專利名稱：檢測y染色體微缺失的實時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測Y染色體微缺失的試劑盒。
背景技術：
據(jù)統(tǒng)計，全世界有15 %的夫婦患有不育(孕)癥，其中50 %以上由男方所致。近年來研究表明30%以上的男性不育是由于遺傳因素引起的生精障礙，通常表現(xiàn)為男性Y染色體長臂(q臂)11區(qū)上無精因子基因家族(Azoospermiafactor, AZF)多個位點的缺失突變，其中任何一個座位的微缺失都可導致生精障礙，而對于因Y染色體微缺失引起的男性不育是無法治療的。在胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)技術輔助生育治療前檢測Y染色體微缺失可以為臨床治療提供指導，減少不必要的經(jīng)濟浪費。目前歐洲、美國及我國相關學會已經(jīng)建議將檢測Y染色體微缺失列為男性不育的篩查項目。目前檢測基因微缺失的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外還有反向點雜交法、等位基因特異性聚合酶鏈反應、直接測序法等。后者是所有方法的金標準，但由于其費用昂貴，未廣泛使用。而PCR-RFLP法雖然費用較低，操作簡單，但特異性和敏感性都不太理想，其檢測通量小，對于樣本量較大的臨床檢測不適用。

實用新型內(nèi)容本實用新型提供一種能夠有效減少時間和成本的用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒。本實用新型提供一種用于檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，包括盒體、襯墊、裝有PCR反應液的第一容器及裝有引物探針組合的至少一個第二容器，所述襯墊具有多個容器孔，所述第一容器置于與其對應的所述容器孔，所述第二容器置于與其對應的所述容器孔，所述第二容器包括裝有檢測SY84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器中的一個或多個。所述檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，還包括裝有檢測男性性別決定基因SRY的SRY引物探針組合的第三容器，所述第三容器置于與其對應的所述容器孔。所述第二容器包括裝有檢測SY84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器中的多個。。所述第二容器包括裝有檢測SY 84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器。所述檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，還包括裝有陽性對照品的第四容器和裝有陰性對照品的第五容器，所述第四容器和第五容器分別置于與其對應的所述容器孔。所述SY84、SY86、SY127、SY134、SY254及SY255引物探針組合均包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針。不同的引物探針組合用于檢測Y染色體AZF區(qū)域的不同位點，可以根據(jù)需要選擇檢測其中的一個或多個位點，對應的，選擇與該位點對應的引物探針組合。Y染色體的AZF區(qū)域由AZFa區(qū)域、AZFb區(qū)域和AZFc區(qū)域組成。所述試劑盒還包括用于檢測男性性別決定基因SRY的SRY引物探針組合，所述SRY引物探針組合包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針。SRY引物探針組合用于質(zhì)控，其可以根據(jù)檢測要求選擇采用或不采用。所述引物探針組合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、和SY255引物探針組合組成，所述引物之間Tm值相差波動于2-4°C，所述探針之間Tm值相差波動于2_4°C，引物探針之間Tm值相差為10°C左右。引物包括針對各位點的引物和針對基因SRY的引物。探針包括針對各位點的探針和針對基因SRY的探針。所述PCR反應液還包括含MgCl、KCl、Tris的10倍緩沖液(10*Buffer)、含dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的 dNTP 及 rTaq 酶。其中，MgCl濃度為1. 5mM, KCl 濃度為 60mM、Tris 濃度為 12mM。其中，dNTP濃度為 0. 2mM。其中，合成引物濃度為300uM、探針濃度為100uM。一種用于檢測Y染色體微缺失的方法，包括如下步驟a)從人抗凝血中提取基因組DNA ；b)以所述基因組DNA試樣為模板，利用權利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探針組合進行PCR擴增及檢測；c)根據(jù)探針熒光標記選擇對應探針檢測通道的顏色；d)根據(jù)擴增曲線顏色及曲線有無判斷對應Y染色體的AZF區(qū)域是否存在缺失。其中，該方法采用四重熒光定量PCR分兩管對Y染色體3個區(qū)域6個位點進行檢測。本實用新型的有益效果是利用該試劑盒，可以在反應液中特異且高效地檢測Y染色體的AZF區(qū)域的多個位點是否缺失，從而能夠有效減少時間和成本。

