專利名稱：基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬微流控芯片技術領域，具體涉及一種基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制備方法。
背景技術：
石墨烯(graphene)是由單層碳原子緊密堆積成二維蜂窩狀晶格結構的一種碳質新材料，是構建其他碳素材料(如零維富勒烯、一維碳納米管、三維石墨)的基本單元。自從2004年英國Manchester大學的Geim等人發(fā)現(xiàn)單層石墨烯以來石墨烯受到了全世界科學家的廣泛關注。石墨烯具有優(yōu)異的電學、熱學和力學性能，可望在高性能納電子器件、電 池、電化學電容、復合材料、場發(fā)射材料、氣體傳感器及能量存儲等領域獲得廣泛應用[2]。由于其獨特的二維結構和優(yōu)異的晶體學質量，石墨烯蘊含了豐富而新奇的物理現(xiàn)象，具有重要的理論研究價值。過去幾年中，石墨烯已經(jīng)成為了備受矚目的國際前沿和研究熱點。目前，制備石墨烯的方法有機械剝離法、化學氣相沉積法、石墨化學氧化剝離法等，其中第三種方法是目前制備氧化石墨烯和石墨烯最常用也是最經(jīng)濟的方法。將石墨用高錳酸鉀等強氧化劑氧化，然后通過超聲剝離得氧化石墨烯，其基本結構是表面帶有羧基、羥基、羰基和環(huán)氧基的碳的單原子層，其含有豐富的含氧官能團[3]，在水中分散良好，容易與其它水溶性材料復合。由于氧化石墨烯含豐富的官能團，可通過化學修飾的方法制備石墨烯衍生物，甚至可與酶和蛋白等生物大分子共價鍵結合，在構建微流控芯片生化微反應器方面具有得天獨厚的優(yōu)勢，目前，尚未見有關報道。自從瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer [4]首次提出微型全分析系統(tǒng)(M~TAS)以來，微流控芯片就以其高效、快速、試劑用量少、低耗以及集成度高等優(yōu)點引起了國內有關專家的廣泛關注，在其方法學研究迅速發(fā)展的基礎上，微流控芯片在生物醫(yī)學研究、臨床診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測、法醫(yī)和軍事等領域顯示了良好的應用前景&7]。微流控芯片以微機電加工技術為依托，以微管道網(wǎng)絡為結構特征，以生命科學為目前主要應用對象，是當前微全分析系統(tǒng)領域發(fā)展的重點。微流控芯片是把生物、化學、醫(yī)學分析過程的采樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊幾個平方厘米大的芯片上，自動完成分析全過程。由于它在生物、化學、醫(yī)學等領域的巨大應用潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個生物、化學、醫(yī)學、流體、電子、材料、機械等多學科交叉的嶄新研究領域。微流控芯片微流通道尺寸在微米級，是納升到微升級小體積樣品的理想操作和分析平臺，特別適用于生物醫(yī)藥分析和臨床檢測小體積樣品的酶法和免疫法分析和檢測。其中一個很重要的用途是用于蛋白質的酶解和分析。蛋白質酶解是蛋白組學中蛋白質分析的一個關鍵步驟，待測樣品中的蛋白通過電泳分離后用蛋白水解酶水解成肽，然后用質譜測定其分子量得肽質量圖譜，經(jīng)檢索有關數(shù)據(jù)庫后完成蛋白鑒定。傳統(tǒng)的溶液酶解靈敏度低且耗時(12小時以上)，加上蛋白水解酶自身酶解產(chǎn)生的肽也會干擾目標蛋白的鑒定，所以溶液酶解時蛋白和酶的比例通常要求在20-40:1，以降低游離蛋白酶自身酶解的干擾，但由于蛋白酶濃度低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白質酶解方法具有重要意義。解決上述問題的主要途徑就是使用固定化酶技術，通常使用的微流控芯片酶反應器是將蛋白酶如胰蛋白酶通過溶膠-凝膠包埋[8’9]技術固定在微流控芯片通道內表面。存在的問題是由于酶不是通過共價鍵固定，容易流失，影響酶解效果。參考文獻
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發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出一種能夠大幅降低酶解時間并提高蛋白酶解效率的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制備方法。本發(fā)明提出的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片的制備方法，具體步驟為
(1)通過光刻和化學濕法刻蝕的方法，加工出用于復制帶有分離通道的微流控芯片基片的娃陽模；
