鞘磷脂的測定方法和測定用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于簡便并且準(zhǔn)確地測定樣本中的鞘磷脂的方法和試劑盒。一種樣本中的鞘磷脂的測定方法，其特征在于，使樣本與不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并測定生成的過氧化氫。
【專利說明】鞘磷脂的測定方法和測定用試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鞘磷脂的測定方法和測定用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]在血液中含有高密度脂蛋白(以下簡記為HDL)、低密度脂蛋白(以下簡記為LDL)、極低密度脂蛋白(以下簡記為VLDL)、乳糜微粒(以下簡記為CM)等脂蛋白。各脂蛋白的膽固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白質(zhì)等構(gòu)成成分的比例不同，在生物體內(nèi)具有不同的作用。在脂蛋白中主要含有三種磷脂，即，磷脂酰膽堿(以下簡記為PC)、溶血磷脂酰膽堿(以下簡記為LPC)、鞘磷脂(以下簡記為SM)。
[0003]在這三種磷脂中，PC和SM為主要的磷脂，分別占全部磷脂的約7成和約2成。已知SM蓄積在人和動物模型的粥樣斑塊(Atheroma)中。存在于人的動脈硬化斑塊中的LDL，與血漿中的LDL相比，含有更多的SM(非專利文獻(xiàn)I)。
[0004]另一方面，在人的臨床研究中也顯示出血漿中的SM和SM/PC比率是相對于缺血性心臟病而言獨(dú)立的危險(xiǎn)因素(非專利文獻(xiàn)2~4)。
[0005]至今，作為SM的測定方法，報(bào)道了使用薄層色譜的方法和使用高效液相色譜的方法(非專利文獻(xiàn)5)，但具有操作煩雜且測定需要長時(shí)間等缺點(diǎn)。另外，也報(bào)道了利用來源于細(xì)菌的鞘磷脂酶的酶測定法(專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。本測定法為如下方法:將鞘磷脂通過細(xì)菌的鞘磷脂酶水解成磷酸膽堿和N-?；拾贝迹瑢⑸傻牧姿崮憠A通過堿性磷酸酶水解成膽堿，使生成的膽堿與膽堿氧化酶反應(yīng)，測定生成的過氧化氫，由此，測定鞘磷脂。但是，本測定法具有因使用堿性磷酸酶而產(chǎn)生的對其他測定項(xiàng)目的測定的影響、鞘磷脂酶與SM —起同LPC反應(yīng)的特異性等問 題(非專利文獻(xiàn)6)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本特表2009-519713號公報(bào)
[0009]非專利文獻(xiàn)
[0010]非專利文獻(xiàn)I Circulation, Vol.110 (22)，ρ.3465-3471 (2004).[0011]非專利文獻(xiàn)2:Arterioscler Thromb Vasc Biol., Vol.20, p.2614-2618 (2000).[0012]非專利文獻(xiàn)3:Nutrition&Metabolism, Vol.3, p.5 (2006).[0013]非專利文獻(xiàn)4:Am.J.Epidemiol., Vol.163，p.903-912 (2006).[0014]非專利文獻(xiàn)5:Dairy Sc1.，Vol.88，p.482-488 (2005).[0015]非專利文獻(xiàn)6:Biol.Pharm.Bull.Vol.27, p.1725-1729(2004).
