專利名稱：一種血液中稀有細胞的分離儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種血液檢測儀器，尤其是涉及一種血液中稀有細胞的分離儀。
背景技術(shù)：
血液稀有細胞分離儀是檢測與重大疾病相關(guān)的血液中稀有細胞的下一代診斷工具，稀有細胞包括流通在血液樣本中的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、惡性干細胞和病變的具有特定蛋白質(zhì)標記的細胞等等。相關(guān)的研究證實，病人的血液樣本中出現(xiàn)的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量與病人早期診斷和存活率具有很強的相關(guān)性。因此，對病人的血液樣本的稀有細胞檢測和分析是提高腫瘤疾病早期發(fā)現(xiàn)率和個性化治療的關(guān)鍵。由于病人血液樣本的CTCs數(shù)量非常小，使CTC檢測具有很大的挑戰(zhàn)性。流式細胞儀檢測方法是最普遍使用的一種CTC檢測方法，CTC比一般胞體大，核漿比例高，胞漿內(nèi)顆粒物質(zhì)少，表達特異性抗原，流式細胞儀應(yīng)用其對光散射和免疫熒光識別的特性，將CTC從總的細胞中分離出來。目前最新流式細胞儀BD FACSAria是流式高速細胞分選的新突破，但其難以克服的缺陷是:瞬時的激光打擊仍將給細胞帶來損傷，分選活性差；由于光譜間存在的交叉，易混入假陽性的細胞；熒光信號所需的補償難以調(diào)配；往往會出現(xiàn)細胞粘連成團的現(xiàn)象，流出道的堵塞時有發(fā)生；分選中斷后需重新過濾細胞制備樣本，這增加了污染的機率，且細胞活性大大受損。單純以流式細胞術(shù)檢測腫瘤患者中的CTC的方法仍存爭議；另外形態(tài)分離方法，從白細胞中分離出的CTCs的數(shù)量和密度比較小，同時會留下大量的與CTC形態(tài)類似且不足以視為CTC的細胞，如與白細胞一樣小的非循環(huán)腫瘤細胞。還有免疫檢測方法，因CTCs具有高特分離效性，可利用特定的標記物，對目標CTC進行標記，但需要額外增加一個免疫熒光染色篩選步驟。所以，有必要提供一種操作更方便和分離效果更好的的儀器從病人血液樣本中分離稀有細胞和/或病變的特定蛋白質(zhì)細胞。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作方便、分離效果更好的血液中稀有細胞分離儀。本實用新型解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種血液中稀有細胞的分離儀，包括:一個提供血液樣本的存儲器；一個用于抽取血液樣本的泵；包括一個微芯片，微芯片包括具有凹槽的薄片和載玻片，薄片設(shè)置在載玻片上形成一個微流體通道；該微流體通道連接在該存儲器與該泵之間，允許該血液樣本從存儲器流到泵；多個磁鐵位于該載玻片底部，并沿著載玻片的長度形成梯度的磁場分布，載玻片用來采集微芯片捕獲的稀有細胞。[0012]該微流體通道的入口通過第一連接管與存儲器連通，該微流體通道的出口通過第二連接管與泵連通，第一連接管與微流體通道的夾角為鈍角，第二連接管與微流體通道的夾角為鈍角。還包括用于旋轉(zhuǎn)該微流體通道的方向的旋轉(zhuǎn)手臂。在旋轉(zhuǎn)手臂的驅(qū)動下，該微流體通道在垂直位置、水平位置和對稱翻轉(zhuǎn)位置進行交替。載玻片上的磁場梯度和強度為可調(diào)節(jié)的。微流體通道的橫截厘為六邊形。在保證捕獲率的前提下，使捕獲到的稀有細胞分布廣。存儲器上設(shè)置有機械緩沖裝置。薄片和載玻片之間為可分離式連接。方便對已捕獲的稀有細胞進行后續(xù)分析。存儲器位置高于微芯片的位置50mm 150mm。一方面保證血液樣本的流通,另一方面又不至于使微流體通道承受過大的壓力。旋轉(zhuǎn)手臂的旋轉(zhuǎn)中心位于微流體通道的外部。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型的優(yōu)點是在血液樣本內(nèi)放入磁性納米粒子，磁性納米粒子表面帶有抗體，通過免疫反應(yīng)吸附在目標細胞上，然后將稀有細胞已被標記的血液樣本置放到存儲器內(nèi)，泵啟動后，血液樣本通過微流體通道時，血液樣本中的附著有磁性納米粒子的稀有細胞可以被梯度磁場引導(dǎo)，進而被采集在載玻片上，用于后續(xù)分析。

圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)圖；圖2為本實用新型的微流體通道的出入口示意圖；圖3為未吸附于細胞上的納米顆粒和各種稀有細胞在載玻片上三個不同區(qū)域被隔離的示意圖；圖4為旋轉(zhuǎn)手臂帶動微流體通道進行翻轉(zhuǎn)的示意圖；圖5為存儲器上的機械緩沖裝置的結(jié)構(gòu)圖；圖6為微芯片與陣列磁鐵的示意圖；圖7為磁鐵加墊片后的示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖實施例對本實用新型作進一步詳細描述。血液樣本中稀有細胞的分離儀，如圖1所示，分離儀包括存儲器110、微芯片和泵130，微芯片包括薄片120和載玻片140。薄片120與載玻片140兩者形成微流體通道121。薄片120的凹槽用載玻片140密封，磁鐵150放在載玻片140的下方。微流體通道包括一個入口 116和一個出口 126。存儲器110通過第一連接管115連接到微流體通道121的入口 116。同樣，泵130通過第二連接管125連接到微流體通道121的出口 126。準備一個娃片，薄膜狀的SU8光阻材料(由MicroChem, Newton, MA制造)均勻地涂在硅片的表面，然后將SU8光阻材料通過光掩膜暴露到紫外線下。SU8光阻未曝光的部分在其還處于液體狀態(tài)時進行去除，SU8光阻曝光部分留在硅片上，處理后的SU8在硅片表面形成制作微芯片的模具。將PDMS (例如道康寧Sylgard，米德蘭，MI制造)和固化劑以質(zhì)量比10:1比例進行混合，形成液態(tài)硅橡膠，將液態(tài)硅橡膠澆筑到硅片表面形成的模具上，形成一個具有凹槽的彈性體。對成型后彈性體進行表面處理并修改到一個理想的形狀后，即成薄片120，薄片120與載玻片140粘合，形成一個微流體通道121。微流體通道121理想的形狀和尺寸如圖2所示。載玻片140最好是150 u m厚。微流體通道121的形狀、進口 116和出口 126的接入角(Θ 1，Θ 2)會影響微流體通道121內(nèi)流動的血液樣本分布。在微流體通道121內(nèi)的血液樣本應(yīng)避免快速流動，因為快速流動可能會導(dǎo)致血液樣本內(nèi)的稀有細胞機械損傷及血液細胞被沖走。但過于低速流動可能造成停滯，會導(dǎo)致血液凝固或連接管的堵塞。血液樣本101經(jīng)由存儲器110注入微流體通道121。用泵130把通過微流體通道121內(nèi)的血液樣本101的流速調(diào)節(jié)到2.5-10ml/h。泵130從微流體通道121中抽取血液樣本101，可以減少微流體通道121的內(nèi)壓。血細胞通常比他們的媒介(如緩沖液、血漿等)稠密，為了避免血細胞的停滯，存儲器110位置要高于微芯片和泵130的位置。存儲器110位置高于微芯片約IOOmm是最理想的。當存儲器110與大氣相通時，微流體通道121的內(nèi)壓是由血液樣本的密度(P )決定的。重力(g)加速度、存儲器110內(nèi)血液樣本的高度都與微流體通道121的內(nèi)壓有關(guān)。假設(shè)P=1.05 g/mL，在微流體通道121中血液樣本101的壓力約為0.01大氣壓。這種低氣壓的配置，最大限度地減少血液樣本從微流體通道121泄漏的風(fēng)險。低氣壓配置、微芯片與載玻片可逆的粘接技術(shù)，使得稀有細胞分離出來后，載玻片140可以從微芯片里移出。在血液樣本101被放置在存儲器110內(nèi)之前，在血液樣本內(nèi)放入磁性納米粒子，磁性納米粒子表面帶有抗體，通過免疫反應(yīng)吸附在目標細胞上，磁性納米粒子材料可以是納米三氧化二鐵(如Veridex, LLC生產(chǎn)的磁流體納米粒子 )。血液樣本101內(nèi)部的稀有細胞被磁性納米粒子吸附并“標記”，在血液樣本通過微流體通道121的時候，血液樣本中的稀有細胞可被磁鐵150吸引。