新型肽、含有所述新型肽的組合物及其在用于治療代謝、心臟和免疫相關疾病的方法中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及顯示代謝調節(jié)以及免疫調節(jié)性質的多肽、編碼所述多肽的核酸、含有所述多肽的組合物以及包含施用所述多肽的治療代謝紊亂和/或免疫相關疾病的方法；以及所述多肽在制備用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂和免疫相關疾病中至少一種發(fā)作的藥物組合物中的用途。
【專利說明】新型肽、含有所述新型肽的組合物及其在用于治療代謝、心臟和免疫相關疾病的方法中的用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及顯示代謝調節(jié)以及免疫調節(jié)性質的新型肽。更具體地，本發(fā)明提供新型肽，其能夠改善與糖尿病相關的代謝參數(shù)及其發(fā)病機理、以及其它代謝紊亂如代謝綜合征、還有免疫相關疾病和心臟疾病。本發(fā)明也針對含有所述肽的組合物、包含其施用的治療方法及其在制備所述組合物中的用途。
【背景技術】
[0002]在這部分的討論不限于有資格作為本發(fā)明“現(xiàn)有技術”的主題。因此，不承認由于在這種討論中納入了特定主題而應該隱含或推斷出這樣的現(xiàn)有技術狀態(tài)，也沒有聲明由于這種納入應隱含對本發(fā)明人的目的的反對。
[0003]在本申請中提到的所有公開通過參考其全部并入本文，包括在其中引用的所有參考。
[0004]碳水化合物代謝紊亂以多種形式存在。最常見的疾病是獲得性的。碳水化合物代謝的獲得性或繼發(fā)性紊亂，諸如糖尿病性酮酸中毒、高滲性昏迷和低血糖都影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。外周神經(jīng)疾病的許多形式和變種也見于糖尿病。碳水化合物代謝的其余疾病是罕見的先天性代謝缺陷(即遺傳缺陷)。
[0005]碳水化合物代謝的獲得性疾病在美國和國際上是相當常見的。在酗酒者和使用胰島素治療的糖尿病患者中，低血糖是神經(jīng)疾病，特別是急性精神衰退、失憶、定向障礙、遲鈍和昏迷的常見原因。來自其它原因的高胰島素血癥很少，但胰腺腫瘤可以是原因。
[0006]糖尿病(糖尿病)是最常見的內分泌疾病，特征在于葡萄糖代謝異常。異常葡萄糖代謝與導致高血糖癥(高的血液葡萄糖水平)的這種疾病相關，并最終導致多器官系統(tǒng)的并發(fā)癥、包括眼睛、腎臟、神經(jīng)和血管。持續(xù)高血糖的患者或異常葡萄糖耐量的患者通常診斷患有這種疾病，雖然最常見的患者起初存在過度排尿(多尿癥)和常因極度口渴(煩渴)而頻繁飲水。這種典型的起始癥狀由高血糖的滲透作用所導致。
[0007]糖尿病的發(fā)病機理通常與胰腺機能障礙相關，特別是朗格漢氏胰島β細胞。這種機能障礙可導致產(chǎn)生胰島素(一種葡萄糖調節(jié)肽激素)的島β細胞破壞。通常將糖尿病分類為胰島素依賴型或I型，與之相對的非胰島素依賴型或II型。
[0008]主要的三種形式或糖尿病是:
[0009]-1型:由身體不能產(chǎn)生胰島素所導致。治療通常涉及施用胰島素。
[0010]-1I型:由身體不能正確使用胰島素的情況所導致，并伴有相關的胰島素缺乏。許多人經(jīng)歷多年的糖尿病前期狀態(tài)，他們注定發(fā)展為II型糖尿病，其中當人的血液葡萄糖水平高于正常但并未高至足以診斷為II型糖尿病時發(fā)生的情況即糖尿病前期。
[0011]-妊娠糖尿病:之前從未得糖尿病但孕期具有高血糖(葡萄糖)水平的孕婦被認為具有妊娠糖尿病。妊娠糖尿病影響全部孕婦的約4%。其可先于II型(或罕見I型)的發(fā)展。
[0012]-許多其它形式的糖尿病從中分開歸類。實例包括因胰島素分泌的遺傳缺陷所導致的先天性糖尿病、囊性纖維化相關的糖尿病、由高劑量糖皮質激素誘導的類固醇糖尿病、以及幾種形式的單基因糖尿病。
[0013]然而，隨著所述疾病已得到更好理解，這種術語已進化。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些患有非胰島素依賴型糖尿病的患者中，所述疾病進展為胰島素依賴型形式，而在其它患者中胰島素依賴并未發(fā)展。