(2)將少量熱引發(fā)劑偶氮二異丁腈和少量光引發(fā)劑安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80-90°C水浴中加熱15-20分鐘，使其預聚成甘油狀清亮鑄模溶液，將此含光引發(fā)劑的鑄模溶液沿微流控芯片硅陽模凸出的分離通道澆在硅陽模上并成條狀，將一片有機玻璃片蓋在預聚的鑄模溶液上并壓緊，然后用紫外光通過有機玻璃片照射預聚的鑄模溶液，引發(fā)本體聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；將硅陽模用玻璃板代替，制作得微流控芯片蓋片；將所述基片和所述蓋片發(fā)生原位聚合的一面通過熱壓鍵合，制作得有機玻璃微流控芯片成品；
(3)將石墨粉分散在濃硫酸中并用冰浴冷卻，然后加入硝酸鉀和高錳酸鉀進行氧化，再加入雙氧水后用稀鹽酸洗滌得氧化石墨，然后將氧化石墨分散到水溶液中，用超聲波進行剝離，得氧化石墨烯水溶液；將正硅烷乙酯與乙醇和稀鹽酸混合水解，得硅溶膠；將硅溶膠與氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修飾溶液；
(4)將正硅酸乙酯注入有機玻璃微流控芯片微通道，2-4小時后正硅酸乙酯充分滲入微通道的表層；用水沖去通道內多余的正硅酸乙酯，注入稀鹽酸水解1-3小時，得通道表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片，然后將硅溶膠和石墨烯水溶液混合制得的修飾溶液注入表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片通道內，然后移出修飾溶液，并干燥，得修飾有硅凝膠氧化石墨烯復合膜的微流控芯片；(5)在通道內注入1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本發(fā)明的步驟(2)中，所述有機玻璃微流控芯片通道的深度為20-50微米，底部寬度20-60微米，上部寬度50-200微米。本發(fā)明的步驟(2)中，有機玻璃蓋片對應于微流控芯片基片上通道的末端的位置鉆有直徑為1-3毫米的圓形小孔，用于進樣和收集蛋白酶解產(chǎn)物。本發(fā)明的步驟(2)中，所述熱壓鍵合的熱壓溫度為105-110°C，施加在兩片玻璃板上的微流控芯片上的熱壓壓力為0. 5-5公斤/平方厘米，熱壓時間為10-20分鐘。本發(fā)明的步驟(3)中，所述氧化石墨烯水溶液的濃度為1-10毫克/毫升，硅溶膠溶液的濃度為10-100毫克/毫升。
本發(fā)明的步驟(5 )中，水溶液中1- (3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的濃度分別為0. 5-5毫克/毫升和0. 25-2. 5毫克/毫升，蛋白水解酶的濃度為0. 5-5暈克/暈升。本發(fā)明提出的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片制備方法，進一步詳述如下
采用計算機輔助設計軟件設計芯片結構，典型的設計如圖1所示，由單十字交叉微通道2和7以及溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4構成，采用高分辨率(如3600 dpi)激光照排系統(tǒng)在透明薄膜上打印成掩膜，微通道部分為黑色線條，寬度為20-100微米，其它部分為透明。在經(jīng)氧化處理的硅片(P型，厚500微米，直徑4英寸，晶向〈100〉，表面二氧化硅氧化層厚800納米)通過旋轉涂膜技術涂覆一層正性光刻膠(Shipley S1813光刻膠，Shipley, Marlborough, MA，美國)，旋涂條件為 2000-4000 rpm，時間為 40-80 秒。然后在100-120 1烘烤處理40-80秒以提高光刻膠的附著并除出殘留的溶劑(暴光前烘)，然后蓋上掩膜(含設計的微流結構)，使用Karl Suss MA6/BA6光刻機(Karl Suss, Germany)進行接觸式紫外線曝光30-50秒后，浸入20% Microposit 351顯影劑(Shipley) 60-100秒，以洗去暴光部分的光刻膠層，然后于140-160 1烘箱中烘20-40分鐘使微通道和溶液連接孔部分未曝光的光刻膠硬化，然后以光刻膠和SiO2層為掩膜材料用60 1的40% KOH水溶液刻蝕裸露的硅片至深度為30-50微米，除去光刻膠后即制成硅片陽模。在甲基丙烯酸甲酯單體中加入少量熱引發(fā)劑偶氮二異丁腈(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 1-0. 2%)和少量光引發(fā)劑安息香(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 1-0. 