專利名稱：定量pcr微流控芯片裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于ー種定量PCR微流控芯片裝置，具體地說，是將電化學(xué)檢測技術(shù)與PCR技術(shù)集成在微流控芯片系統(tǒng)中，發(fā)揮一體化、多功能的優(yōu)勢，該微流控芯片適用于各種基因診斷檢測和實(shí)驗(yàn)室使用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(英文全稱Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的ー種方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。PCR由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟組成ー個(gè)周期，進(jìn)行多次循環(huán)。每完成ー個(gè)循環(huán)僅需幾分鐘左右，約2-4小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因得以迅速擴(kuò)增放大約為IO9個(gè)拷貝，它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于遺傳疾病、腫瘤等重大疾病的診斷。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的ー項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。微流控芯片技術(shù)是目前分析科學(xué)的研究前沿?zé)狳c(diǎn)之一。微流控芯片技術(shù)是將實(shí)驗(yàn)室整個(gè)分析過程如樣品處理、樣品過濾、樣品分離以至樣品檢測等集成在一小塊芯片上進(jìn)行，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)分析過程的自動(dòng)化和微型化。微流控芯片領(lǐng)域中ー個(gè)重要的熱點(diǎn)就是研究微流控芯片中PCR集成技木。目前，集成PCR微流控芯片技術(shù)一般是僅僅設(shè)計(jì)PCR技術(shù)在微流控芯片中完成，PCR微流控芯片為現(xiàn)有技木，但它缺少實(shí)時(shí)定量檢測技術(shù)，限制了集成PCR微流控芯片的應(yīng)用范圍。因此，實(shí)現(xiàn)定量檢測技術(shù)與PCR微流控芯片的集成，可進(jìn)ー步拓寬PCR微流控芯片的應(yīng)用研究領(lǐng)域，同時(shí)這種方法避免了 PCR產(chǎn)物分析時(shí)的電泳及染色過程，所以更為快捷、簡便和靈敏。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型目的是提出ー種制作成本低廉、操作簡便的定量PCR微流控芯片裝置。本實(shí)用新型所采用的技術(shù)方案是本實(shí)用新型所述的定量PCR微流控芯片裝置，包括固定底座、三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，ー個(gè)PCR微流控芯片和電化學(xué)檢測器，其特征是在固定底座上制作有三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，三個(gè)獨(dú)立的恒溫器分別為低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器是依序并排設(shè)置的，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器上分別形成有可精確控制溫度的低溫退火區(qū)、適溫延伸區(qū)和高溫變性區(qū)的三個(gè)溫度區(qū)，在低溫退火區(qū)、適溫延伸區(qū)和高溫變性區(qū)分別具有三個(gè)基本PCR反應(yīng)步驟所需的溫度，在上述三個(gè)獨(dú)立的恒溫器的上方放置有PCR微流控芯片，在PCR微流控芯片內(nèi)分布有擴(kuò)增反應(yīng)管，擴(kuò)增反應(yīng)管有PCR反應(yīng)進(jìn)液ロ、PCR反應(yīng)擴(kuò)增后出液口和DNA擴(kuò)增反應(yīng)管，PCR反應(yīng)進(jìn)液ロ位于高溫變性區(qū)內(nèi)且與微型注射泵連接，擴(kuò)增反應(yīng)管依次穿過高溫變性區(qū)、適溫延伸區(qū)和低溫退火區(qū)，擴(kuò)增反應(yīng)管作為PCR微流控芯片中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)，PCR微流控芯片中的PCR反應(yīng)能在低溫退火區(qū)、適溫延伸區(qū)和高溫變性區(qū)中完成；在適溫延伸區(qū)的DNA擴(kuò)增反應(yīng)管中設(shè)置有PCR反應(yīng)物的定量檢測用的電化學(xué)檢測器。