├岬降奶卣鬟M(jìn)行組合。本說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。`
[0058]在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種脂肪酶的編碼基因序列，所述序列編碼:
[0059]⑴具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的脂肪酶；或
[0060](ii)具有SEQ ID N0:2的第22-464位所示的氨基酸序列；或
[0061](iii)在(ii)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
[0062]在一些優(yōu)選例中，所述多肽與SEQ ID NO:2的脂肪酶有65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0063]在另一些優(yōu)選例中，所述基因源自保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC、保藏號(hào)為CGMCC N0.4962的枝孢霉菌株。
[0064]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述基因序列選自:
[0065](i')具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0066](Iii )具有SEQ ID NO:1的第64-1392位所示的核苷酸序列；或
[0067](iii')在嚴(yán)格條件下與(i')或(ii')限定的序列雜交、且編碼脂肪酶或具有脂肪酶活性的衍生蛋白序列。
[0068]在一些優(yōu)選例中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO:1的序列有70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0069]在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，所述序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。[0070]在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種脂肪酶，所述脂肪酶的序列選自:
[0〇71] (a)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；或
[0072](b)具有SEQ ID NO: 2的第22_464位所示的氨基酸序列；或
[0073](c) (a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有脂肪酶活性的衍生蛋白質(zhì)；或
[0074](d) (a)或(b)或(C)中蛋白質(zhì)的活性片段或其保守性變異蛋白。
[0075]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述脂肪酶的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0076]在一些優(yōu)選例中,所述(b)中包含I~10個(gè)、I~8個(gè)、I~6個(gè)、I~4個(gè)、I~2個(gè)或I個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加。
[0077]在另一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶源自保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC、保藏號(hào)為CGMCC 4962的枝孢霉菌株。
[0078]在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種包含本發(fā)明的基因序列或脂肪酶的載體。
[0079]在一些優(yōu)選例中，所述載體包括但不限于:pAZ9、pColdfK、pET?、pPic9k或pMA5。
[0080]在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種細(xì)胞，其包含本發(fā)明的基因序列、脂肪酶或載體。
[0081]在一些優(yōu)選例中，所述細(xì)胞選自:枝孢霉屬(Cladosporium)微生物，例如，惚木枝抱菌(Cladosporium araliae)、`十字花科枝抱菌(Cladosporium brassicicola)、蘇木枝抱菌(Cladosporium caesalpiniae)、嗜果枝抱菌(Cladosporium carpophilum)、綠頂頭枝抱菌(Cladosporium chlorocephalum)、高大枝抱菌(Cladosporium elatum)、雅致枝抱菌(Cladosporium elegans)、尖抱枝抱菌(Cladosporium oxysporum)、嗜菌核枝抱菌(Cladosporium sclerotiophilum)、枝抱樣枝抱霉(Cladosporium cladosporioides)、芋枝抱菌(Cladosporium colocasiae)、Cladosporium colombiae、Cladosporiumcoralloides、瓜枝抱菌(Cladosporium cucumerinum)、球抱枝抱霉(Cladosporiumsphaerospermum)、變異枝抱霉(Cladosporium variabile)、枝抱霉(Cladosporiumuredini Co la)、枝抱霉(Cladosporium cel Iare )、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii )、地窖枝抱霉(Cladosporium cellare)、夏抱生枝抱菌(Cladosporium uredinicola)等。
[0082]在另一些優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為保藏號(hào)為CGMCC 4962的枝孢霉菌株。
[0083]在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種脂肪酶的制備方法，所述方法包括:在適合本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的脂肪酶的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及，分離由所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述脂肪酶。
[0084]在一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)的過程是發(fā)酵生產(chǎn)過程。
[0085]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)的溫度為20~70°C、25~60°C、30~55 °C、35~50°C、或 40~45°C。
[0086]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)的pH為3.0~11.0,4.0~10.0,5.0~9.0或6.0~
8.0。
[0087]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)制備的脂肪酶活性受到十二烷基硫酸鈉(SDS)、CTAB中的一種或多種化合物所強(qiáng)烈抑制，或被Zn2+或Co2+中的一種或多種離子強(qiáng)烈抑制。
[0088]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)制備的脂肪酶活性受到0-2%的SDS或CTAB或二者的混合所強(qiáng)烈抑制，或被(T50mM的Zn2+或Co2+或二者的混合”所強(qiáng)烈抑制。[0089]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)制備的脂肪酶活性被Triton X-100或AE0-9中的一種或多種化合物所提高，或被Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+中一種或多種離子所提高。
