快速準(zhǔn)確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種操作簡(jiǎn)單、成本低的快速準(zhǔn)確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法，是按如下步驟進(jìn)行：提取牡蠣樣本基因；對(duì)牡蠣樣本基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物：上游引物CaMF：5'-ATGGCCGATCAACTCACAG-?3'、下游引物CaMR：5'-GCCTTGAGTGGAAGTCGAT-3'；對(duì)已得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BlnⅠ單酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)擴(kuò)增條帶大小判斷，單酶切出227bp和663bp兩片段的基因片斷是太平洋牡蠣，不被BlnⅠ單酶切的基因片斷是近江牡蠣。
【專利說(shuō)明】快速準(zhǔn)確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種牡蠣的鑒別方法，尤其是一種操作簡(jiǎn)單、成本低的快速準(zhǔn)確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牡蠣其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界上產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類，在我國(guó)也已被廣泛地推廣養(yǎng)殖。雖然我國(guó)沿海自然分布的牡蠣有20多種，但只有太平洋牡蠣、近江牡蠣等是主要的養(yǎng)殖品種。在對(duì)牡蠣的基礎(chǔ)研究、資源開(kāi)發(fā)和保護(hù)利用中，都需要先對(duì)牡蠣進(jìn)行準(zhǔn)確分類，繼而才能對(duì)此種牡蠣的形態(tài)、表型、軟體重、顏色、殼長(zhǎng)、殼高、殼寬、營(yíng)養(yǎng)成分及繁殖能力等進(jìn)行研究。近年來(lái)，盡管國(guó)內(nèi)專家對(duì)牡蠣系統(tǒng)分類進(jìn)行了大量的研究報(bào)道，但由于牡蠣基因組學(xué)的研究不發(fā)達(dá)，使得大部分學(xué)者認(rèn)為牡蠣軟體部的結(jié)構(gòu)差異小，可提供的基因分類證據(jù)較少。因此，目前對(duì)于牡蠣只能通過(guò)經(jīng)典分類學(xué)進(jìn)行分類，即比較牡蠣的表型形態(tài)、比較解剖、生活習(xí)性等進(jìn)行分類，存在著分類不準(zhǔn)確的問(wèn)題，尤其是難以將太平洋牡蠣及近江牡蠣進(jìn)行區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的技術(shù)問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低的快速準(zhǔn)確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種快速鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行:
a.提取牡蠣樣本基因；
b.對(duì)牡蠣樣本基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；
上游引物 CaM F:5' - ATGGCCGATCAACTCACAG- 3’
下游引物 CaM R:5' - GCCTTGAGTGGAAGTCGAT- 3’
c.對(duì)已得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BlnI單酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；
d.根據(jù)擴(kuò)增條帶大小判斷，單酶切出227bp和663bp兩片段的基因片斷是太平洋牡蠣，不被Bln I單酶切的基因片斷是近江牡蠣。
[0005]所述a步驟是用酚-仿抽提法從牡蠣閉殼肌中提取牡蠣的全基因組DNA，并將DNA樣品溶于去離子滅菌水，濃度在100ng/ml。
[0006]本發(fā)明可以在對(duì)近江牡蠣和太平洋牡蠣進(jìn)行區(qū)分時(shí)，將兩種牡蠣的基因提取出來(lái)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到兩種牡蠣CaM基因890bp目的片段，再通過(guò)檢測(cè)兩種牡蠣CaM基因890bp目的片段的Bln I酶切產(chǎn)物大小，以區(qū)分二種牡蠣，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以為經(jīng)濟(jì)牡蠣遺傳種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分析、選育和雜交育種工作提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0007]圖1是本發(fā)明實(shí)施例二種牡蠣基因組DNA 1.0%瓊脂糖電泳圖譜。
[0008]圖2是本發(fā)明實(shí)施例二種牡蠣CaM基因目的片段PCR擴(kuò)增圖。
[0009]圖3是本發(fā)明實(shí)施例二種牡蠣CaM基因目的片段Bln I單酶切瓊脂糖圖。
[0010]圖4是本發(fā)明實(shí)施例二種牡蠣群體Bln I單酶切瓊脂糖鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]a.選取兩種牡蠣(太平洋牡蠣養(yǎng)殖群體購(gòu)自天津水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，近江牡蠣樣本購(gòu)自海南水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng))，取每個(gè)牡蠣的閉殼肌于EP管中，加入濃度為70%的乙醇，-20°C保存?zhèn)溆?；參照薩姆布魯克等經(jīng)典酚-仿抽提法從冷凍保存的牡蠣閉殼肌中提取牡蠣的全基因組DNA,并將DNA樣品溶于去離子滅菌水，濃度在100ng/ml，_20°C凍存?zhèn)溆茫?br> b.設(shè)計(jì)適用于二種牡蠣CaM基因目的片段擴(kuò)增引物序列，對(duì)a步驟所得樣本基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；
上游引物 CaMF: 5’ ATGGCCGATCAACTCACAG 3’
下游引物 CaMR: 5’ GCCTTGAGTGGAAGTCGAT 3’
c.對(duì)已得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BlnI單酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；
d.根據(jù)擴(kuò)增條帶大小判斷，單酶切出227bp和663bp兩片段的基因片斷是太平洋牡蠣，不被Bln I單酶切的基因片斷是近江牡蠣。
[0012]二種牡蠣基 因組DNA 1.0%瓊脂糖電泳圖譜如圖1所示:圖中M: DL2000 marker ；1:太平洋牡蠣DNA ；2:近江牡蠣DNA。
[0013]二種牡蠣CaM基因目的片段PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖如圖2所示:圖中M =Marker,DL2000 ；1:太平洋牡蠣:2:近江牡蠣。
[0014]二種牡蠣CaM基因目的片段Bln I單酶切瓊脂糖電泳圖如圖3所示:圖中M:Marker, DL2000 ；1:近江牡蠣Bln I酶切片段890bp ；2:太平洋牡蠣Bln I酶切片段663bp和 227bp。
[0015]二種牡蠣群體各隨機(jī)選取10個(gè)個(gè)體Bln I單酶切瓊脂糖鑒定圖如圖4所示:M:Marker, DL2000 ;1_10近江牡蠣個(gè)體Bln I酶切片段；2:11，12-20太平洋牡蠣個(gè)體Bln I酶切片段663bp和227bp。
【權(quán)利要求】
1.一種快速準(zhǔn)確鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行: a.提取牡蠣樣本基因； b.對(duì)牡蠣樣本基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物； 上游引物 CaM F:5' - ATGGCCGATCAACTCACAG- 3’ 下游引物 CaM R:5' - GCCTTGAGTGGAAGTCGAT- 3’ c.對(duì)已得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BlnI單酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳； d.根據(jù)擴(kuò)增條帶大小判斷，單酶切出227bp和663bp兩片段的基因片斷是太平洋牡蠣，不被Bln I單酶切的基因片斷是近江牡蠣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒別近江牡蠣與太平洋牡蠣的方法，其特征在于所述a步驟是用酚-仿抽提法從牡蠣閉殼肌中提取牡蠣的全基因組DNA，并將DNA樣品溶于去離子滅菌水，濃度在100ng/ml`。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103865983SQ201210535646
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月13日
【發(fā)明者】仇雪梅, 于旭蓉, 常亞青, 王秀利, 徐進(jìn) 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué), 仇雪梅