微流控芯片中的PCR退火區(qū)域集成電化學(xué)檢測電扱，用于目的基因擴(kuò)增數(shù)目的檢測。所述的定量PCR微流控芯片裝置，其特點(diǎn)為所述的三個(gè)獨(dú)立的恒溫器是由銅、鋁或不銹鋼材料制成的微型長方形的恒溫器。所述的定量PCR微流控芯片裝置，其特點(diǎn)為所述的電化學(xué)檢測器包括工作電極、對電極和參比電極。本實(shí)用新型的裝置可通過恒溫器這ー獨(dú)立溫度加熱裝置，精確控制解鏈、退火和延伸溫度的溫度，通過微流控芯片中微管道長度和流體流速來控制PCR反應(yīng)液在各個(gè)溫度區(qū)的時(shí)間和周期循環(huán)次數(shù)，實(shí)現(xiàn)目的基因擴(kuò)增，在各周期退火步驟處利用電化學(xué)檢測技術(shù)定量檢測目的基因擴(kuò)增數(shù)目，比普通PCR和熒光PCR更為快捷、簡便、靈敏，同時(shí)這種方法避免了 PCR產(chǎn)物分析時(shí)的電泳及染色過程。本實(shí)用新型的特點(diǎn)本實(shí)用新型的三個(gè)獨(dú)立的微型恒溫器，可精確控制高溫變性、 低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟的溫度，實(shí)現(xiàn)微流控芯片中的PCR反應(yīng)。微流控芯片中的PCR退火區(qū)域集成電化學(xué)檢測電極，可對目的基因擴(kuò)增數(shù)目定量檢測，大大提高了實(shí)驗(yàn)的檢測時(shí)間、成本、染料污染，避免了 PCR產(chǎn)物分析時(shí)的電泳及染色過程，拓寬了 PCR集成微流控芯片的研究范圍。本裝置平臺將溫控、PCR擴(kuò)增、檢測三部分集成為一體，快捷、簡便，集成化程度高。本實(shí)用新型的的定量PCR微流控芯片裝置適用于各種基因診斷檢測和實(shí)驗(yàn)室使用?？蛇M(jìn)ー步拓寬PCR微流控芯片的應(yīng)用研究領(lǐng)域，同時(shí)這種方法避免了PCR產(chǎn)物分析時(shí)的電泳及染色過程，所以更為快捷、簡便和靈敏。本裝置平臺將溫控、PCR反應(yīng)、檢測三部分集成為一體，微型化程度高，該裝置制作方法極易被推廣使用。

圖I為本實(shí)用新型的定量PCR微流控芯片裝置俯視不意圖。圖1-1為圖I的A部分局部放大圖。圖2為本實(shí)用新型的定量PCR微流控芯片裝置截面示意圖。圖3為信號指示劑在本裝置上發(fā)生PCR反應(yīng)后的檢測結(jié)果圖。圖中1，低溫退火區(qū)；2，適溫延伸區(qū)；3，高溫變性區(qū)；4，PCR反應(yīng)進(jìn)液ロ ；5，DNA擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)；6，PCR微流控芯片；7，固定底座；8，電化學(xué)檢測器；9，PCR反應(yīng)擴(kuò)增后出液ロ ；10，工作電極；11，對電極；12，參比電極；13，PCR反應(yīng)擴(kuò)展前時(shí)檢測信號曲線；14，PCR反應(yīng)擴(kuò)展后檢測信號曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)說明如圖I、圖1-1和2所示，本實(shí)用新型所提供的定量PCR微流控芯片裝置，包括固定底座7、三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，ー個(gè)PCR微流控芯片和電化學(xué)檢測器，所述的恒溫器、PCR微流控芯片和電化學(xué)檢測器為現(xiàn)有技術(shù)，其特征是在固定底座7上制作有三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，三個(gè)獨(dú)立的恒溫器分別為低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器是依序并排設(shè)置的，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器上分別形成有可精確控制溫度的低溫退火區(qū)I、適溫延伸區(qū)2和高溫變性區(qū)3的三個(gè)溫度區(qū)，在低溫退火區(qū)I、適溫延伸區(qū)2和高溫變性區(qū)3分別具有三個(gè)基本PCR反應(yīng)步驟所需的溫度，在上述三個(gè)獨(dú)立的恒溫器的上方放置有PCR微流控芯片6，在PCR微流控芯片內(nèi)分布有擴(kuò)增反應(yīng)管，擴(kuò)增反應(yīng)管有PCR反應(yīng)進(jìn)液ロ 4、PCR反應(yīng)擴(kuò)增后出液ロ 9和DNA擴(kuò)增反應(yīng)管，PCR反應(yīng)進(jìn)液ロ 