[0090]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)制備的脂肪酶活性被0~2%的Triton X-100或AE0-9或二者的混合所提高，或被Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+中一種或多種且濃度在(T50mM之間的所述離子所提高。
[0091]在另一些優(yōu)選例中，本發(fā)明提供的脂肪酶可在有機(jī)溶劑環(huán)境中進(jìn)行催化反應(yīng)，優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑濃度為0~50%，優(yōu)選為5~45%，優(yōu)選為10~40%，更優(yōu)選為15~35%。
[0092]在另一些優(yōu)選例中，本發(fā)明提供的脂肪酶可在甲醇、乙醇、丙酮、DMS0、苯、甲苯、正己烷和異辛烷中的一種或多種有機(jī)溶劑存在的環(huán)境中進(jìn)行催化反應(yīng)，優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑濃度為0~50%，優(yōu)選為5~45%，優(yōu)選為10~40%，更優(yōu)選為15~35%。
[0093]在另一些優(yōu)選例中，所述方法還進(jìn)一步包括對(duì)分離的脂肪酶進(jìn)行純化、凍干、包裝和/或儲(chǔ)存的步驟。
[0094]在另一些優(yōu)選例中，所述儲(chǔ)存的溫度為-80°C~_20°C、-20°C~20°C、10~55°C、15 ~50°C或 20 ~40°C。
[0095]在另一些優(yōu)選例中，所述儲(chǔ)存的pH為3~11，優(yōu)選為4~9，更優(yōu)選為5~8。
[0096]在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種進(jìn)行脂肪酶催化反應(yīng)的方法，所述方法包括:
[0097](A)使本發(fā)明的脂 肪酶、細(xì)胞、或用本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的脂肪酶與反應(yīng)體系接觸；以及
[0098](B)在適宜所述脂肪酶進(jìn)行催化的條件下，進(jìn)行催化反應(yīng)。
[0099]在另一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶或細(xì)胞是分散的、或固定化的。
[0100]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系用于選自下組的反應(yīng):水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯類的逆向合成反應(yīng)、生物表面活性劑的合成反應(yīng)、催化旋光異構(gòu)體的拆分反應(yīng)、手性藥物的合成反應(yīng)。
[0101]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成。
[0102]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20~70°C，優(yōu)選為25~60°C，更優(yōu)選為30~55°C、最優(yōu)選為35~50°C。
[0103]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、60。。、61。。、62。。、63。。、64。。、66。。、66。。、67。。、68。。、69。。、70。。。
[0104]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的pH為3~11，優(yōu)選為4~10，更優(yōu)選為5~9。
[0105]在本方面的第七方面中，提供了本發(fā)明的基因序列、脂肪酶、載體、宿主細(xì)胞在脂肪酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0106]在另一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶或宿主細(xì)胞是分散的、或固定化的。
[0107]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系用于選自下組的反應(yīng):水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯類的逆向合成反應(yīng)、生物表面活性劑的合成反應(yīng)、催化旋光異構(gòu)體的拆分反應(yīng)、手性藥物的合成反應(yīng)。[0108]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、污水處理工業(yè)、有機(jī)溶劑污染區(qū)域治理、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成。
[0109]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0110]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、70。。。
[0111]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的pH 為 3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11。
[0112]在本發(fā)明的第八方面中，提供了一種脂肪酶制劑，其包含:
[0113]a)本發(fā)明的脂肪酶或用本發(fā)明的方法制備的脂肪酶；
[0114]b)包裝物；和
[0115]c)任選的，可接受的輔料。
[0116]在一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶以粉末、溶液、顆粒、酶片、分散體、膠體、固定化酶、膠囊、或膜反應(yīng)器形式存在。
[0117]在另一些優(yōu)選例中，所述可接受的輔料選自:緩沖劑、填料、固定化載體、溶劑或分散基質(zhì)、賦形劑。
[0118]本發(fā)明的脂肪酶編碼基因
[0119]如本文所用，術(shù)語“脂肪酶基因”、“脂肪酶編碼序列”或“編碼脂肪酶的核苷酸”可互換使用，均是指編碼本發(fā)明所述的脂肪酶或其衍生蛋白或活性片段的核苷酸序列。所述基因可為具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列、在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的基因分子，所述基因表達(dá)本發(fā)明的脂肪酶。
[0120]如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指:(I)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2 X SSC, 0.1%SDS, 600C ;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列，例如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列。
[0121]本發(fā)明的脂肪酶基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0122]應(yīng)理解，本發(fā)明的脂肪酶的編碼基因最初獲自保藏號(hào)為CGMCC N0.4962的枝孢霉菌株。與初始基因具有高度同源(如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更優(yōu)選85%以上如85%、90%、95%、甚至98%、99%以上序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。[0123]本發(fā)明的脂肪酶
[0124]如本文所用，術(shù)語“脂肪酶”、“三?；视王；饷浮?、“本發(fā)明的重組脂肪酶”可互換使用，是指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，或這些蛋白質(zhì)具有脂肪酶活性的變異或修飾形式、活性片段等。例如，所述脂肪酶可選自:(a)SEQ ID N0:2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
[0125]本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、曲霉、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等)中產(chǎn)生。
