專利名稱：一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膽固醇氧化酶(COD)是膽固醇代謝過程中關(guān)鍵酶，能專一性催化膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮，它作為一種膽固醇檢測(cè)酶應(yīng)用于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域。同時(shí)，在食品開發(fā)、抗蟲基因工程、生物農(nóng)藥等方面也具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。 由于膽固醇氧化酶在保存、運(yùn)輸過程中易失活，因此提高其穩(wěn)定性是該酶大量應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，提高酶穩(wěn)定性方法主要有，蛋白質(zhì)工程、固定化、添加保護(hù)劑、化學(xué)修飾等，其中固定化是較為常用的方法。本發(fā)明中使用碳二亞胺法及戊二醛法修飾膽固醇氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是一種將氨基和羧基偶聯(lián)的縮合劑，載體或蛋白羧基被碳二亞胺活化，生成中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物再與蛋白氨基反應(yīng)形成結(jié)合物；戊二醛作為雙功能試劑，廣泛應(yīng)用于酶固定化中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)巧妙、條件溫和、易操作、成本低、環(huán)境污染小、適于大規(guī)模應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺交聯(lián)或B、采用戊二醛交聯(lián)，步驟為
利用殼聚糖20000作為修飾工具，將殼聚糖的活性氨基與膽固醇氧化酶的活性氨基或羧酸基交聯(lián)；反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為4-10°C。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在交聯(lián)之前需要研究膽固醇氧化酶分子表面羧酸基及氨基數(shù)目，所述單個(gè)膽固醇氧化酶分子表面羧酸基數(shù)目為45個(gè)，氨基數(shù)目為60個(gè)。較佳地，當(dāng)采取EDC交聯(lián)法時(shí)，所述酶分子游離羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比1:10，游離羧基與EDC摩爾比為1: 2，所述反應(yīng)pH為6. O。較佳地，所述反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為4-10°C。較佳地,所述反應(yīng)后使用S印harose 4B介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析去除為反應(yīng)物質(zhì)。較佳地，當(dāng)采取戊二醛交聯(lián)法時(shí)，所述酶分子游離氨基與殼聚糖氨基摩爾比1:2，酶游離氨基與戊二醒摩爾比為1:2,所述反應(yīng)pH為8. O。較佳地，所述反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為4-10°C。較佳地,所述反應(yīng)后使用Sepharose 4B介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析去除為反應(yīng)物質(zhì)。所述固定化酶的熱、pH和存儲(chǔ)穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明在固定前，分析了膽固醇氧化酶分子表面酸性與堿性氨基酸分布情況，便于其后進(jìn)行修飾；
2、本發(fā)明以殼聚糖20000為修飾物，通過化學(xué)合成法將其與膽固醇氧化酶連接；
3、本發(fā)明優(yōu)化了膽固醇氧化酶修飾條件，增強(qiáng)了操作的精確性。


圖1是膽固醇氧化酶分子表面羧酸基分布圖。
圖2是膽固醇氧化酶分子表面氨基分布圖。圖3是不同pH對(duì)修飾COD活力的影響。圖4是游離羧基與EDC摩爾比及COD氨基與戊二醛摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響。圖5是原始酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性。圖6是原始酶和修飾酶的pH穩(wěn)定性。圖7是原始酶和修飾酶的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。實(shí)施例1膽固醇氧化酶羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響
取20-30g/L殼聚糖20000溶液于15 mL的離心管中，按照不同膽固醇氧化酶羧基與殼聚糖氨基摩爾比(1: 5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:120)加入EDC和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至總體積為10mL，調(diào)節(jié)溶液pH至6. 0，4-10°C、50 r/min振蕩固定16-20小時(shí)。反應(yīng)液上S印harose 4B層析柱進(jìn)行分子篩層析，獲得經(jīng)過修飾后分子量上升的組分，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力(%)。相對(duì)酶活力(％)=[修飾酶活力/ (初始酶活力一未偶聯(lián)酶活力)]X 100%
將不同修飾的酶置于37°C水浴鍋內(nèi)，24小時(shí)后測(cè)定酶活力，計(jì)算酶活力保留率(%)。酶活保留率(％) = (24小時(shí)后修飾酶活力/初始修飾酶活力)X 100%
摩爾比過高，酶分子緊密堆積抑制底物與酶活性部位反應(yīng)，造成酶活力下降，所以，摩爾比1:10對(duì)穩(wěn)定性作用最佳,結(jié)果見表2。表I膽固醇氧化酶羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響
膽固醇氧化酶羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比I酶活力保留率(%)_
1:120_49^_
178059.3
174065.4
172072.2
TTlO85.3
175丨74.3
膽固醇氧化酶酶活力單位定義37 °C、1分鐘轉(zhuǎn)化I ymol膽固醇生成膽
甾-4-烯-3酮的酶量定義為I個(gè)酶活單位(U)。膽固醇氧化酶酶活的測(cè)定方法膽固醇氧化酶催化氧化I mol膽固醇成為I mol膽甾-4-烯-3-酮，同時(shí)產(chǎn)生I mol過氧化氫。膽甾-4-烯-3-酮在240 nm處有最大吸收峰，而過氧化氫在過氧化氫酶的作用下能將4-氨基-安替比林、苯酚轉(zhuǎn)化為醌亞胺呈紅色，在500 nm處有最大吸收峰。通過檢測(cè)紫外吸收強(qiáng)度或通過比色就可以測(cè)定膽固醇的含量，從而計(jì)算出膽固醇氧化酶的酶活單位。