因此，血液樣本101中稀有細胞就被采集在載玻片140上了。留在載玻片140上的也有可能是一些未綁定任何稀有細胞的磁性納米粒子。但是如果非吸附于稀有細胞上的納米顆粒當作稀有細胞聚集在載玻片的同一區(qū)域上，會使后續(xù)觀察細胞的工作將變得非常困難。因此，磁鐵150提供梯度分布的磁場，將非吸附于細胞上的納米顆粒與附著有磁性納米粒子的稀有細胞在載玻片上分離，減少干擾。至少有二種方法來提供一個漸變的沿載玻片140 —側(cè)分布的磁場。第一種方法是使用磁鐵陣列遞增(或遞減)磁場勢，如圖6所示。第二種方法是把磁鐵放置在與載玻片140成傾斜角度的位置，以達到所需的梯度磁場；可以通過在磁鐵與載玻片之間放置墊片使磁鐵傾斜，達到需要的梯度磁場，如圖7所示。為了使載玻片140的表面更好地采集稀有細胞，需要對微芯片進行如下表面功能化處理:在氮氣環(huán)境中，PDMS材料制成的微芯片在70W的氧氣電漿中處理15分鐘，然后迅速沉浸在含丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中30分鐘，其中丙基三甲氧基硅烷在乙醇溶液中的質(zhì)量份數(shù)為4% (純度為85%的丙基三甲氧基娃燒由Acros Organics公司生產(chǎn)),然后用乙醇對微芯片沖洗，并將微芯片放在濃度為0.28%的N- (Y maleimidobutyryloxy)丁二酯(GMBS)溶液中反應(yīng)15分鐘，再將微芯片用濃度為10 Pg/mL的PBS緩沖液沖洗。30分鐘后，再次用含EpCAM抗體的PBS緩沖液漂洗微芯片，EpCAM的濃度為10 Pg/mL，漂洗時間為30分鐘，對微芯片進行表面功能化化學(xué)修飾。此外，不同類型的磁性納米粒子可以“標記”不同的稀有細胞。讓它們可以采集到載玻片140的不同區(qū)域。例如，如圖3所示，自由納米粒子301、附著較少磁性納米粒子的稀有細胞302和附著較多磁性納米粒子的稀有細胞303被采集在玻片140的三個不同區(qū)域。最后稀有細胞被從血液樣本101中分離。載玻片140可以與微芯片分離，在標準的光學(xué)顯微鏡下進行細胞觀察。如圖4所示，在分離過程中，微芯片跟隨磁鐵150通過電動旋轉(zhuǎn)臂160來執(zhí)行控制旋轉(zhuǎn)。微芯片的方向可以通過旋轉(zhuǎn)電機161的旋轉(zhuǎn)臂160和編碼傳感器162來控制。 第一狀態(tài)下:當微流體通道121位于載玻片140上方位置時，載玻片位于磁鐵的上方，稀有細胞的重力和受到的磁力方向相同，幫助稀有細胞吸附到載玻片140上。第二狀態(tài)下:當微流體通道121處于垂直方向，相對較重的紅血細胞(紅細胞)將沉淀到微流體通道121的底部，可以減少捕獲稀有細胞時的干擾。第三狀態(tài)下:通過將微流體通道121連同載玻片140和磁鐵150 —起反轉(zhuǎn)，使磁鐵150位于載玻片140的上面，此時磁鐵對稀有細胞的磁力和稀有細胞重力的方向相反，達到更好分離的目的。通常情況下，磁力和距離的平方成反比。起始狀態(tài)，稀有細胞由重力作用接近磁鐵150，在稀有細胞足夠接近磁體150后，微流體通道121旋轉(zhuǎn)到第二狀態(tài)和第三狀態(tài)下，使稀有細胞被磁鐵150吸附，而其他細胞是因重力分離。微流體通道121做連續(xù)的垂直位置、水平位置(第一狀態(tài))和對稱翻轉(zhuǎn)位置(第三狀態(tài))的交替運動，能使細胞分離更有效。如果旋轉(zhuǎn)中心位于微流體通道121內(nèi)，過長的連接管(如圖1中管115和管125)可能會導(dǎo)致血液樣本101在連接管內(nèi)滯留。把旋轉(zhuǎn)中心放置在存儲器110和微流體通道121之間是最可取的。這個位置可以更容易地旋轉(zhuǎn)微流體通道121。這樣微流體通道121與磁鐵150角度(即直立、傾斜、或翻轉(zhuǎn))相對位置變化時，直立位置和傾斜位置上就不需要過長的連接管。上述提到的旋轉(zhuǎn)運動，也可以按照細胞的大小和密度用離心力完成。在存儲器上安裝機械緩沖裝置，用于緩沖存儲器在旋轉(zhuǎn)時受到的振蕩，避免存儲器因振蕩而引起的破裂。