【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的問題
[0017]本發(fā)明的目的在于，提供用于簡 便并且準(zhǔn)確地測定樣本中的SM的方法和試劑盒。
[0018]用于解決問題的方法[0019]本發(fā)明人為了解決上述問題而進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)，在選擇性地測定含有PC、LPC和SM的樣本中的SM的方法中，通過使用不與使LPC與溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶反應(yīng)而生成的甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)但與SM反應(yīng)的磷脂酶D，能夠特異性地測定SM，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下的[I]~[17]。
[0020][I] 一種樣本中的SM的測定方法，其特征在于，使樣本與不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并測定生成的過氧化氫。
[0021][2] 一種樣本中的SM的測定方法，其特征在于，使樣本與不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶反應(yīng)，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶反應(yīng)，并測定生成的過氧化氫。
[0022][3]如[I]所述的方法，其中，在過氧化氫酶存在下進(jìn)行樣本與不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶的反應(yīng)，在過氧化氫酶抑制劑存在下進(jìn)行樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶的反應(yīng)。
[0023][4]如[2]所述的方法，其中，在過氧化氫酶存在下進(jìn)行樣本與不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶的反應(yīng)，在過氧化氫酶抑制劑存在下進(jìn)行樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的 磷脂酶D、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶的反應(yīng)。
[0024][5]如[3]或[4]所述的方法，其中，過氧化氫酶抑制劑為疊氮化物。
[0025][6]如[I]或[2]記載的方法，其中，在過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體中的一個(gè)存在下進(jìn)行過氧化氫的消去，在過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體存在下進(jìn)行過氧化氫的測定。
[0026][7]如[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的方法，在過氧化物酶和無色型色原體存在下進(jìn)行過氧化氫的測定。
[0027][8]如[I]~[7]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，不與SM和LPC反應(yīng)而是與PC反應(yīng)的磷脂酶D為來源于鏈霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
[0028][9]如[I]~[8]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D為來源于色褐鏈霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
[0029][10] 一種樣本中的SM測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿氧化酶和過氧化氫酶的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D和過氧化氫酶抑制劑的第二試劑。
[0030][11] 一種樣本中的鞘磷脂測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿氧化酶、過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體中的一個(gè)的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D和氧化偶合發(fā)色型色原體中的另一個(gè)的第二試劑。
[0031][12] 一種樣本中的鞘磷脂測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿脫氫酶、氧化型輔酶、還原型輔酶氧化酶和過氧化氫酶的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D和過氧化氫酶抑制劑的第二試劑。
[0032][13] 一種樣本中的SM測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與SM和LPC反應(yīng)而是與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿脫氫酶、氧化型輔酶、還原型輔酶氧化酶、過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體中的一個(gè)的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D和氧化偶合發(fā)色型色原體中的另一個(gè)的第二試劑。
[0033][14]如[10]或[12]所述的試劑盒，其中，過氧化氫酶抑制劑為疊氮化物。
[0034][15]如[10]、[12]或[14]所述的試劑盒，其中，過氧化物酶和無色型色原體分別
包含在第一試劑和第二試劑中。
[0035][16]如[10]~[15]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D為來源于鏈霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
[0036][17]如[10]~[16]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，不與甘油_3_磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D為來源于色褐鏈霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
[0037]發(fā)明效果
[0038]根據(jù)本發(fā)明，能提供用于簡便并且準(zhǔn)確地測定樣本中的SM的方法和試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1是表示實(shí)施例1的試劑盒(試劑盒A~F)的對SM、LPC和PC各磷脂的標(biāo)準(zhǔn)溶液的“吸光度”的圖?？v軸表示吸光度(HiAbs)，橫軸表示各試劑盒(試劑盒A~F)?？诒硎維M, 表示PC,包圍虛線表示LPC。
[0040]圖2表示使用實(shí)施例2的試劑盒的測定與使用對照試劑盒的測定之間的相關(guān)圖?？v軸表示通過使用實(shí)施例2的測定確定的樣本中的SM濃度(mg/dL)，橫軸表示通過使用對照試劑盒的測定確定的樣本中的SM濃度(mg/dL)。
[0041]圖3是表示使用實(shí)施例2的試劑盒的測定中的SM濃度與吸光度之間的關(guān)系的圖?？v軸表不吸光度(mAbs),橫軸表不SM濃度(mg/dL)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0042]〈SM的測定方法>
[0043]本發(fā)明的SM測定方法為不需要SM的分離操作的方法。