4位于高溫變性區(qū)3內(nèi)且與微型注射泵連接，擴(kuò)增反應(yīng)管依次穿過高溫變性區(qū)3、適溫延伸區(qū)2和低溫退火區(qū)1，擴(kuò)增反應(yīng)管作為PCR微流控芯片中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)5，在適溫延伸區(qū)2的DNA擴(kuò)增反應(yīng)管中設(shè)置有電化學(xué)檢測器8，PCR微流控芯片6中的PCR反應(yīng)能在低溫退火區(qū)I、適溫延伸區(qū)2和高溫變性區(qū)3的各區(qū)中實(shí)現(xiàn)；PCR微流控芯片6中各PCR反應(yīng)的高溫變性區(qū)3、適溫延伸區(qū)2和低溫退火區(qū)I與控制解鏈、延伸和退火的三個(gè)精確恒溫器上下對應(yīng)；DNA擴(kuò)增管的管道設(shè)置長度和管道內(nèi)流體所設(shè)置的流速以控制PCR反應(yīng)液在各個(gè)溫度區(qū)的時(shí)間和周期循環(huán)次；所述適溫延伸區(qū)2的電化學(xué)檢測器檢測PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程中DNA電化學(xué)雜交指示劑變化量，間接反應(yīng)PCR反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物的量，而實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)擴(kuò)增物的定量檢測。所述的電化學(xué)檢測器包括工作電極10、對電極11和參比電極12，工作電極10、對電極11和參比電極12分別引導(dǎo)線與檢測電路連接。 本實(shí)用新型裝置的制作包括以下3個(gè)步驟(I)首先再在固定底座上制作低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器擁有PCR擴(kuò)增的三個(gè)基本反應(yīng)步驟的溫度控制(1，低溫退火區(qū)；2，適溫延伸區(qū)；3，高溫變性區(qū));(2)再制作PCR微流控芯片，微流控芯片中微管道長度和流體流速來控制PCR反應(yīng)液在各個(gè)溫度區(qū)的時(shí)間和周期循環(huán)次數(shù)(5，微流控芯片中的PCR擴(kuò)展反應(yīng)區(qū)；6，微流控芯片);芯片中各PCR反應(yīng)區(qū)域與精確控制解鏈、退火和延伸的恒溫器上下對應(yīng)；(3)微流控芯片中集成電化學(xué)檢測器的制作，在微流控芯片PCR擴(kuò)增的適溫延伸區(qū)微管道處制作集成電化學(xué)檢測器(10，工作電極；11，對電極孔；12，參比電極孔)。三個(gè)基本PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟的溫度控制的恒溫器采用銅(或鋁)質(zhì)金屬材料，微型恒溫器為長方形，PCR微流控芯片是在三個(gè)獨(dú)立的恒溫器上方，PCR微流控芯片中各PCR反應(yīng)溫度區(qū)域與控制解鏈、退火和延伸的精確恒溫器上下對應(yīng)。金屬恒溫器上部設(shè)有電加熱器，下部設(shè)有散熱器，可以通過PID等方式對恒溫器的溫控エ質(zhì)進(jìn)行精確控溫。實(shí)驗(yàn)過程先將定量PCR微流控芯片裝置按上述步驟組裝；再開通三個(gè)恒溫器的恒溫控溫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)所需實(shí)驗(yàn)溫度(循環(huán)變性95°C —退火60°C—延伸72°C)，確保PCR微流控芯片中各PCR反應(yīng)區(qū)域溫度恒定；然后利用微型注射泵將PCR反應(yīng)液(DNA模板、4XdNTPs和Taq-DNA聚合酶、PCR緩沖液、BSA、DNA電化學(xué)雜交指示劑等)在進(jìn)ロ處進(jìn)入微管道，PCR反應(yīng)液在各個(gè)溫度區(qū)的時(shí)間和周期循環(huán)次可通過微管道長度和流體流速來控制；最后利用集成電化學(xué)檢測器檢測PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程中DNA電化學(xué)雜交指示劑變化量，間接反應(yīng)PCR反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物的量，如附圖3 (13，PCR反應(yīng)擴(kuò)展前時(shí)檢測信號線；14，PCR反應(yīng)擴(kuò)展后檢測信號線)，從而實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)物的定量檢測。