如圖5所示，緩沖裝置包括二塊夾板和設(shè)置在夾板之間的彈簧501和彈簧502，在存儲器轉(zhuǎn)動過程中，彈簧501和彈簧502會壓縮或伸張，減緩存儲器受到的震蕩力。紅細胞沉淀的速度與紅細胞的密度相關(guān)，通過紅細胞密度的分布，可以計算紅細胞沉淀的精確時間。紅細胞的密度分布，計算如下:A.計算在微流體通道內(nèi)的流量矢量分布，可通過理論計算或者通過流體動力學(xué)軟件計算實現(xiàn)。B.把微流體通道分成若干個區(qū)域。(比如100 u mX 100 u m矩形區(qū)域)。C.對于每個區(qū)域，給出初步的血液密度。D.對于每個區(qū)域，紅細胞沉淀速度可從以上數(shù)據(jù)中預(yù)測。E.紅細胞流速=血液沉淀速度+流場流速。F.紅細胞密度分布可通過當前密度和紅細胞流量來計算。
權(quán)利要求1.一種血液中稀有細胞的分離儀，包括: 一個提供血液樣本的存儲器； 一個用于抽取血液樣本的泵； 其特征在于包括一個微芯片，微芯片包括具有凹槽的薄片和載玻片，薄片設(shè)置在載玻片上形成一個微流體通道； 該微流體通道連接在該存儲器與該泵之間，允許該血液樣本從存儲器流到泵； 多個磁鐵位于該載玻片底部，沿著載玻片的長度形成梯度的磁場分布，載玻片用來米集微芯片捕獲的稀有細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于該微流體通道的入口通過第一連接管與存儲器連通，該微流體通道的出口通過第二連接管與泵連通，第一連接管與微流體通道的夾角為鈍角，第二連接管與微流體通道的夾角為鈍角。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于還包括用于旋轉(zhuǎn)該微流體通道的方向的旋轉(zhuǎn)手臂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于在旋轉(zhuǎn)手臂的驅(qū)動下，該微流體通道在垂直位置、水平位置和對稱翻轉(zhuǎn)位置進行交替。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于載玻片上的磁場梯度和強度為可調(diào)節(jié)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于微流體通道的橫截面為六邊形。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于存儲器上設(shè)置有機械緩沖裝置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于薄片和載玻片之間為可分離式連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于存儲器位置高于微芯片的位置5mm 10mm。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種血液中稀有細胞的分離儀，其特征在于旋轉(zhuǎn)手臂的旋轉(zhuǎn)中心位于微流體通道的外部。
專利摘要本實用新型公開了一種血液中稀有細胞的分離儀，包括微芯片及其附屬外圍設(shè)備，包括存儲器和泵；微芯片包括具有凹槽的薄片和載玻片，薄片放置在載玻片上形成一個微流體通道；該微流體通道連接在該存儲器與該泵之間，允許該血液樣本從存儲器流到泵；多個磁鐵位于該載玻片旁，沿著載玻片的長度形成梯度的磁場分布，載玻片用來采集稀有細胞；在血液樣本內(nèi)放入磁性納米粒子，磁性納米粒子表面帶有抗體，通過免疫反應(yīng)吸附在目標細胞上，然后將稀有細胞已被標記的血液樣本置放到存儲器內(nèi)，泵啟動后，血液樣本通過微流體通道時，血液樣本中的附著有磁性納米粒子的稀有細胞可以被磁鐵吸引。
文檔編號C12M1/42GK202912963SQ2012205252
公開日2013年5月1日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者張曉晶, 沈挺 申請人:寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司