[0014]因此，常依據(jù)島破壞的發(fā)病機理的機制將患者分類，I型的指定現(xiàn)在常用于指自身免疫性島的發(fā)病機理，即由島特異的自身免疫性攻擊所導致的糖尿病，并在本文中如此使用。術語胰島素依賴型糖尿病(IDDM)指已經(jīng)進展到這樣一種階段的I型糖尿病，所述階段中已發(fā)生的胰β細胞的自身免疫性破壞足以產(chǎn)生明顯癥狀。術語前IDDM指可通過活檢或自身免疫反應分析所檢測到的自身免疫情況，其中胰島β細胞受到特異性自身免疫攻擊以至于其中一些細胞可能受到破壞的程度。然而，在前IDDM中所述破壞(如果存在的話)還未進展到足以需要施用胰島素的程度。因此，在I型糖尿病的早期可以有一個點，其中雖然觀察到明顯癥狀但某些島功能依然保持(已知為“蜜月期”)，所以不是所有I型糖尿病都被分類為IDDM，也不是所有前IDDM都沒有明顯癥狀存在。
[0015]由胰島素不足所導致的異常代謝相關的代謝并發(fā)癥可影響很多器官系統(tǒng)。最常見的急性代謝并發(fā)癥是糖尿病酮酸中毒，其特征為嚴重的高血糖(并產(chǎn)生由滲透性利尿所導致的血容量減少)以及由過度的游離脂肪酸釋放和酮體產(chǎn)生所引發(fā)的代謝性酸中毒。
[0016]除了酮酸中毒的急性代謝并發(fā)癥，糖尿病患者易感一系列晚期并發(fā)癥，其導致相當?shù)陌l(fā)病率和過早死亡率。因為在葡萄糖和脂質代謝兩者中的異常，動脈粥樣硬化在糖尿病患者中比一般群體中更廣泛和更早地發(fā)生。這種血管病理可導致，尤其冠狀動脈疾病、中風、以及有壞疽的外周血管疾病。視網(wǎng)膜病是另一種糖尿病的血管并發(fā)癥。糖尿病視網(wǎng)膜病是導致失明的主要原因，通過增加視網(wǎng)膜毛細血管的滲透性而開始，其可進展為閉塞、出血、形成動脈瘤和已知作為增殖·性視網(wǎng)膜病的新血管形成。
[0017]如上述，謹慎控制血液葡萄糖已與改善I型糖尿病晚期并發(fā)癥相關，其說明保留或恢復β細胞功能可減少或消除所述疾病的大部分病理并發(fā)癥。
[0018]碳水化合物代謝的遺傳疾病很少。已在很少的患者中報告丙酮酸脫氫酶(TOH)復合物的嚴重缺陷和稱為戊糖尿的良性化學異常。
[0019]低血糖、糖尿病性酮酸中毒和高滲性昏迷都可能是致命的，但又是可能治愈的疾病。
[0020]碳水化合物代謝紊亂常與其它代謝紊亂相關，一起形成代謝綜合征。代謝綜合征是一起發(fā)生時增加發(fā)展為心血管疾病和糖尿病風險的醫(yī)學疾病組合。其影響美國五分之一的人，并且流行率隨著年齡增加。一些研究顯示，據(jù)估計在美國流行率達人口的25%。
[0021]在本申請中，發(fā)明人提出新型肽，其顯示令人驚訝的改善代謝指標的能力，因此改善患有代謝紊亂患者的情況、防止在所述患者中惡化、或推遲發(fā)作或為這種疾病提供有效的預防。
[0022]因此，本發(fā)明的目的是提供本發(fā)明的肽。本發(fā)明也提供包含所述肽的組合物、及其在治療中的用途。
[0023]本發(fā)明的這些和其它用途和目的將隨著描述進展而變得明顯。
【發(fā)明內容】

[0024]在第一方面，本發(fā)明提供分離的多肽，其包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。應注意到，所述多肽是類激素蛋白，在本文中也分別被稱為APC2、PRT10或UZI#1 ;APC3、PRT9或UZI#2 ;以及APC4、PRTll 或 UZI#3。
[0025]在第二方面，本發(fā)明提供包含編碼多肽的序列的分離的核酸分子，所述多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物和類似物。應注意，本發(fā)明肽片段的非限制性實例也分別如SEQ ID N0.13、14和
15所示。
[0026]本發(fā)明進一步提供核酸構建體，其包含如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.6或SEQ IDN0.10中任一個所示的核酸序列、或任何其衍生物、突變體、片段或同系物。所述構建體可選地進一步包含可操作地連接的調控元件。進一步地，本發(fā)明提供含有根據(jù)本發(fā)明的核酸構建體的表達載體、以及使用根據(jù)本發(fā)明的表達載體所轉化或轉染的宿主細胞。
[0027]在又一方面，本發(fā)明提供組合物，所述組合物含有至少一種分離的多肽、或編碼所述分離的多肽的核酸序列，所述分離的多肽包含如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.5或SEQ IDN0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。所述組合物可選地進一步包含藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0028]此外，根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂、心臟疾病和免疫相關疾病中至少一種發(fā)作的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種分離的多肽、或編碼分離多肽的核酸序列、以及藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述分離的多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。
