一種高山被孢霉ccfm442菌株及其用圖
【專利說明】-種高山被抱霉CCFM442菌株及其用途 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物飼料技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種高山被抱霉CCFM442 菌株，還設(shè)及所述高山被抱霉CCFM442菌株的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 多不飽和脂肪酸（PUFAs)可分為0-6和0-3等系列。0-6系列PUFAs主要有亞 油酸（LA)、丫-亞麻酸（GLA)、花生四締酸（AA)等。AA是人體前列腺素合成的重要前體物 質(zhì)，它具有增加血管彈性和提高免疫力等生理功能，是重要的奶粉營養(yǎng)補(bǔ)充劑?！?3系列 PUFAs主要有a-亞麻酸（ALA)、二十碳五締酸巧PA)、二十二碳五締酸值PA) W及二十二碳 六締酸值HA)。EPA能降低血液膽固醇水平W及動脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。DHA在提高嬰幼兒 智力等方面具有重要作用。W冊和FA0提出膳食中0-6PUFAS和0-3PUFAS的比例下 簡稱0-6/W-3比）的最適值為巧-10) ;1，在我國該比例嚴(yán)重失衡，達(dá)（10-30) ;1。流行病 學(xué)資料顯示，飲食中《-6/0-3比過高與某些疾病的高發(fā)密切相關(guān)，如糖尿病、冠屯、病、乳 腺癌等。因此，提高飲食中W-3PUFAS比例并維持0-6/0-3比在適宜范圍內(nèi)具有重要意 義。
[0003] ?-3系列PUFAs多來自于動物肝臟和魚油等材料，因環(huán)境污染等因素，其生產(chǎn)受 到限制。高山被抱霉（Modierella alpina, M. alpina)是目前產(chǎn)PUFAs真菌中唯一經(jīng)過正 式安全性評估的菌種，其發(fā)酵生產(chǎn)W-3PUFAS已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)可行。利用Ealpina菌體制作 菌飼料飼喂蛋雞，可使雞蛋中的《-3PUFAs含量增加，該有助于提高飲食中0-3PUFAS的比 例。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] [要解決的技術(shù)問題]
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高山被抱霉CCFM442菌株。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述高山被抱霉CCFM442菌株的用途。
[0007] [技術(shù)方案]
[000引本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0009] 本發(fā)明設(shè)及一種高山被抱霉Mo;rtierella alpina CCFM442,該菌株已于2014年 12月25日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，其保藏號為CGMCC No 10295。
[0010] 高山被抱霉菌株CCFM442為對高山被抱霉野生型菌株進(jìn)行遺傳修飾后獲得 的工程菌株。具體遺傳修飾方法W及所得菌株的生物學(xué)性質(zhì)參見中國專利申請CN 201410087487. 1的記載。所得的高山被抱霉具體培養(yǎng)條件如下；它先在溫度28°C與轉(zhuǎn)速 為2(K)r/min的條件下培養(yǎng)2天，然后在溫度12°C與轉(zhuǎn)速2(K)r/min的條件下培養(yǎng)8天，高 山被抱霉菌株CCFM442積累脂肪的規(guī)律較野生型菌株發(fā)生明顯變化，其中EPA占總脂肪酸 的比例明顯增加，約為野生型菌株的7倍。正是由于該種性質(zhì)的改變，為高山被抱霉菌株 CCFM442成為相對高產(chǎn)0-3PUFAS的工業(yè)菌株奠定了基礎(chǔ)。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)及所述的高山被抱霉CCFM442菌株在生產(chǎn)菌體飼料添加劑中的用途。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，生產(chǎn)本發(fā)明菌體飼料添加劑的步驟如下：
[001引 A、斜面培養(yǎng)
[0014] 將冷凍保存的高山被抱霉CCFM442菌株挑取一環(huán)接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，然后 在溫度25°C的條件下恒溫培養(yǎng)14天，得到所述菌株活化培養(yǎng)物。
[0015] 本發(fā)明使用的PDA斜面培養(yǎng)基是根據(jù)其常規(guī)配方配制的。PDA斜面培養(yǎng)基成分如 下；200g馬鈴馨、20g葡萄糖、15g瓊脂與1L自來水，使用氨氧化鋼及氯化氨水溶液將其抑 調(diào)節(jié)為6. 0-6. 2。
[0016] 在該個(gè)步驟中，斜面培養(yǎng)所使用的設(shè)備是上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司銷售的隔水 式恒溫培養(yǎng)箱（型號；GRP-9080)。
[0017] B、種子培養(yǎng)
[0018] 將步驟A得到的活化培養(yǎng)物挑取一環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，在溫度25°C與20化pm 的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3天，再稱得濕菌體重，將濕菌體與無菌水按照濕菌體與無菌水質(zhì) 量比1 ;4進(jìn)行混合，接著用分散機(jī)對該混合體系進(jìn)行分散lOmin W制備菌懸液，再按照每升 所述菌懸液為lOmL的接種量接種于所述種子培養(yǎng)基中，在溫度25°C與轉(zhuǎn)速20化pm的條件 下恒溫振蕩培養(yǎng)36h，得到高山被抱霉CCFM442種子液。