[0126]本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于):一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的脂肪酶或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有脂肪酶活性。
[0127]可采用輻射或暴露于誘變劑下來產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)來獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽?？衫镁幋a所述蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。該術(shù)語還包括脂肪酶的活性片段和活性衍生物。
[0128]該多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與脂肪酶編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及利用抗脂肪酶的抗血清獲得的脂肪酶或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含脂肪酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，該片段具有脂肪酶序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基`酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸,更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸,最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0129]載體和宿豐
[0130]本發(fā)明還涉及包含脂肪酶基因的載體以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。
[0131]通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(如Science，1984 ；224:1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的脂肪酶。一般來說有以下步驟:
[0132](I)用本發(fā)明的編碼脂肪酶的基因(或變異體)，或用含有該基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0133](2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和
[0134](3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。
[0135]本發(fā)明中，術(shù)語“載體”與“重組表達(dá)載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、動(dòng)物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
[0136]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含脂肪酶編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中可使用pAZ9、PCold?、pET?spPic9k或pMA5等載體。
[0137]此外，表達(dá)載體可任選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如綠色熒光蛋白(GFP)或四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
[0138]包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:黑曲霉、大腸桿菌、鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌等；真菌細(xì)胞如酵母，如畢赤酵母、啤酒酵母等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用黑曲霉細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。
[0139]在上面的方法中的重組脂肪酶可在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 ο
[0140]酶制劑
[0141 ] 本發(fā)明還提供了一種酶制劑，所述制劑含有有效量的本發(fā)明的脂肪酶或其編碼序列、包裝物、和任選的可接受的輔料。
[0142]如本文所用，術(shù)語“可接受的”是指適用于脂肪酶的保存和使用，不會(huì)過分影響酶促反應(yīng)及其產(chǎn)物的物質(zhì)，即`有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可產(chǎn)生所需功能或活性的、且可在酶促反應(yīng)中被接受的量。
[0143]本發(fā)明的輔料是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，包括但不限于:緩沖劑、填料、固定化載體、溶劑或分散基質(zhì)、賦形劑、助流劑。
[0144]本發(fā)明酶制劑中的脂肪酶可為粉末、溶液、顆粒、酶片、分散體、膠體、固定化酶、膠囊或膜反應(yīng)器形式。如果本發(fā)明的酶制劑是固體制劑，則可在使用前，根據(jù)需要將所需量的本發(fā)明酶制劑分散或溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚍磻?yīng)體系中。
[0145]本發(fā)明酶制劑的保存溫度通常為10~55°C、15~50°C或20~40°C，保存的pH通常為6~9.5、7~9或7.5~8.5。如果本發(fā)明的酶制劑是固體形式，則其對(duì)溫度和pH的要求通常低于相應(yīng)的液體制劑。使用本發(fā)明酶制劑的反應(yīng)的溫度可為20~60°C、25~50°C或30~40°C ;反應(yīng)體系的pH可為7.0~9.0,7.5~8.5或7.8~8.2。
[0146]本發(fā)明的酶制劑中脂肪酶或其編碼序列有效成分占組合物總重量的0.001~99.9wt% ;優(yōu)選為組合物總重量的I~95wt%，較優(yōu)選為5~90wt%，更優(yōu)選10~80wt%。余量為輔料等物質(zhì)。
[0147]應(yīng)理解，所用脂肪酶或其編碼序列的有效量可隨待施用的反應(yīng)體系、反應(yīng)效果、反應(yīng)速度等而變化。可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)具體情況來檢測、判斷和/或決定所述有效量。
[0148]應(yīng)思
[0149]本發(fā)明的脂肪酶可用于需要其進(jìn)行催化的各種反應(yīng)中，這些反應(yīng)包括但不限于:水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯類的逆向合成反應(yīng)、生物表面活性劑的合成反應(yīng)、催化旋光異構(gòu)體的拆分反應(yīng)、手性藥物的合成反應(yīng)等。
[0150]本發(fā)明的脂肪酶可用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成等，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0151]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0152]1.本發(fā)明的脂肪酶具有耐有機(jī)溶劑、寬廣的pH穩(wěn)定性、較好的溫度穩(wěn)定性等特點(diǎn)。
[0153]2.本發(fā)明的脂肪酶在精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
[0154]實(shí)施例