圖1是本實施方式試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2-11是表明本實施方式檢測結(jié)果的熒光擴增曲線圖，其中，圖2的4條曲線分別表示SRY、SY84、SY127和SY254位點的擴增曲線；[0031]圖3的4條曲線分別表示SRY、SY134、SY255和SY86位點的擴增曲線；圖4的3條曲線分別表示SRY、SY127和SY254位點的擴增曲線；圖5的3條曲線分別表示SRY、SY134和SY255位點的擴增曲線；圖6的3條曲線分別表示SRY、SY84和SY254位點的擴增曲線；圖7的4條曲線分別表示SRY、SY86、SY134和SY255位點的擴增曲線；圖8的3條曲線分別表示SRY、SY86和SY255位點的擴增曲線；圖9的4條曲線分別表示SRY、SY84、SY127和SY254位點的擴增曲線；圖10的3條曲線分別表示SRY、SY84和SY127位點的擴增曲線；圖11的3條曲線分別表示SRY、SY86和SY134位點的擴增曲線。
具體實施方式
本實用新型運用四重熒光定量PCR分兩管對Y染色體AZFa區(qū)域的SY84位點和SY86位點、對AZFb區(qū)域的SY127位點和SY134位點、對AZFc區(qū)域SY254位點和SY255位點進行檢測，同時檢測男性性別決定基因SRY作為質(zhì)控，以正常已育男性DNA樣本作為陽性對照，女性DNA樣本作為陰性對照，滅菌水作為空白對照防止檢驗體系被污染。如圖1所示，本實施方式檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，包括盒體1、襯墊2、裝有PCR反應液的第一容器4及裝有引物探針組合的至少一個第二容器3，所述襯墊2具有多個容器孔，所述第一容器4置于與其對應的所述容器孔，所述第二容器3置于與其對應的所述容器孔，所述第二容器3包括裝有檢測SY84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器中的一個或多個。該試劑盒還可以包括裝有檢測男性性別決定基因SRY的SRY引物探針組合的第三容器5，所述第三容器5置于與其對應的所述容器孔。用于檢測Y染色體AZFa區(qū)域SY84位點的引物探針組合定義為SY84引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與SY86位點相同，但與AZFb、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY84位點的探針、上、下游弓I物可隨機組合。用于檢測Y染色體AZFa區(qū)域SY86位點的引物探針組合定義為SY86引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與SY84位點相同，但與AZFb、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY86位點的探針、上、下游弓I物可隨機組合。用于檢測Y染色體AZFb區(qū)域SY127位點的引物探針組合定義為SY127引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與SY134位點相同，但與AZFa、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY127位點的探針、上、下游引物可隨機組合。用于檢測Y染色體AZFb區(qū)域SY134位點的引物探針組合定義為SY134引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與SY127位點相同，但與AZFa、AZFc區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY134位點的探針、上、下游引物可隨機組合。用于檢測Y染色體AZFc區(qū)域SY254位點的引物探針組合定義為SY254引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與SY255位點相同，但與AZFa、AZFb區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY254位點的探針、上、下游弓I物可隨機組合。用于檢測Y染色體AZFc區(qū)域SY255位點的引物探針組合定義為SY255引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與SY254位點相同，但與AZ Fa、AZFb區(qū)域四對探針及SRY探針各不相同。