[0019] 本發(fā)明使用的種子培養(yǎng)基是根據(jù)下述配方配制的；20g/L葡萄糖、lOg/L硝酸鐘、 3g/L磯酸二氨鐘、5g/L酵母提取物與0. 25g/L硫酸儀，自然抑。
[0020] 在該個(gè)種子培養(yǎng)步驟中，使用的培養(yǎng)設(shè)備是上海知楚儀器有限公司銷售的振蕩培 養(yǎng)箱（型號；ZQZY-70B)。
[0021] 本發(fā)明使用的分散機(jī)是艾卡儀器設(shè)備有限公司銷售的分散機(jī)（型號；T10B)。
[0022] C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0023] 按照W發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)1% -5%接種量，將步驟B得到的高山被抱霉CCFM442 種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，首先在溫度25°C的條件下培養(yǎng)2天，接著在溫度6°C的條件下 培養(yǎng)5天，得到含有高山被抱霉CCFM442的發(fā)酵液。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵采用變溫培養(yǎng)的主要目的在于溫度25°C為高山被抱霉CCFM442 最適宜生長溫度，在該溫度下培養(yǎng)2天可使菌體生物量增至最大；溫度6°C為高山被抱霉 CCFM442發(fā)酵生產(chǎn)EPA的適宜溫度，在此溫度下培養(yǎng)5天可使菌體積累大量EPA。
[0025] 在該個(gè)步驟中，根據(jù)發(fā)酵液溶氧量判斷菌體生物量是否增至最大，由于培養(yǎng)初期 菌體快速生長需消耗大量氧氣，所W發(fā)酵液溶氧量逐步下降，下降至最低點(diǎn)后溶氧有緩慢 升高，該時(shí)間點(diǎn)（在溫度25°C下培養(yǎng)2天）時(shí)菌體生物量最大。
[0026] 在該個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，使用的培養(yǎng)設(shè)備是New Brunswick公司銷售的化發(fā)酵罐 (型號；BioFlo 115)。
[0027] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下：制備含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆稍、13. 34g/ L硝酸鐘、3g/L磯酸氨二鐘、Ig/L硫酸鋼、0. 5g/L二水合氯化巧與0. 5g/L六水合氯化儀的 混合物水溶液，將其水溶液的pH調(diào)節(jié)至6. 0,再在溫度121°C下滅菌20min，得到所述的發(fā)酵 培養(yǎng)基。
[002引所述水溶液的抑是使用硫酸及氨氧化鐘水溶液調(diào)節(jié)的。
[0029] D、后處理
[0030] 讓步驟C得到的含有高山被抱霉CCFM442的發(fā)酵液進(jìn)行離屯、分離，得到的濕菌體 用蒸饋水進(jìn)行洗漆，再離屯、分離，洗漆濕菌體接著干燥，于是得到一種干燥菌體，即所述的 菌體飼料添加劑。
[0031] 在該個(gè)步驟中，所述的洗漆是使用W濕菌體體積計(jì)3-5倍蒸饋水洗漆2-4次。
[0032] 在該個(gè)步驟中，第一次與第二次離屯、分離都是在轉(zhuǎn)速eOOOrpm的條件下進(jìn)行離屯、 分離lOmin。離屯、分離所使用的設(shè)備是化ermo銷售的離屯、機(jī)（型號；LYNX 4000)。
[0033] 在該個(gè)步驟中，所述的干燥是在溫度48-52°C與風(fēng)速2. l-2.5m/s的條件下干燥 85-95min。
[0034] 本發(fā)明使用的干燥設(shè)備是上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司銷售的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥 箱（型號；DGG-gi 23A)。
[0035] 采用本發(fā)明方法得到的干燥菌體，即所述的菌體飼料添加劑的含水率為W干燥菌 體總重量計(jì)25. 4-26. 4%，總脂肪酸含量為7. 6-10. 7%，其中多不飽和脂肪酸在總脂肪酸 中的含量是42. 4-45. 8%。
[0036] 所述的含水率測定參考GB/T 5009. 3-2003。
[0037] 所述的粗脂肪測定參考GB/T 14772-2008。
[00測所述的脂肪酸測定參考文獻(xiàn)Wang L Chen W,化叫Y, et al. Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos 0ne6:e28319.。
[0039] 在總脂肪酸測定之后，對相應(yīng)脂肪酸含量進(jìn)行加和后可得所述的多不飽和脂肪酸 含量。
[0040] 由所述多不飽和脂肪酸中的《-6系列與0-3系列多不飽和脂肪酸含量可m十算 出，0-6/0-3 比為 4. 5-5. 3。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明，所述菌體飼料添加劑的用量是基礎(chǔ)飼料總重量的5-10%。
[0042] 本發(fā)明菌體飼料添加劑的脂肪酸組成合理，能提供有利于食用者身體健康的雞 蛋。該添加劑具有使用安全性高、PUFAs含量高、脂肪酸組成合理等優(yōu)點(diǎn)，在不降低產(chǎn)蛋性 能參數(shù)的情況下提高雞蛋中AA、DHA的含量，并維持《-6/?-3比在合理范圍內(nèi)。
[00創(chuàng)[有益效果]
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