[0155]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男薷?、變?dòng)，這些修改和變動(dòng)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0156]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)或按照供應(yīng)商所建議的條件。DNA的測序方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。以下實(shí)施例中所有試劑都可來源于市售，例如，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基成分均可購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0157]除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0158]出發(fā)菌株來源、選育、鑒定和保藏
[0159]1、采樣
[0160]本發(fā)明所提供的菌株Cladosporium sp.WBRD3.10062425分離自中國西藏、甘肅等地區(qū)的藏族傳統(tǒng)食品一天然藏酥油。
[0161]2.篩選平板的制備
[0162]羅丹明B的平板的制作方法是:配方甲液(硫酸銨0.1%，酵母浸出汁0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1 %，KC10.5 %，七水合硫酸鎂0.05%,七水合硫酸亞鐵0.01%,瓊脂2.0%)115°C滅菌30min后加入同樣方式滅菌的配方乙液(橄欖油與2 %聚乙烯醇以1:3比例混合，1000Orpm攪拌乳化)，充分混合后按照1% (v/v)的量加入過濾除菌的0.1%的羅丹明B溶液。充分混勻后制備得到篩選平板。
[0163] 3.產(chǎn)脂肪酶絲狀真菌Cladosporium sp.WBRD3.10062425的分離篩選及鑒定
[0164]取一塊盡可能新鮮的藏酥油樣品，去除約Icm厚度表層后，切取約IOg左右的藏酥油樣品置于IOOmL含1.0%Tween 80的無菌水中。振蕩30min后按照傳統(tǒng)的稀釋涂布的方法稀釋成不同的稀釋度，并將各個(gè)稀釋度的樣品涂布于羅丹明B平板上置于28°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0165]每24h在紫外燈下觀察羅丹明B平板上是否有熒光圈出現(xiàn)，產(chǎn)脂肪酶的絲狀真菌的生長速度較慢往往需要96h后才能觀察到。挑取熒光圈較大的微生物進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋涂布分離以獲得純種菌株，而后再次用羅丹明B平板對(duì)這些純種菌株進(jìn)行脂肪酶檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一株熒光圈十分顯著的菌株標(biāo)記為WBRD3.10062425。
[0166]該菌的生長狀態(tài)和形態(tài)學(xué)特征如下:
[0167]該菌在察氏培養(yǎng)基上25°C溫度下生長速度極慢，培養(yǎng)7天時(shí)菌落直徑為10mm，菌絲呈絨狀、暗黃綠色、質(zhì)地致密、背面呈黑綠色；該菌在麥芽汁培養(yǎng)基上25°C溫度下生長7天時(shí)達(dá)菌落直徑可達(dá)30mm，菌絲厚絨狀，灰色、質(zhì)地致密、背面墨黑色；在查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上25°C溫度下生長7天時(shí)的菌落直徑約20mm，菌絲絨狀，形成同心環(huán)紋，中間橄欖色，外圍暗黃綠色，質(zhì)地致密，背面黃綠至褐色；該菌在PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基上25°C溫度下培養(yǎng)7天時(shí)的菌落直徑約15mm，菌絲絨狀或絮狀，黃綠色，質(zhì)地致密，背面綠黑色邊緣白色。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗單生、叢生、直立或曲屈狀，偶有分枝，具隔膜；枝孢0-3個(gè)，隔膜，平；分生孢子橢圓形近球形，孢臍明顯，褐色，頂生。
[0168]根據(jù)以上形態(tài)特征以及顯微形態(tài)特征觀察結(jié)果，參考《真菌鑒定手冊(cè)》(魏景超遺著.真菌鑒定手冊(cè).上海科學(xué)技術(shù)出版社.1979年9月第一版)、《真菌的形態(tài)和分類》(戴芳瀾遺著.真菌的形態(tài)和分類.科學(xué)出版社.1987年3月第一版)以及《中國真菌志》(張中義主編.中國真菌志第十四卷枝孢屬黑星孢屬梨孢屬.科學(xué)出版社.2003年4月第一版)等判斷其與枝孢霉(Cladosporium)屬菌最相似。 [0169]根據(jù)有關(guān)微生物鑒定方法，對(duì)該菌的18S rDNA測序結(jié)果(如SEQ ID NO: 14)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該菌與 Cladosporium cladosporioidesCGENBANK 號(hào) AY251093.2), Cladosporiumbruhnei (GENBANK 號(hào) AY251096.2), Cladosporium uredinicola (GENBANK 號(hào) AY251097.2)以及 Cladosporium cellare (GENBANK 號(hào) NG016540.1)具最高同源性超過 99%。
[0170]委托廣東省微生物菌種保藏中心(即GMCC，中國廣州市先烈中路100號(hào))對(duì)該菌種進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為枝孢霉，拉丁學(xué)名為:Cladosporium sp.。
[0171]將該枝孢霉菌株WBRD3.10062425于2011年6月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.4962。
[0172]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，脂肪酶活力的檢測采用pNPP法，具體過程如下:
[0173]本發(fā)明采用對(duì)硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)法來測定脂肪酶的活力大小，該方法以對(duì)硝基苯棕櫚酸酯為反應(yīng)底物，通過脂肪酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(p-NP)，該產(chǎn)物在405-410nm波長下具有強(qiáng)烈吸收。酶活力單位定義為:1個(gè)單位即指在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘催化釋放Iymol的p-NP所需的酶量。p-NPP法測定脂肪酶活力的更詳細(xì)描述可參見，，Mahadik N.D., Puntambekar U.S., Bastawde K.B., et al.Production of acidiclipase by Aspergillus niger in solid state fermentation.Process Biochem.2002，38:715 - 721.”該方法是國內(nèi)外測定脂肪酶活力的常用方法，操作簡便，反應(yīng)快且靈敏度聞，是一種精確而聞效的活力測定方法。
[0174]在本發(fā)明中，溶液置換可以采用凝膠層析、透析或超濾等方式進(jìn)行，優(yōu)選超濾進(jìn)行溶液置換。超濾過程中的超濾膜優(yōu)選截留分子量為5-10KDa的超濾膜，超濾膜的材質(zhì)優(yōu)選聚醚砜、再生纖維素等材質(zhì)。
[0175]實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基如下:
[0176]種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、玉米粉0.5%、NaH2PO4.12H20 0.2%、MgSO4.12H20 0.1%、CaCl20.05%, pH 6.5 ；
[0177]發(fā)酵培養(yǎng)基組成是:蔗糖2%、蛋白胨3%、玉米粉0.5%、酵母浸出粉1%、吐溫-800.5%、滑石粉 0.1%,NaNO30.3%,KH2PO40.7%,Na2HPO4.12Η20 0.25%、MgS04.12Η20 0.1%、CaCl20.05%、橄欖油 0.5%, pH 6.5 ；
[0178]YPD培養(yǎng)基:lwt%酵母提取物，2wt%蛋白胨，lwt%葡萄糖；
[0179]LB培養(yǎng)基:lwt%胰蛋白胨，0.5wt%酵母提取物，lwt%NaCl ；