2%),在50°C水浴加熱并搖動使其溶解，然后于80-90 °C水浴中加熱15-20分鐘，使單體預聚成甘油狀清亮鑄模溶液，沿微流控芯片硅陽模凸出的分離通道澆在硅陽模上并成條狀，將一片有機玻璃片直接蓋在預聚溶液上并壓緊，使預聚溶液充滿有機玻璃片與硅陽模間的縫隙，要求微流通道結構全部在有機玻璃片的下方，然后將工件水平放置。用20 W紫外燈(365nm，距離4-5厘米)通過有機玻璃片照射預聚溶液20-30分鐘引發(fā)表面原位聚合，聚合溫度15-35°C。當模具從微流控芯片基片脫去后，硅陽模凸出的微結構可以高保真的被復制為微流控芯片基片表面的微通道。將上述硅陽模用玻璃板代替可制作微流控芯片蓋片。將脫模后的微流控芯片基片通道末端鉆孔(溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4見圖1，孔徑1-3毫米)用于連接溶液。將基片和蓋片用水沖洗，吹干后立即將微流控芯片基片帶有開口通道的一面與一片相同大小的有機玻璃蓋片夾于兩片玻璃片后，通過熱壓鍵合得有機玻璃微流控芯片。熱壓封裝溫度為105-110°C，施加在兩片玻璃板上的壓力為0.5-5公斤/平方厘米，熱壓時間為10-15分鐘。將6克石墨與90-150毫升濃硫酸混合，得有金屬光澤的粘稠液體，用冰水冷卻后，加入硝酸鉀3-6克，在用冰水冷卻的情況下，分次加入10-25克高錳酸鉀，混合物在35°C加熱30分鐘，成粘稠的黑褐色糊狀液體，然后加水200-400毫升，立刻有大量氣體放出，繼續(xù)在98°C加熱40分鐘，加水到800-900毫升后加雙氧水15-30毫升，用濾布抽濾分離出氧化石墨，并用5%的稀鹽酸通過抽濾洗滌，用水進一步洗滌并干燥得氧化石墨。準確稱取一定量氧化石墨分散在水中，通過超聲波進行剝離得氧化石墨烯水溶液，濃度為1-10毫克/毫升。取1. 8毫升正硅烷乙酯與2. 8毫升無水乙醇和0. 92毫升0. 25摩爾/升稀鹽酸混合水解2小時后，用無水乙醇稀釋到5-50毫升，得濃度為10-100毫克/毫升的硅溶膠，與氧化石墨烯水溶液等體積混合得微流控芯片通道修飾溶液&將正硅酸乙酯注入有機玻璃微流控芯片微流通道，使其在通道內停留2-4小 時，使正硅酸乙酯充分滲入微流通道的表層。通道內多余的正硅酸乙酯用水沖去后，將0. 05-0. 2摩爾/升的稀鹽酸注入微流通道1-3小時，得通道表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片，然后將硅溶膠和石墨烯水溶液混合制得的修飾溶液注入表面經(jīng)硅凝膠化經(jīng)處理的有機玻璃微流控芯片通道內，1-10分鐘后移出修飾溶液并干燥得修飾有硅凝膠氧化石墨烯復合膜的微流控芯片。然后，在硅凝膠氧化石墨烯復合膜修飾通道內注入含0. 5-5毫克/毫升1-(3- 二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0. 25-2. 5毫克/毫升N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入0. 5-5毫克/毫升胰蛋白酶等蛋白酶溶液，在室溫下反應3-5小時，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本發(fā)明通過化學氧化和超聲分散由石墨粉制得氧化石墨烯水溶液，與由正硅烷乙酯水解制得的硅溶膠混合后注入表面經(jīng)硅凝膠化經(jīng)處理的有機玻璃微流控芯片通道內，一定時間后移出修飾溶液并干燥得修飾有硅凝膠氧化石墨烯復合膜的微流控芯片。胰蛋白酶等蛋白酶水解酶通過氨基與通道表面氧化石墨烯的羧基形成共價鍵從而獲得固定，得蛋白酶解微流控芯片。由于酶通過共價鍵固定，其自身酶解被抑制，故可以使用較大的酶量，使酶解效率大幅提高。該反應器可將蛋白質的酶解時間從傳統(tǒng)的溶液酶解的12小時以上大幅度降低到10秒以內，大大節(jié)約了酶解時間，提高了工作效率。為蛋白組學中蛋白的高效酶解和高通量鑒定提供新的技術手段。本發(fā)明提出的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片具有制作簡便、價格低廉和穩(wěn)定性高的優(yōu)點，可采用注射涂布的技術批量加工。通過更換固定的酶的種類還可在此基礎上開發(fā)其它更多用途的微流控芯片酶反應器。 本發(fā)明中使用的微流控芯片酶解反應器可采用注射涂布工藝批量加工，具有工藝簡單和價格低廉的特點，在蛋白質研究、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、生命科學研究和食品分析等領域有良好的應用前景。


圖1為本發(fā)明使用單十字交叉有機玻璃微流控芯片示意圖。