3 mL溶液A ( 4_氨基-安替比林I mmol/L、苯酹6 mmol/L;疊氮鈉O. 2 g/L;過氧化物酶5 000U /L ;磷酸鉀緩沖液25 mmol/L, pH 7. 5)，150yL溶液B (膽固醇8.26 g/L; Triton X-100 4. 26 %;異丙醇為溶劑)，50yL 酶液，37 °C、反應(yīng) 5 min，沸水浴3 min，于 500 nm 測(cè)吸光值 0D500。酶活(U/mL) =1. 6832 X0D500。實(shí)施例2不同pH對(duì)EDC法修飾COD活力的影響
取殼聚糖20000溶液于15 mL的離心管中，按照游離羧基與EDC摩爾比1:10、膽固醇氧化酶羧基與殼聚糖氨基摩爾比1:10加入EDC和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至溶液總體積為 10mL，設(shè)計(jì)不同 pH 條件(5、5·5、6·0、6·5、7·0、7·5、8·0、8·5)，4-10 °C >50 r/min振蕩固定16-20小時(shí)。反應(yīng)液上S印harose 4B層析柱進(jìn)行分子篩層析，獲得經(jīng)過修飾后分子量上升的組分，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力(%)。相對(duì)酶活力(％)=[修飾酶活力/ (初始酶活力一未偶聯(lián)酶活力)]X 100%
PH較低時(shí)，COD易失活，造成酶活力降低，pH過高時(shí)，則可能COD結(jié)構(gòu)破壞，不利于EDC活化載體羧基，使得酶活力下降，因此反應(yīng)最優(yōu)PH為6. O,結(jié)果見圖3。實(shí)施例3總羧基與EDC摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響
取殼聚糖20000溶液于15 mL的離心管中，按照膽固醇氧化酶羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比為1:10的比例添加膽固醇氧化酶的量，并且按照不同總羧基與EDC摩爾比(1:1、1:2、1: 5、10:1、1:20和1:40)加入EDC的量，加入磷酸緩沖液至溶液總體積為10mL，調(diào)節(jié)溶液pH至6. 0,4-10°C、50 r/min振蕩固定16-20小時(shí)。反應(yīng)液上Sepharose 4B層析柱進(jìn)行分子篩層析，獲得經(jīng)過修飾后分子量上升的組分，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力(%)。相對(duì)酶活力(％)=[修飾酶活力/ (初始酶活力一未偶聯(lián)酶活力)]X 100%
當(dāng)摩爾比較低時(shí)，酶活力逐漸降低，EDC濃度過高，可能引起酶分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，造成酶分子失活變性，酶活力下降，因此反應(yīng)最優(yōu)摩爾為1:2結(jié)果見圖4。實(shí)施例4膽固醇氧化酶氨基與殼聚糖氨基摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響
取殼聚糖20000溶液于15 mL的離心管中，按照總氨基與戊二醛摩爾比1:2、不同膽固醇氧化酶氨基與殼聚糖羧基摩爾比(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10)加入戊二醛和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至總體積為10mL，調(diào)節(jié)溶液pH至8. 0，4_10°C、50 r/min振蕩固定16-20小時(shí)。反應(yīng)液上S印harose 4B層析柱進(jìn)行分子篩層析，獲得經(jīng)過修飾后分子量上升的組分，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力(%)。相對(duì)酶活力(％)=[修飾酶活力/ (初始酶活力一未偶聯(lián)酶活力)]X 100%
將不同修飾的酶置于37°C水浴鍋內(nèi)，24小時(shí)后測(cè)定酶活力，計(jì)算酶活力保留率(%)。酶活保留率(％) = (24小時(shí)后修飾酶活力/初始修飾酶活力)X 100%
摩爾比過高，酶分子緊密堆積抑制底物與酶活性部位反應(yīng)，造成酶活力下降，所以，摩爾比1:10對(duì)穩(wěn)定性作用最佳,結(jié)果見表2。表2膽固醇氧化酶氨基與殼聚糖氨基摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，其特征在于，A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺交聯(lián)或B、采用戊二醛交聯(lián)，步驟為 A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺交聯(lián)用調(diào)整膽固醇氧化酶分子游離羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比為1:10，膽固醇氧化酶分子的游離羧基與交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC摩爾比為1:2，控制EDC交聯(lián)pH為6.0，反應(yīng)溫度為4-10°C，反應(yīng)16-20小時(shí)； 或B、采用戊二醛交聯(lián)調(diào)整膽固醇氧化酶分子游離氨基與殼聚糖氨基摩爾比為1:2，膽固醇氧化酶游離氨基與交聯(lián)劑戊二醛摩爾比為1:2，控制戊二醛交聯(lián)pH為8. 0，反應(yīng)溫度為4-10°C，反應(yīng)16-20小時(shí)； 采用A或B交聯(lián)后,均使用Sehparose 4B介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析,去除未修飾的蛋白和殼聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述殼聚糖分子量為20000。
全文摘要
一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)或戊二醛等對(duì)膽固醇氧化酶與殼聚糖20000進(jìn)行連接，修飾后的酶在熱、pH和存儲(chǔ)穩(wěn)定性方面均優(yōu)于游離酶，本發(fā)明易操作、成本低、環(huán)境污染小、適于大規(guī)模應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/04GK103013968SQ20121056104
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者辛瑜, 夏小樂, 張玲, 王武 申請(qǐng)人:江南大學(xué)