[0180]MD平板培養(yǎng)基:1.34wt%酵母氮源基礎(chǔ)(YNB)，4X 10_5wt%生物素，2wt%葡萄糖，1.5wt%瓊脂；
[0181]BMMY-Rho B平板培養(yǎng)基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀，pH7.0，
1.34%YNB，4X 10、生物素，0.5%甲醇，0.001%羅丹明B, 4%聚乙烯醇，2%橄欖油；
[0182]BMGY液體培養(yǎng)基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀，pH7.0, 1.34%YNB，4X10_5%生物素，1%甘油；
[0183]BMMY 培養(yǎng)基:1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，IOOmM 磷酸鉀，pH7.0, 1.34%YNB，4X 10、生物素，0.5%甲醇。
[0184]實(shí)施例1.脂肪酶編碼基因的克隆
[0185]通過分子生物學(xué)方法從菌株枝孢霉菌株WBRD3.10062425中克隆出脂肪酶編碼基因，具體步驟如下:
[0186]1.1野生脂肪酶的生產(chǎn)
`[0187]加入IOmL左右的無菌生理鹽水至一支新鮮培養(yǎng)好的枝孢霉WBRD3.10062425斜面以制備孢子懸浮液，而后取ImL的懸浮液接種至裝液量為30mL的250mL容積的種子培養(yǎng)基中于 28 °C、200rpm 培養(yǎng) 24h。
[0188]種子培養(yǎng)好后，取3mL的種子培養(yǎng)液接種至250mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，200rpm,發(fā)酵67h左右，檢測胞外脂肪酶活力。結(jié)果顯示，發(fā)酵清液中的脂肪酶活力達(dá)到L03units/
mLo
[0189]1.2野生脂肪酶的分離純化和脂肪酶氨基酸N端序列的獲得
[0190]收集發(fā)酵液，用雙層濾紙進(jìn)行過濾，以除去菌絲體，獲得發(fā)酵上清。將發(fā)酵上清液用0.22 μ m的微孔濾膜過濾，再使用IOkDa的超濾膜(Omega TM10K，美國PALL公司)進(jìn)行超濾，得到超濾濃縮液。
[0191]在冰浴狀態(tài)下緩慢加入硫酸銨粉末至超濾濃縮液中直至飽和度達(dá)到30%，冰浴靜置2h后，15000rpm離心25min (高速冷凍離心機(jī)CR22GIII，日本日立公司)收集離心上清液。再次緩慢加入硫酸銨粉末直至飽和度達(dá)到60%，此鹽析步驟一直在冰浴下完成。鹽析樣品4°C靜置過夜后，離心收集鹽析沉淀。
[0192]室溫下用約20mL的起始緩沖液(50mM的含0.4M(NH4)2SO4的口取.5的Tris.HCl緩沖液)溶解60%飽和度的鹽析沉淀樣品，經(jīng)過0.22 μ m的微孔濾膜過濾后粗酶液用HiTrapphenyl HP 5mL (GE Healthcare)苯基疏水層析柱進(jìn)行純化,具體過程如下:使用100%的洗脫緩沖液(50mM Tris.HCl緩沖液，pH7.5)進(jìn)行洗脫至基線穩(wěn)定，用蒸餾水洗脫至基線穩(wěn)定，用70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集活性組分。
[0193]經(jīng)過疏水層析純化的脂肪酶樣品再經(jīng)緩沖液(50mM Tris.HCl緩沖液，pH7.5)置換后，用Mono QTM 4.6/100PE(GE Healthcare)陰離子層析柱進(jìn)行純化并收集活性組分。離子交換層析過程所使用的緩沖液有兩種，一種是濃度為20mM，pH值為7.5的Tris.HCl起始緩沖液，另一種為含有2M NaCl的濃度20mM，pH值為7.5的Tris.HCl洗脫緩沖液。洗脫過程的流速為lmL/min，采用線性梯度洗脫的方式進(jìn)行洗脫。
[0194]以上過程均在室溫下完成，層析過程使用的設(shè)備為GE公司的AKl \ExplorerlOO。層析純化后的樣品經(jīng)過緩沖液(50mM Tris.HCl緩沖液，pH7.5)置換后保存于濃度為20mM，pH值為7.5的Tris.HCl緩沖液中，4°C儲(chǔ)存。
[0195]將上述經(jīng)過層析過程純化的野生多肽，進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色。從膠上切取本發(fā)明多肽對(duì)應(yīng)條帶，通過N端序列分析法，得到的一段肽段的氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0196]N端序列分析法是目前本領(lǐng)域中進(jìn)行蛋白質(zhì)分析和鑒定的一種較為常規(guī)的方法，具體可參見 Edman、Hewick 等的方法(Edman P, Begg G.Eur J Biochem, 1967, 1:80-91.Hewick RM, Hunkapiller MW, Hood LE, Dreyer WJ.J Biol Chem, 1981，256:7990-7997)。
[0197]1.3兼并PCR獲取目標(biāo)多肽的下游編碼核苷酸序列
[0198]根據(jù)QiagenRNeasy Plant Mini Kit說明書操作，提取枝孢霉WBRD3.10062425總RNA。根據(jù) Promega Reverse Transcription Kit 說明書操作，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。而后根據(jù)N端序列分析法獲取的野生多肽的部分氨基酸序列DPFYQP設(shè)計(jì)的兼并引物(SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4)。
[0199]簡并PCR 體系(引物對(duì) BRC (SEQ ID NO: 3) /oligodT (SEQ ID NO:4)作 PCR):ExTaq 0.5ul, IOXEx PCR buffer 5ul, dNTP mixture 8ul, primer Ilul, primer 21ul, cDNAlul，水 33.5ul。反應(yīng)條件:95°C 2min，5 個(gè)循環(huán)(95°C 30s, 40°C lmin,72°C lmin)，30 個(gè)循環(huán)(95°C 30s，48°C lmin，72°C Imin),72°C 10min，4°C保溫。所得陽性 PCR 產(chǎn)物膠回收后，直
接送至上海美季生物公司測序。
[0200]經(jīng)測序，獲取目標(biāo)多肽的核苷酸序列片段1500bp。
[0201]1.45’ RACE獲取目標(biāo)多肽的上游序列
[0202]根據(jù)Invitrogen Firstchoice RLM-RACE Kit 說明書實(shí)時(shí)操作。
[0203]第一步PCR:
[0204]PCR 體系:Ex Taq 0.5ul, IOXEx PCR buffer 5ul, dNTP mixture 8ul, primerRACERl (SEQ ID NO:7) lul,primer GSPl (SEQ ID NO: 5) lul, cDNA lul,水 33.5ul。PCR 的反應(yīng)條件:94°C 3min，35 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min 30s), 72°C 7min，4°C保溫。
[0205]第二步PCR:
[0206]PCR 體系:Ex Taq 0.5ul, IOXEx PCR buffer 5ul, dNTP mixture 8ul, primerRACER2 (SEQ ID NO:8) lul, primer GSP2 (SEQ ID N0:6) lul，第一步 PCR 反應(yīng)液 lul，水33.5ul。PCR反應(yīng)條件同第一步。
[0207]第二步PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過OmegaGel Extraction Kit 回收,連接pMD18_T simplevector，轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過驗(yàn)證的陽性克隆子送至上海美季生物公司測序。
[0208]轉(zhuǎn)化方法如下:感受態(tài)細(xì)胞置于冰中融化，將IOOul的感受態(tài)細(xì)胞移至滅菌處理的試管內(nèi)，加入連接產(chǎn)物10ul，冰中放置30分鐘，42°C放置90秒，冰中放置2_3分鐘，加入LB培養(yǎng)基，使終體積為lml，37°C振蕩培養(yǎng)Ih (150rpm)，將菌液離心，上清去除700ul，剩余液體重新混勻，涂布3塊含100ug/mg氨節(jié)青霉素的LB平板,每塊平板IOOul, 37°C, 200rpm過夜培養(yǎng)。