圖2為本發(fā)明中微流控芯片通道表面硅凝膠氧化石墨烯復合膜固定胰蛋白酶示意圖。圖3為本發(fā)明中(a)氧化石墨烯和(b)固定有胰蛋白酶的硅凝膠氧化石墨烯復合膜掃描電子顯微鏡照片。圖4為本發(fā)明中基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片實物照片。圖5為本發(fā)明中蛋白微流控芯片酶解裝置示意圖。圖6為使用本發(fā)明制備的微流控芯片酶反應器酶解牛血紅蛋白(a)和馬心細胞色素c (b)產(chǎn)物的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜圖。流速2.0微升/分鐘，酶解時間〈10秒，蛋白質溶液濃度200納克/微升(溶于20毫摩爾/升碳酸氫銨水溶液(pH 8.1)中)，所有匹配的肽段用標出。圖中標號1、5和6為樣品溶液孔，2為微流控芯片主通道，3為微流控芯片，4為酶 解液收集孔，7為進樣微通道，8為注射泵，9為待酶解的蛋白質樣品溶液，10為硅橡膠連接管，11為蛋白酶解液收集孔，12為微流控芯片酶反應器，13為質譜點樣板，14為蛋白樣品酶解后獲得含肽段的酶解液基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜圖示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例和附圖進一步描述本發(fā)明
實施例1、基于固定有胰蛋白酶的硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片采用計算機輔助設計軟件設計芯片結構，典型的設計如圖1所示，由單十字交叉微流通道2和7以及溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4構成，采用高分辨率(如3600 dpi)激光照排系統(tǒng)在透明薄膜上打印成掩膜，微通道部分為黑色線條，寬度為40微米，其它部分為透明。在經(jīng)氧化處理的硅片(P型，厚500微米，直徑4英寸，晶向〈100〉，表面二氧化硅氧化層厚800納米)通過旋轉涂膜技術涂覆一層正性光刻膠(Shipley S1813光刻膠，Shipley, Marlborough, MA，美國)，旋涂條件為3000 rpm,時間為60秒。然后在110。。烘烤處理60秒以提高光刻膠的附著并除出殘留的溶劑(暴光前烘)，然后蓋上掩膜(含設計的微流結構)，使用Karl Suss MA6/BA6光刻機(Karl Suss, Germany)進行接觸式紫外線曝光40秒后，浸入20% Microposit 351顯影劑(Shipley)60-100秒，以洗去暴光部分的光刻膠層后，于150 1烘箱中烘30分鐘使毛細管通道和溶液連接孔部分未曝光的光刻膠硬化，然后以光刻膠和SiO2層為掩膜材料用60 0C的40% KOH水溶液刻蝕裸露的硅片至深度為35微米，除去光刻膠后即制成硅片陽模。在甲基丙烯酸甲酯單體中加入少量熱引發(fā)劑偶氮二異丁腈(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 15%)和少量光引發(fā)劑安息香(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 15%),在50°C水浴加熱并搖動使其溶解，然后于85°C水浴中加熱15-20分鐘，使單體預聚成甘油狀清亮鑄模溶液，沿微流控芯片硅陽模凸出的分離通道澆在硅陽模上并成條狀，將一片有機玻璃片蓋在預聚溶液上并壓緊，使預聚溶液充滿有機玻璃片與硅陽模間的縫隙，要求微流通道結構全部在有機玻璃片的下方，然后將工件水平放置。用20 W紫外燈(波長365納米，距離4-5厘米)通過有機玻璃片照射預聚溶液約25分鐘引發(fā)表面原位聚合，聚合溫度為25 °C。當模具從微流控芯片基片脫去后，硅陽模凸出的微結構可以高保真的被復制為微流控芯片基片表面的微通道。將上述硅陽模用玻璃板代替可制作微流控芯片蓋片。將脫模后的微流控芯片基片通道末端鉆孔((溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4見圖1，孔徑2毫米)用于連接溶液。將基片和蓋片用水沖洗，吹干后立即將微流控芯片基片帶有開口通道的一面與一片相同大小的有機玻璃蓋片夾于兩片玻璃片后，通過熱壓鍵合得有機玻璃微流控芯片。熱壓封裝溫度為108°C，施加在兩片玻璃板上的壓力為2公斤/平方厘米，熱壓時間為10分鐘。將6克石墨與138毫升濃硫酸混合，得有金屬光澤的粘稠液體，用冰水冷卻，加入硝酸鉀3. 6克后，在用冰水冷卻的情況下，分次加入18克高錳酸鉀，混合物在35°C加熱30分鐘，成粘稠的黑褐色糊狀液體，然后加水276毫升，立刻有大量氣體放出，繼續(xù)在98°C加熱40分鐘，加水到840毫升后，加雙氧水18毫升，用濾布抽濾分離出氧化石墨，并用5%的稀鹽酸通過抽濾洗滌，然后用水洗并干燥得氧化石墨。準確稱取一定量氧化石墨分散在水中，通過超聲波進行剝離得氧化石墨烯水溶液，濃度為4毫克/毫升。取1. 