[0029]在另一方面，本發(fā)明提供用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂、心臟疾病和免疫相關疾病中至少一種發(fā)作的方法。所述方法包括如下步驟:向需要其的受試者施用至少一種治療有效量的分離的多肽、編碼分離多肽的核酸序列、任何其組合或混合物或者包含其的任何組合物，所述分離的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0030]在又一方面，本發(fā)明針對至少一種分離的多肽、或編碼分離多肽的核酸序列在制備組合物中的用途，所述分離的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。所述組合物適用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂、心臟疾病和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作。
[0031]在又一方面，發(fā)明提供分離的多肽，其用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病、心臟疾病和代謝紊亂中至少一種的發(fā)作。所述多肽包含如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。
[0032]本發(fā)明也提供用于增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平的方法，所述方法包括如下步驟:向需要其的受試者施用至少一種治療有效量的分離的多肽、編碼分離多肽的核酸序列、任何其組合或混合物或者包含其的任何組合物，所述分離的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0033]本發(fā)明的這些和其它方面將借助下列附圖變得明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1
[0035]APC-2肽影響葡萄糖耐量
[0036]如所述，在腹膜內施用(2g/Kg體重)葡萄糖注射后，顯示用載體(粉色)、0.25mg/Kg(深藍色線)、1.5mg/Kg(黃色線)、或15mg/Kg(淺藍色線)的APC-2所處理的小鼠中的小鼠血液葡萄糖水平。
[0037]所有點的SD都低于12%。
[0038]圖2
[0039]APC-2妝影響血衆(zhòng)膜聞血糖素水平
[0040]顯示如所述使用指定的APC-2劑量所處理的小鼠中的小鼠血液胰高血糖素水平。[0041 ] 所有點的SD都低于12%。
[0042]圖3A-3C
[0043]APC-2肽增加在脾細胞中的胰島素受體和GLUT-4表達
[0044]顯示在小鼠中的HPR·T、胰島素受體和GLUT-4的Northern印跡分析，所述小鼠如所述使用指定的 APC-2 劑量(C[對照];5 [0.25mg/Kg 體重];30 [1.5mg/Kg 體重];300 [15mg/Kg體重])處理。
[0045]圖3A:HPRT 的 Northern 印跡分析。
[0046]圖3B:胰島素受體的Northern印跡分析。
[0047]圖3C:GLUT_4 的 Northern 印跡分析。
[0048]圖4A-4B
[0049]APC-3肽減少TNF α和IL-1 β的水平
[0050]顯示在如所述使用指定的APC-3劑量所處理的小鼠中的血清細胞因子水平。
[0051]圖4Α:TNFa血清水平分析。
[0052]圖4B:IL-1 β血清水平分析。
【具體實施方式】
[0053]本發(fā)明此處提供進行代謝和免疫相關參數(shù)調節(jié)性質的新型肽。因此，在第一方面，本發(fā)明提供分離的多肽，其包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。