上述SY255位點的探針、上、下游弓I物可隨機組合。用于檢測男性性別決定基因SRY的引物探針組合定義為SRY引物探針組合，其包括上游引物、下游引物及Taqman熒光探針，熒光探針以FAM、HEX、CY5、ROX之一標記5’端，其熒光標記與AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域6對探針各不相同。上述基因SRY的探針、上、下游引物可隨機組合。上述SY84、SY86引物探針組合用于特異性檢測Y染色體的AZFa區(qū)域是否存在缺失。上述SY127、SY134引物探針組合用于特異性檢測Y染色體的AZFb區(qū)域是否存在缺失。上述SY254、SY255引物探針組合用于特異性檢測Y染色體的AZFc區(qū)域是否存在缺失。上述SRY引物探這組合用于質(zhì)控，檢測PCR過程是否正常。上述所有序列可由其堿基互補序列替換。本實施方式用于檢測男性Y染色體微缺失的試劑盒還包括PCR擴增所需試劑IO^Buffer (含鎂離子的緩沖溶液)、dNTP (含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq 酶。用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒，IO^Buffer中MgCl濃度為1. 5mM,KCl濃度為60mM、Tris 濃度為 12mM。用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒，dNTP濃度為0. 2mM。所有合成引物濃度為300uM，探針濃度為100uM。所述引物之間Tm (melting temperature,寡核苷酸的解鏈溫度)值相差波動于2-4°C，探針之間Tm值相差波動于2-4°C，引物探針之間Tm值相差為10°C左右。一種用于檢測Y染色體微缺失的基因檢測方法，包括以下步驟a)從人抗凝血中提取基因組DNA ；b)以步驟a所得人基因組DNA試樣為模板，利用上述的各引物探針組合對Y染色體的AZF區(qū)域及SRY進行特異性PCR檢測；c)設定PCR反應條件，根據(jù)探針熒光標記選擇對應探針檢測通道的顏色；d)根據(jù)擴增曲線顏色及曲線有無判斷對應AZF區(qū)域6個位點否存在缺失。PCR 反應條件為94°C 2min ；94°C 5S，52°C 45S，60°C 45S，此過程進行 40 個循環(huán)。本實施方式設計了 6組探針對特異性的檢測Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域微缺失，I組男性性別決定基因探針對進行質(zhì)控，另6組探針對分屬到兩個PCR反應中，同一條件下進行PCR，女性DNA樣本為陰性對照，滅菌水為空白對照以防止檢驗體系受污染。實施例1一、材料1.儀器實時熒光定量儀探針、引物設計以上述設計了 6對探針、弓丨物對特異性的檢測AZF序列，并同時設計I對探針、引物作為質(zhì)控，檢測男性性別決定基因，以檢測PCR檢測過程是否正常進行，以正常已育男性DNA樣本作為陽性對照，女性DNA樣本作為陰性對照，滅菌水作為空白對照防止檢驗體系被污染。2.使用下述探針引物對檢測AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域位點缺失。SY84 上游引物 5’ -CCTAITTGITTTAAGGTGCCAITCC-3’SY84 下游引物 5’ -GCTTGCCTGAGCATCCTACAG-3’SY84 探針5’ -VIC-CTCTACCTCCTTCCCCCAGTGCCCA-BHQ-3’SY86 上游引物 5’-GGCTTCCCAGAGTTGTTACAAAG-3’SY86 下游引物 5’-CTCAAGGACTGTGAGAATCAAGGTT-3’SY86 探針 5，-VIC-AATCCCAAAGACTGGGCCCCTTAAACA-BHQ-3’SY127 上游引物 5’-GGCTCACAAACGAAAAGAAAAAG-3’SY127 下游引物 5’-CTTTTTGTGGGCATGAACACA-3’SY127 探針 5，-FAM-TAGCACCCACTGGAATCTACCAAAGCCC-BHQ-3’SY134 上游引物 5’-GACTCACTATAGGGCGAAITGG-3’SY134 下游引物 5，-GGTGAGGCAGACAGTTTTGTAG-3’SY134 探針 5，-FAM-TACGGGCCCCCCCTCGAG-BHQ-3’SY254 上游引物 5’-AAGGCAAAATCGTGCCAAAC-3’SY254 下游引物 5’-CCATTGTTCATGATGTATGTTAAGGTAA-3’SY254 探針5’-CTGTTTTTGTTGGTGGAATTGATGCTAGGG-BHQ-3’SY255 上游引物 5，-GTTACAGGAITCGGCGTGAT-3，SY255 下游引物 5，-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，SY255 探針 5，-R0X-TAGGTTTCAGTGTTTGGATTCCGCCA-BHQ-3’SRY 上游引物 5’-nTTCGGCTTCAGTAAGCAnTT-3’SRY下游引物5’-AATCCCAGAATGCGAAACTCA-3’SRY 探針5，CY5-CACTGGTATCCCAGCTGCTTGCTGATC-BHQ-3’3. PCR 反應試劑10*Buffer (含鎂離子)、dNTP (含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq酶。