[0209]將5’ RACE測序結(jié)果與已經(jīng)獲取的核苷酸片段進(jìn)行拼接，共獲取枝孢霉目標(biāo)多肽核苷酸完整閱讀框1395bp，見SEQ ID NO: 1，并將該基因命名為lipcs。該基因編碼的氨基酸序列見SEQ ID NO:2。
[0210]實(shí)施例2.重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0211]2.1枝孢霉目標(biāo)脂肪酶基因(mlics)的克隆
[0212]枝孢霉WBRD3.10062425來源脂肪酶在氨基酸水平上與Malassezia furfur來源的脂肪酶(G1:73765555)的最高一致性為39%。且與其他脂肪酶一樣，活性中心的保守序列為“GYSGG”。其中，SEQ ID N0:2的氨基酸序列中的第1_21位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域，22-464位氨基酸為成熟肽區(qū)域，成熟肽分子量為46796Da。將編碼成熟肽的基因命名為mlipcs。
[0213]用TakaRa Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction kit Ver.4.0 試劑盒(寶生物工程(大連)有 限公司)提取枝孢霉WBRD3.10062425的基因組，然后以其為模板，以 primer Iipcs-U(SEQ ID NO:9)和 primer Iipcs-D(SEQ ID NO: 10)為上下游引物，進(jìn)行PCR。其中，PCR反應(yīng)體系:Prime star Taq HS (DRO10A,寶生物工程(大連)有限公司)
0.5ul,5XReaction Buffer IOul, dNTP 4ul,primer Iipcs-U Iul, primer Iipcs-D lul,genome 0.3uljjC34ul。反應(yīng)條件:94°C 3min，35 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 15s,72°C 2min)，72。。，IOmin。
[0214]2.2基因和載體的酶切及酶切產(chǎn)物的精制
[0215]將上述PCR產(chǎn)物膠回收，同時(shí)將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9k (購自Invitrogen)用EcoR I和Not I分別雙酶切，酶切體系:20.0μ I膠回收產(chǎn)物(或PIC9k質(zhì)粒)，11.0μ IddH20, 5.0ul BSA,5.0ul Triton X-100,5.0μ I 10ΧΗ Buffer, 2.0 μ I EcoR I 和 2.0 μ INot I，37°C條件下過夜酶切。按廠商提供的方法，將酶切產(chǎn)物用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自O(shè)mega公司)純化。
[0216]2.3連接載體
[0217]將mlipcs基因(經(jīng)EcoR I和Not I酶切)與載體DNA片段(經(jīng)EcoR I和Not I酶切)于22°C連接lh，獲得重組質(zhì)粒；其中，連接反應(yīng)體系如下:4.25 μ I DNA片段，4.25 μ I載體，Iul 10X ligation buffer, 0.5ul Fermentas ligase。
[0218]2.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α
[0219]按照實(shí)施例1.4的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化菌液涂布含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板，370C，過夜培養(yǎng)。挑取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化子在5ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照Axygen Plasmid Extraction Kit說明書抽提質(zhì)粒；將轉(zhuǎn)化子送至上海美季生物公司測序，測序結(jié)果顯示，在上述轉(zhuǎn)化子中成功插入目的基因，將其命名為pPIC9k-lipcs，其表達(dá)載體如圖1。
[0220]實(shí)施例3重組工程菌株的構(gòu)建
[0221]3.1畢赤酵母感受態(tài)的制備
[0222]挑取畢赤酵母GS115單菌落，接種至含有30ml YI3D培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C、200rpm培養(yǎng)過夜。取500 μ I的培養(yǎng)物接種至含有30ml新鮮YPD培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)過夜，至0D_達(dá)到1-1.5。將培養(yǎng)液于4°C,1500g離心5min，用500ml冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸。4°C，1500g離心5min，用250ml冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸。4°C，1500g離心5min，用20ml冰預(yù)冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。4°C，1500g離心5min離心，用Iml冰預(yù)冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸(每支感受態(tài)包含200D細(xì)胞)，分裝至2ml離心管待用(IOOul/支)。
[0223]3.2畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化
[0224]將重組質(zhì)粒用Bgl II限制性內(nèi)切酶線性化(線性化條件:25.0μ I質(zhì)粒，18.0 μ LddH2O, 5.0 μ I IOXH Buffer, 2.0 μ I Bgl II，37°C酶切 6h)，將酶切片段進(jìn)行膠回收。取酶切產(chǎn)物5 μ I分別與100 μ I新鮮畢赤酵母感受態(tài)菌體GS115混勻，移取至冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min。以1.5kV、25yF、400Q條件電擊I次，立即加入1ml冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，并移取菌液涂布于MD平板上。于28°C培養(yǎng)48-55h，至單菌落出現(xiàn)。
[0225]3.3重組畢赤酵母工程菌的鑒定
[0226]從MD平板上挑取單菌落至BMMY-Rho B轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)24h挑取在紫外光下(254nm)呈現(xiàn)熒光圈的數(shù)個(gè)GS115單菌落(優(yōu)先挑選圈大的菌落)，分別接種于30ml YH)液體培養(yǎng)基(37°C，200rpm)，培養(yǎng)18h后，取Iml菌液(以GS115空菌落做空菌對(duì)照)，5000rmp離心5min,去上清,加Iml無菌水重懸。然后放在沸水處理IOmin,接著放入-80°C冰箱處理15min，最后再用沸水處理lOmin。將抽提的基因組樣品再用乙醇脫氫酶引物(AOX-U(SEQ ID NO: 11) AOX-D (SEQ ID NO: 12))按以下方法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:rTaq 0.25ul, IOXPCR buffer 2ul, dNTP mixture2.5ul, primer AOX-U 0.5ul,primer AOX-D 0.5ul,菌液 0.5ul，水 13.75ul。反應(yīng)條件:94°C 5min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s,53°C 30s, 72°C 2min)，72°C 10min，4°C保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，將有含有正確擴(kuò)增條帶出現(xiàn)的單克隆保存?zhèn)溆?。將重組菌命名為GS115 (pPIC9k-mlipcS)。