8毫升正硅烷乙酯與2. 8毫升無水乙醇和0. 92毫升0. 25摩爾/升的稀鹽酸混合水解2小時后，用無水乙醇稀釋到10毫升，得濃度約為50毫克/毫升的硅溶膠，與氧化石墨烯水溶液等體積混合得微流控芯片通道修飾溶液。 將正硅酸乙酯注入有機玻璃微流控芯片微流通道，使其在提通道內停留3小時，使正硅酸乙酯充分滲入微流通道的表面層。通道內多余的正硅酸乙酯用水沖去后，將0.1摩爾/升的稀鹽酸注入微流通道2小時，得通道表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片，然后將硅溶膠和石墨烯水溶液混合制得的修飾溶液注入表面經(jīng)硅凝膠化經(jīng)處理的有機玻璃微流控芯片通道內，5分鐘后移出修飾溶液并干燥得修飾有硅凝膠氧化石墨烯復合膜的微流控芯片。在硅凝膠氧化石墨烯復合膜修飾通道內注入含2毫克/毫升1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I毫克/毫升N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入含2毫克/毫升胰蛋白酶的50毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 4)，在室溫下反應4小時，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本發(fā)明中微流控芯片通道表面硅凝膠氧化石墨烯復合膜表面共價鍵固定蛋白酶示意圖見圖2。本發(fā)明中氧化石墨烯和固定有胰蛋白酶的硅凝膠氧化石墨烯復合膜的掃描電子顯微鏡照片見圖3。圖4為本發(fā)明中基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片實物照片?；诠潭ㄓ幸鹊鞍酌腹枘z氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片12通過硅橡膠管10與注射泵8連接構成流動注射蛋白酶解系統(tǒng)，示意圖見圖5。蛋白樣品溶液在蛋白酶解微流控芯通道內的流速為2. 0微升/分鐘，根據(jù)流速估算酶解時間約為10秒。從蛋白酶解微流控芯片12流出的酶解液滴在質譜點樣板13上，通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀測定。其中酶解牛血紅蛋白和馬心細胞色素c的產(chǎn)物的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜圖見圖6，可見在譜圖中出現(xiàn)了酶解肽段的質譜峰，通過檢索網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)對于牛血紅蛋白和馬心細胞色素c分別有14條和11條肽段匹配，得到鑒定的氨基酸分別有138個和80個，蛋白序列覆蓋度分別為95%和76%，而傳統(tǒng)溶液酶解的牛血紅蛋白的蛋白序列覆蓋度為75%，表明本發(fā)明中基于固定有胰蛋白酶硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片在10秒內的酶解效果優(yōu)于溶液酶解12小時的結果。實施例2、基于固定有靡蛋白酶硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片 此外，采用本發(fā)明的方法，還制備了基于固定有靡蛋白酶硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片。除酶固定步驟外，其他同實施例1。具體方法為在硅凝膠氧化石墨烯復合膜修飾通道內注入含2毫克/毫升1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I毫克/毫升N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入含2毫克/毫升靡蛋白酶的50毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 4)，在室溫下反應 4小時，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得固定有靡蛋白酶硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片。通過更換固定的酶的種類(如葡萄糖氧化酶或脲酶)，還可在此基礎上開發(fā)新型微流控芯片酶反應器，如血糖和尿素測定用微流控芯片酶反應器等。
權利要求