[0054]術語“肽”，其也可稱為在本文可互換的“蛋白質”或“多肽”，其指氨基酸殘基的聚合物以及不限于所述產(chǎn)物的最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等都包括在定義內。定義包括全長蛋白和其片段兩者。所述術語也包括多肽的翻譯后表達修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。此外，出于本發(fā)明的目的，“肽”或“蛋白”指包括對天然序列的修飾的肽，例如刪除、添加和取代(通常在性質上保守)，所以只要蛋白保留所需活性，即如本說明書中所述的免疫誘導和/或代謝作用，即增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、增加胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達和減少TNF a的血清水平以及減少血清IL-Ιβ。這些修飾可以是有意的，如通過定點誘變，或者可以是偶然的，例如通過生產(chǎn)所述蛋白的宿主的突變或者由于編碼所述蛋白的核酸的PCR擴增錯誤。
[0055]術語“分離的”或“純化的”指從其天然環(huán)境移出的分子，如氨基酸序列、或肽，分離的或分開的。因此，“分離的肽”是純化的氨基酸序列?！盎炯兓摹狈肿邮侵辽?0%不含，優(yōu)選至少75%不含，以及更優(yōu)選地至少90%不含其它天然伴隨的成分。如本文所用，術語“純化的”或“純化”也指從樣本中除去污染物。
[0056]如本文所用的術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸、以及與天然存在的氨基酸以相似的方式行使功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是遺傳密碼所編碼的那些、以及后來得到修飾的那些氨基酸，如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。“氨基酸類似物”指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學結構的化合物，即與氫結合的α碳、羧基、氨基和R基，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的R基或修飾的肽骨架，但仍保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構?！鞍被崮M物”指這樣的化學化合物，其具有的結構與氨基酸的一般化學結構不同，但以天然存在的氨基酸相似的方式行使功能。在本文中氨基酸可通過眾所周知的3字母符號指代、或者通過IUPAC-1UB生物化學命名委員會推薦的I字母符號指代。
[0057]“氨基酸序列”或“肽序列”是以肽鍵連接的氨基酸殘基位于肽和蛋白鏈中的順序。所述序列通常從含有游離氨基的N末端端向含有游離羧基的C末端端報告。如果氨基酸序列代表蛋白的一級結構，那么氨基酸序列常稱為肽、蛋白序列；然而必須分清術語“氨基酸序列”或“肽序列”與“蛋白”之間的差別，因為蛋白定義為折疊成特定三維構型并且通常經(jīng)過翻譯后修飾(如磷酸化、乙?；?、糖基化、二硫鍵形成、切割等等)的氨基酸序列。
[0058]應當理解，本發(fā)明不僅提供具體的肽，而且還包括這些肽的任何功能片段?！捌巍苯M成所述氨基酸的部分或者是特定區(qū)的DNA序列。肽序列的片段比特定區(qū)短至少一個氨基酸；DNA序列的片段比特定區(qū)短至少一對堿基對。所述片段可在C端或N端側或者兩側被截短。氨基酸片段可包含SEQ ID N0.1的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至 少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27或至少28個氨基酸殘基；SEQ ID N0.5的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27或至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33或至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40個氨基酸；以及SEQ ID N0.9的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少
9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27或至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33或至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、或至少46個氨基酸。