[0227]實(shí)施例4.脂肪 酶的重組表達(dá)
[0228]4.1本發(fā)明脂肪酶的重組表達(dá)
[0229]將驗(yàn)證正確的單克隆接種至30mlYPD液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)GS115空宿主作為對(duì)照)。28°C，200rpm培養(yǎng)30_40h。取少量菌液接種至30ml BMGY液體培養(yǎng)基(28°C、200rpm搖至OD600 達(dá)到 2-6。
[0230]1500-3000g、4°C離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用30ml BMMY培養(yǎng)基等體積重懸細(xì)胞，28°C、200rpm條件下培養(yǎng)，使用0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每24h，加甲醇至終濃度為
0.5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。
[0231]分別在他、2411、4811、7211、9611、12011、14411、16811，取Iml 培養(yǎng)液，用于生物量測定、
目標(biāo)脂肪酶的蛋白表達(dá)檢測及酶活分析，以確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。
[0232]4.2表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳鑒定
[0233]取Iml誘導(dǎo)72h后的菌液，10000r/min離心lmin，收集發(fā)酵上清。加入一定量的5 X上樣緩沖液，沸水煮5min。取10 μ I對(duì)上清蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以鑒定mlipcs在畢赤酵母中的表達(dá)情況，在約47KDa處出現(xiàn)明顯的目標(biāo)蛋白條帶。
[0234]實(shí)施例5.重組脂肪酶的分離純化
[0235]將收獲的畢赤酵母發(fā)酵液采用1000Orpm離心15min (高速冷凍離心機(jī)CR22GIII，日本日立公司)，收集離心上清液。而后緩慢加入硫酸銨粉末直至飽和度達(dá)到60%，此鹽析步驟一直在冰浴下完成。鹽析樣品4°C靜置過夜后，離心收集鹽析沉淀。
[0236]室溫下用約40mL的起始緩沖液(50mM濃度含0.4M(NH4)2S04的ρΗ7.5的Tris.HCl緩沖液)溶解60%飽和度的鹽析沉淀樣品，經(jīng)過0.22 μ m的微孔濾膜過濾后粗酶液用HiTrapphenyl HP (購自GE Healthcare)苯基疏水層析柱進(jìn)行純化,收集活性組分。疏水層析過程的洗脫液有:洗脫緩沖液(50mM Tris -HCl緩沖液，pH7.5)、蒸餾水和70%的乙醇水溶液。層析過程流速為3mL/min。洗脫過程是先用100%的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫至基線穩(wěn)定，而后再用蒸餾水洗脫至基線穩(wěn)定，最后用70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。
[0237]經(jīng)過疏水層析純化的脂肪酶樣品再經(jīng)置換緩沖液(50mM Tris.HCl緩沖液，PH7.5)置換后，用Mono QTM 4.6/100PE (GE Healthcare)陰離子層析柱進(jìn)行純化并收集活性組分；其中，以濃度為20mM，pH值為7.5的Tris -HCl作為起始緩沖液，以含有2MNaCl的濃度20mM，pH值為7.5的Tris.HCl作為洗脫緩沖液。
[0238]層析過程使用的設(shè)備為GE公司的AKTA Explorer 100。層析純化后的樣品經(jīng)過緩沖液(50mM Tris.HCl緩沖液，pH7.5)置換后保存于濃度為20mM，pH值為7.5的Tris.HCl緩沖液中，4°C儲(chǔ)存。
[0239]實(shí)施例6.重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
[0240]6.1脂肪酶活性的最適作用溫度
[0241]在0_70°C下按照pNPP法測定脂肪酶活力，以測定酶活最高時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活(％)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，本發(fā)明脂肪酶的活力隨著溫度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中40°C時(shí)的酶活最高，為其最適作用溫度，15°C可保持脂肪酶活力仍能達(dá)到55%，60°C時(shí)仍然有超過75%的脂肪酶活力。由此可見，本發(fā)明脂肪酶表現(xiàn)出作用溫度范圍廣的性質(zhì)，此特性對(duì)于進(jìn)一步拓寬該脂肪酶的實(shí)際應(yīng)用非常有利。
[0242]6.2脂肪酶活性的溫度穩(wěn)定性
[0243]將實(shí)施例5中制備所得的脂肪酶溶液(79units/ml)分別在4°C、25°C、35°C、40°C、45°C、60°C、7(TC保溫1.5h，并從Omin開始，每隔30min取樣I次，于40°C、pH8.0條件下按照PNPP方法檢測脂肪酶活力。以0°C、0m`in測定的脂肪酶活力為100%，計(jì)算其他溫度和其他時(shí)間酶的相對(duì)活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，本發(fā)明脂肪酶在0-45°C范圍內(nèi)溫浴
1.5h，脂肪酶活力保持不變，70°C溫浴1.5h后，脂肪酶活力仍能保持50%以上。
[0244]6.3最適作用pH
[0245]將pNPP法測定酶活的緩沖體系分別調(diào)整為0.1M濃度的pH (3.0-11.0)—系列不同PH值的緩沖液，而后于40°C下按pNPP法分別測定不同pH緩沖體系中的實(shí)施例5制備的脂肪酶的活力大小。以最高時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算其它pH下酶的相對(duì)活力(％)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，本發(fā)明脂肪酶在pH8.0時(shí)的脂肪酶活力最高，但是在pH3.0和ρΗΙΟ.0時(shí)仍具有近20%的脂肪酶活力。由此推斷，本發(fā)明所述脂肪酶為弱堿性脂肪酶，其可作用pH范圍非常大，即在PH3.0-10.0范圍內(nèi)皆具有20%以上的脂肪酶活力。
[0246]6.4本發(fā)明脂肪酶的pH穩(wěn)定性
[0247]取實(shí)施例5制備的脂肪酶溶液(79units/ml)，以1:1 (v/v)分別置于0.4M的不同pH (3.0-11.0)的緩沖體系中，于4-8°C保溫42h，再于35°C、pH8.5下按pNPP法分別測定脂肪酶的活力。以在ρΗ8.0緩沖液中所測得的酶活力為100%，計(jì)算其它pH下的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，本發(fā)明所述脂肪酶的脂肪酶活力在較寬pH范圍內(nèi)(3.0-11.0)保持穩(wěn)定，在PH3.0時(shí)其的脂肪酶活力竟得到增強(qiáng)。
[0248]6.5甲醇中的穩(wěn)定性[0249]將甲醇與本發(fā)明實(shí)施例5制備的脂肪酶溶液(79units/ml)按照甲醇含量從0-95%(v/v)的配比進(jìn)行配制，而后將含甲醇的脂肪酶溶液置于4-8°C條件下放置22h后用pNPP法進(jìn)行脂肪酶活力的檢測，以不添加甲醇的樣品做對(duì)照，結(jié)果見圖6。由圖6可見，本發(fā)明脂肪酶具有較強(qiáng)的甲醇耐受性，其脂肪酶活性即使在50%的甲醇中仍然能夠保持超過70%的活性。
[0250]6.6部分有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性