1.一種基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片的制備方法，其特征在于具體步驟為 (1)通過光刻和化學濕法刻蝕的方法，加工出用于復制帶有分離通道的微流控芯片基片的娃陽模； (2)將熱引發(fā)劑偶氮二異丁腈和光引發(fā)劑安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80-90°C水浴中加熱15-20分鐘，使其預聚成甘油狀清亮鑄模溶液；將此含光引發(fā)劑的鑄模溶液沿微流控芯片硅陽模凸出的分離通道澆在硅陽模上并成條狀，將一片有機玻璃片蓋在預聚的鑄模溶液上并壓緊，然后用紫外光通過有機玻璃片照射預聚的鑄模溶液，引發(fā)本體聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；將硅陽模用玻璃板代替，制作得微流控芯片蓋片；將所述基片和所述蓋片發(fā)生原位聚合的一面通過熱壓鍵合，制作得有機玻璃微流控芯片成品; (3)將石墨粉分散在濃硫酸中并用冰浴冷卻，然后加入硝酸鉀和高錳酸鉀進行氧化，再加入雙氧水后用稀鹽酸洗滌得氧化石墨，然后將氧化石墨分散到水溶液中，用超聲波進行剝離，得氧化石墨烯水溶液；將正硅烷乙酯與乙醇和稀鹽酸混合水解，得硅溶膠；將硅溶膠與氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修飾溶液； (4)將正硅酸乙酯注入有機玻璃微流控芯片微通道，2-4小時后正硅酸乙酯充分滲入微通道的表層；用水沖去通道內多余的正硅酸乙酯，注入稀鹽酸水解1-3小時，得通道表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片，然后將硅溶膠和石墨烯水溶液混合制得的修飾溶液注入表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片通道內，然后移出修飾溶液，并干燥，得修飾有硅凝膠氧化石墨烯復合膜的微流控芯片； (5)在通道內注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控芯片； 步驟(2)中，所述有機玻璃微流控芯片通道的深度為20-50微米，底部寬度20-60微米，上部寬度50-200微米。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片的制備方法，其特征在于步驟(2)中，有機玻璃蓋片上對應于微流控芯片基片上通道的末端的位置鉆有直徑為1-3毫米的圓形小孔，用于進樣和收集蛋白酶解產(chǎn)物。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片的制備方法，其特征在于步驟(2)中，所述熱壓鍵合的熱壓溫度為105-110°C，施加在兩片玻璃板上的微流控芯片上的熱壓壓力為O. 5-5公斤/平方厘米，熱壓時間為10-20分鐘。
4.根據(jù)權利要求1所述的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述修飾溶液中，氧化石墨烯水溶液的濃度為1-10毫克/毫升，硅溶膠溶液的濃度為10-100毫克/毫升。
5.根據(jù)權利要求1所述的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片的制備方法，其特征在于步驟(5)中，水溶液中1- (3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-輕基丁二酰亞胺的濃度分別為O. 5-5暈克/暈升和O. 25-2. 5暈克/暈升,蛋白水解酶的濃度為O. 5-5毫克/毫升。
6.由權利要求1-5之一制備方法所制備得到的基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片。
全文摘要
本發(fā)明屬微流控芯片技術領域，具體為一種基于硅凝膠氧化石墨烯復合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制備方法。石墨粉通過化學氧化和超聲分散得氧化石墨烯水溶液，與正硅烷乙酯水解制得的硅溶膠混合后，注入表面經(jīng)硅凝膠化處理的有機玻璃微流控芯片通道內，一定時間后移出修飾溶液并干燥得修飾有硅凝膠氧化石墨烯復合膜的微流控芯片。然后，在通道內注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯上的羧基活化，接著注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本發(fā)明制備的微流控芯片蛋白酶解反應器具有酶解時間短、樣品用量少和價格低廉等優(yōu)點。
文檔編號C12M1/40GK103013824SQ201210561470
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權日2012年12月21日
發(fā)明者陳剛, 魏邦國, 包慧敏, 張魯雁 申請人:復旦大學