[0044]本發(fā)明的SM的測定方法為一種樣本中的SM的測定方法，其特征在于，使樣本與不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并測定生成的過氧化氫。具體而言，可以列舉包括下述步驟的方法。
[0045](I)使樣本與不與SM和LPC反應(yīng)而與PC反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶反應(yīng)而生成過氧化氫、甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸的步驟；
[0046](2)消去步驟(1)中生成的過氧化氫的步驟；
[0047](3)使步驟(2)后的反應(yīng)液中的SM與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與SM反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶反應(yīng)而生成過氧化氫的步驟；和
[0048](4)測定步驟(3)中生成的過氧化氫的步驟。
[0049]作為上述步驟(1)中的樣本，使用SM濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)品，通過上述步驟進(jìn)行測定，制作表示SM濃度與測定值之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，使用實(shí)際的樣本，通過上述步驟進(jìn)行測定，將所得到的測定值與預(yù)先制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，由此，能夠確定樣本中的SM濃度。
[0050]另外，作為步驟(3)中使用的膽堿氧化酶，可以為步驟(1)中使用的膽堿氧化酶，也可以為新添加的膽堿氧化酶。
[0051]將通過上述步 驟進(jìn)行的本發(fā)明的SM的測定方法的原理圖示于表1。
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種樣本中的鞘磷脂的測定方法，其特征在于，使樣本與不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶反應(yīng)，并測定生成的過氧化氫。
2.—種樣本中的鞘磷脂的測定方法，其特征在于，使樣本與不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶反應(yīng)，并消去生成的過氧化氫，接著，使樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶反應(yīng)，并測定生成的過氧化氫。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在過氧化氫酶存在下進(jìn)行樣本與不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、以及膽堿氧化酶的反應(yīng)，在過氧化氫酶抑制劑存在下進(jìn)行樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D、以及膽堿氧化酶的反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，在過氧化氫酶存在下進(jìn)行樣本與不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶的反應(yīng)，在過氧化氫酶抑制劑存在下進(jìn)行樣本與不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D、氧化型輔酶、膽堿脫氫酶以及還原型輔酶氧化酶的反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，過氧化氫酶抑制劑為疊氮化物。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體中的一個(gè)存在下進(jìn)行過氧化氫的消去，在過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體存在下進(jìn)行過氧化氫的測定。
7.如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在過氧化物酶和無色型色原體存在下進(jìn)行過氧化氫的測定。
8.如權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D為來源于鏈霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
9.如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D為來源于色褐鏈霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
10.一種樣本中的鞘磷脂測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿氧化酶和過氧化氫酶的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D和過氧化氫酶抑制劑的第二試劑。
11.一種樣本中的鞘磷脂測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿氧化酶、過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體中的一個(gè)的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D和氧化偶合發(fā)色型色原體中的另一個(gè)的第二試劑。
12.—種樣本中的鞘磷脂測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿脫氫酶、氧化型輔酶、還原型輔酶氧化酶和過氧化氫酶的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D和過氧化氫酶抑制劑的第二試劑。
13.一種樣本中的鞘磷脂測定用試劑盒，其特征在于，包含:含有不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D、溶血磷脂酶或單甘油脂肪酶、膽堿脫氫酶、氧化型輔酶、還原型輔酶氧化酶、過氧化物酶和一對氧化偶合發(fā)色型色原體中的一個(gè)的第一試劑；以及含有不與甘油-3-磷酸膽堿和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D和氧化偶合發(fā)色型色原體中的另一個(gè)的第二試劑。
14.如權(quán)利要求10或12所述的試劑盒，其中，過氧化氫酶抑制劑為疊氮化物。
15.如權(quán)利要求10、12或14所述的試劑盒，其中，過氧化物酶和無色型色原體分別包含在第一試劑和第二試劑中。
16.如權(quán)利要求10~15中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，不與鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿反應(yīng)而與磷脂酰膽堿反應(yīng)的磷脂酶D為來源于鏈霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
17.如權(quán)利要求10~16中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，不與甘油-3-磷酸膽堿 和游離脂肪酸反應(yīng)而與鞘磷脂反應(yīng)的磷脂酶D為來源于色褐鏈霉菌(Streptomyceschromofuscus)的憐脂酶 D。
【文檔編號】C12Q1/26GK103717748SQ201280037421
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月29日
【發(fā)明者】木村豪秀, 宮內(nèi)一人, 桑田英之 申請人:協(xié)和梅迪克斯株式會社