[0251]準(zhǔn)備有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、丙酮、和DMSO ;水不溶有機(jī)溶劑苯、甲苯、正己烷和異辛烷。配制含25% (v/v)有機(jī)溶劑的脂肪酶溶液(300uL實(shí)施例5制備的酶液(79units/ml)+100此有機(jī)溶劑)400此，4-81:、50印111緩慢振蕩18h。孵育結(jié)束后，取同等酶量按照pNPP標(biāo)準(zhǔn)方法檢測脂肪酶的活力，以不加有機(jī)溶劑的脂肪酶溶液作為對(duì)照，計(jì)算剩余相對(duì)活力，結(jié)果見圖7。由圖7可見，本發(fā)明脂肪酶的活性幾乎不受眾多有機(jī)溶劑的影響，因此，是一種具有耐有機(jī)溶劑脂肪酶。
[0252]6.7表面活性劑對(duì)本發(fā)明脂肪酶活性的影響
[0253]在檢測本發(fā)明脂肪酶活性的pNPP反應(yīng)體系中分別添加0.5%的陽離子表面活性CTAB、陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑Tween 80、AE0_9和Triton X-100，以不添加表面活性劑的樣品做對(duì)照，計(jì)算剩余相對(duì)活力，結(jié)果見圖8。本發(fā)明脂肪酶的脂肪酶活性可以被0.5%的非離子表面活性劑Triton X-100和AE0-9增強(qiáng)，而被0.5%的SDS、CTAB等強(qiáng)烈抑制。
[0254]6.8金屬離子對(duì)脂肪酶活性的影響
[0255]配制CaCl2、MgSO4, ZnSO4, CuSO4, MnCl2, NiSO4, CoCl2 等無機(jī)鹽貯存液。按照 pNPP方法，首先配制反應(yīng)混合液 ，向每個(gè)反應(yīng)管中分裝400uL混合液，并添加無機(jī)鹽貯存液至無機(jī)鹽的終濃度為5mmol/l，再按照pNPP方法測定活性。以添加空白20mM Tris (pH7.9)為對(duì)照，計(jì)算剩余相對(duì)活力，結(jié)果見圖9。由圖9可見，Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+和Ni2+等具有增強(qiáng)本發(fā)明脂肪酶的活力的作用，相反Zn2+和Co2+等則強(qiáng)烈抑制了該脂肪酶的活力。
[0256]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改或?qū)Ρ疚乃枋龅奶卣鬟M(jìn)行組合，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種編碼脂肪酶的基因序列，所述序列編碼: (i)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；或 (?)具有SEQ ID NO:2的第22-464位所示的氨基酸序列；或 (iii)在(i)或(ii)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于，所述基因序列選自: (i')具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或 (ii')具有SEQ ID NO:1的第64-1392位所示的核苷酸序列；或(iii,)在嚴(yán)格條件下與(i')或(ii,)限定的序列雜交、且編碼脂肪酶或具有脂肪酶活性的衍生蛋白的序列。
3.一種脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列選自: (a)、具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)、具有SEQID NO: 2中第22-464位所示的氨基酸序列；或 (c)、(a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸、且具有脂肪酶活性的衍生蛋白質(zhì)；或 (d)、(a)、(b)或(c)中蛋白質(zhì)的活性片段或其保守性變異蛋白。
4.一種包含權(quán)利要求1~2中任一項(xiàng)所述的基因序列或權(quán)利要求3中所述的脂肪酶的編碼基因序列的載體。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在`于，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求1~2中任一項(xiàng)所述的基因序列、權(quán)利要求3中的脂肪酶的編碼基因序列或權(quán)利要求4中所述的載體。
6.一種生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括:在適合權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生如權(quán)利要求3所述的脂肪酶的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；以及，分離由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的所述脂肪酶。
7.一種進(jìn)行脂肪酶催化反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括: (A)使權(quán)利要求3中所述的脂肪酶、權(quán)利要求5中所述的宿主細(xì)胞、或用權(quán)利要求6所述方法生產(chǎn)脂肪酶與反應(yīng)體系接觸；以及 (B)在適宜所述脂肪酶進(jìn)行催化的條件下，進(jìn)行催化反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化反應(yīng)在有機(jī)溶劑環(huán)境中進(jìn)行，優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑濃度為0~50%，優(yōu)選為5~45%，優(yōu)選為10~40%，更優(yōu)選為15~35%。
9.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、苯、甲苯、正己烷和異辛烷中的一種或多種。
10.一種增強(qiáng)脂肪酶催化活性的方法，其特征在于，所述方法包括:采用權(quán)利要求3所述的脂肪酶或權(quán)利要求6生產(chǎn)的脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，添加Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+、Ni2+、Triton X-100或AE0-9中的一種或多種。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+的添加濃度為0~50禮，所述的Triton X-100或AE0-9的濃度為0~2%。
12.—種抑制脂肪酶催化活性的方法，其特征在于，所述方法包括:采用權(quán)利要求3所述的脂肪酶或權(quán)利要求6生產(chǎn)的脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，添加Zn2+、Co2+、SDS或CTAB中的一種或多種。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的Zn2+、Co2+的添加濃度為(T50mM，所述的的SDS或CTAB的濃度為0-2%。
14.權(quán)利要求1或2所述的基因序列、權(quán)利要求3中所述的脂肪酶、權(quán)利要求4中所述的載體、權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞在脂肪酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
15.—種脂肪酶制劑，其特征在于，所述制劑包含: a)權(quán)利要求3中所述的脂肪酶或用權(quán)利要求6所述的方法制備的脂肪酶； b)包裝物；和 c)任選的，可接受的輔料。
16.權(quán)利要求3中所述的脂肪酶或用權(quán)利要求6所述的方法制備的脂肪酶在精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料工業(yè)、油脂加工、生物柴油、酯鍵化合物的合成或手性藥 物合成領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103865941SQ201210532087
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】徐正軍, 陳苗苗, 周美鳳, 許駿 申請(qǐng)人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司