二、方法1.基因組DNA提取購買試劑盒或按常規(guī)分子生物學方法提取基因組DNA。分別提取I例正常男性基因組DNA、4例非正常男性基因組DNA及I例女性基因組DNA。2.熒光定量PCR檢測[0100]PCR反應前將試劑放于冰上自然溶解，取PCR管并做好標記，分別加入滅菌水、10*Buffer、dNTP、rTaq酶、待檢測DNA樣本，每個樣本同時進行2個PCR檢測，即PCR反應液A 22. 5 u 1+待檢測樣本DNA2. 5 u I,PCR反應液B22. 5 U 1+同一待檢測樣本DNA2. 5u I,PCR反應體系見表2。每次檢測均設立陽性對照(正常男性基因組DNA)及陰性對照(女性基因組DNA )，滅菌水空白對照。表IPCR反應體系
權利要求1.一種檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括盒體、襯墊、裝有 PCR反應液的第一容器及裝有引物探針組合的至少一個第二容器，所述襯墊具有多個容器孔，所述第一容器置于與其對應的所述容器孔，所述第二容器置于與其對應的所述容器孔， 所述第二容器包括裝有檢測SY84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254 引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器中的一個或多個。
2.如權利要求1所述的檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，還包括裝有檢測男性性別決定基因SRY的SRY引物探針組合的第三容器，所述第三容器置于與其對應的所述容器孔。
3.如權利要求2所述的檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述第二容器包括裝有檢測SY84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的 SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器中的多個。。
4.如權利要求3所述的檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述第二容器包括裝有檢測SY84位點的SY84引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY86位點的 SY86引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY127位點的SY127引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY134位點的SY134引物探針組合的第二容器、裝有檢測SY254位點的SY254引物探針組合的第二容器及裝有檢測SY255位點的SY255引物探針組合的第二容器。
5.如權利要求1-4中任意一項所述的檢測Y染色體微缺失的實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，還包括裝有陽性對照品的第四容器和裝有陰性對照品的第五容器，所述第四容器和第五容器分別置于與其對應的所述容器孔。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測Y染色體微缺失的實時熒光定量PCR試劑盒，包括盒體、PCR反應液及設于所述盒體的至少一個引物探針組合，所述引物探針組合由用于檢測SY84位點的SY84引物探針組合、用于檢測SY86位點的SY86引物探針組合、用于檢測SY127位點的SY127引物探針組合、用于檢測SY134位點的SY134引物探針組合、用于檢測SY254位點的SY254引物探針組合及用于檢測SY255位點的SY255引物探針組合中之一或多個組成。利用該試劑盒，可以在反應液中特異且高效地檢測Y染色體的AZF區(qū)域的多個位點是否缺失，從而能夠有效減少時間和成本。
文檔編號C12M1/34GK202830036SQ2012204476
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權日2012年9月4日
發(fā)明者駱子義, 鄔宇美 申請人:駱子義, 鄔宇美