制作定量PCR微流控芯片裝置可按如下步驟進(jìn)行首先制作恒溫平臺；再在恒溫平臺放置PCR微流控芯片，并利用微管道長度和流體流速來控制PCR反應(yīng)液在各個(gè)溫度區(qū)的時(shí)間和周期循環(huán)次；最后利用集成電化學(xué)檢測器檢測PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程中DNA電化學(xué)雜交指示劑變化量，間接反應(yīng)PCR反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物的量，而實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)擴(kuò)增物的定量檢測。
權(quán)利要求1.一種定量PCR微流控芯片裝置，包括固定底座(7)、三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，一個(gè)PCR微流控芯片和電化學(xué)檢測器，其特征是在固定底座(7)上制作有三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，三個(gè)獨(dú)立的恒溫器分別為低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器是依序并排設(shè)置的，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器上分別形成有可精確控制溫度的低溫退火區(qū)(I)、適溫延伸區(qū)和高溫變性區(qū)(3)的三個(gè)溫度區(qū)，在低溫退火區(qū)(I)、適溫延伸區(qū)(2)和高溫變性區(qū)(3)分別具有三個(gè)基本PCR反應(yīng)步驟所需的溫度，在上述三個(gè)獨(dú)立的恒溫器的上方放置有PCR微流控芯片(6)，在PCR微流控芯片內(nèi)分布有擴(kuò)增反應(yīng)管，擴(kuò)增反應(yīng)管有PCR反應(yīng)進(jìn)液口、PCR反應(yīng)擴(kuò)增后出液口(9)和DNA擴(kuò)增反應(yīng)管，PCR反應(yīng)進(jìn)液口(4)位于高溫變性區(qū)內(nèi)且與微型注射泵連接，擴(kuò)增反應(yīng)管依次穿過高溫變性區(qū)(3)、適溫延伸區(qū)(2)和低溫退火區(qū)(1)，擴(kuò)增反應(yīng)管作為PCR微流控芯片中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)(5)，PCR微流控芯片(6)中的PCR反應(yīng)能在低溫退火區(qū)(I)、適溫延伸區(qū)(2)和高溫變性區(qū)(3)中完成；在適溫延伸區(qū)(2)的DNA擴(kuò)增反應(yīng)管中設(shè)置有PCR反應(yīng)物的定量檢測用的電化學(xué)檢測器(8 )。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定量PCR微流控芯片裝置，其特征是所述的三個(gè)獨(dú)立的恒溫器是由銅、鋁或不銹鋼材料制成的微型長方形的恒溫器。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的定量PCR微流控芯片裝置，其特征是所述的電化學(xué)檢測器包括工作電極(10 )、對電極(11)和參比電極(12 )。
專利摘要本實(shí)用新型公開一種定量PCR微流控芯片裝置，包括固定底座、三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，一個(gè)PCR微流控芯片和電化學(xué)檢測器，其特點(diǎn)為在固定底座上制作有三個(gè)獨(dú)立的恒溫器，三個(gè)獨(dú)立的恒溫器分別為低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器，所述的低溫退火恒溫器、適溫延伸恒溫器和高溫變性恒溫器是依序并排設(shè)置的，PCR微流控芯片中的PCR反應(yīng)能在低溫退火區(qū)、適溫延伸區(qū)和高溫變性區(qū)中完成；在適溫延伸區(qū)的DNA擴(kuò)增反應(yīng)管中設(shè)置有PCR反應(yīng)物的定量檢測用的電化學(xué)檢測器。所述的定量PCR微流控芯片裝置適用于各種基因診斷檢測和實(shí)驗(yàn)室使用。本裝置平臺將溫控、PCR反應(yīng)、檢測三部分集成為一體，微型化程度高。
文檔編號C12M1/38GK202415561SQ20122001870
公開日2012年9月5日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者劉愛林, 林新華, 陳偉 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)