[0059]功能片段的非限制性實例可包括SEQ ID N0.13、14和15的肽，其分別為SEQ IDN0.1、5和9的肽的功能片段。更具體地，SEQ ID N0.13的肽是如SEQ ID N0.1所示的APC2肽的功能片段。在另一實施方案中，SEQ ID N0.14的肽是如SEQ ID N0.5所示的APC3肽的功能片段。還有，SEQ ID N0.15的肽是如SEQ ID N0.9所示的APC4肽的功能片段。[0060]分子的“類似物”可以是來自相同物種或來自不同物種的同源分子。類似物或衍生物的氨基酸序列可與原始序列不同，其中將至少一個殘基刪除、插入或取代。
[0061]更進一步，本發(fā)明關注本發(fā)明氨基酸序列的衍生物。本發(fā)明氨基酸序列的衍生物是，例如其中官能團如氨基、羥基、疏基或羧基分別被衍生，如糖基化、酰基化、酰胺化或酯化。在糖基化的衍生物中，寡糖常連接至天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和/或賴氨酸。?；苌锾貏e通過天然存在的有機或無機酸如醋酸、磷酸或硫酸而被酰化，其通常發(fā)生在N端氨基或羥基，特別分別是酪氨酸或絲氨酸的氨基或羥基。酯類是那些天然存在的醇，如甲醇或乙醇。其它衍生物是鹽、尤其是藥學可接受的鹽，例如金屬鹽如堿金屬和堿土金屬鹽，如鈉、鉀、鎂、鈣或鋅鹽，或者與氨或合適的有機胺一起形成的銨鹽，所述有機胺例如低級烷基胺(alkyamine),如三乙胺、羥基-低級烷基胺(hydroxy-lower alkylamine)如2_輕乙胺等等
[0062]應當理解，通過本文所用的術語“插入”，其意思是對本發(fā)明序列的氨基酸殘基的任何添加，添加在I至50個之間的氨基酸殘基，特別地在20至I個之間的氨基酸殘基，以及更特別地在I至10個之間的氨基酸殘基。最特別地，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10個氨基酸殘基。此外，可使用各種相同或不同的氨基酸殘基將本發(fā)明的氨基酸序列在其N末端和/或C末端延伸。
[0063]氨基酸“取代”是使用另一個具有相似結構和/或化學性質的氨基酸取代一個氨基酸的結果，即保守的氨基酸取代?；谒婕暗臍埢跇O性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性質的相似性可進行氨基酸取代。例如，非極性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和 組氨酸；以及帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0064]關于氨基酸序列，技術人員將認識到:在編碼序列中改變、添加或刪除了單個氨基酸或小百分比氨基酸的對氨基酸、核酸、肽、多肽或蛋白序列的個體取代、刪除或添加，是“保守修飾的變體”，其中改變導致氨基酸被化學相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領域公知的。這種保守修飾的變體除此之外，并不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同系物以及等位基因。
[0065]例如，可進行取代，其中脂肪族氨基酸(G、A、1、L或V)被組中另一成員所取代；或者諸如一個極性殘基被另一個極性殘基，如精氨酸被賴氨酸、谷氨酸被天冬氨酸、或者谷氨酰胺被天冬酰胺所取代的取代。下列8組的每個都包含其它示范的氨基酸，其對另一個而言是保守的取代:
[0066]I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
[0067]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0068]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0069]4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；
[0070]5)異亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；
[0071]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；
[0072]7)絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴；以及
[0073]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。[0074]保守的核酸取代是導致如上定義的保守氨基酸取代的核酸取代。
[0075]本發(fā)明的氨基酸序列的變體分別與SEQ ID N0.1、5和9所示肽中的任一個在氨基酸水平上可具有至少80%的序列相似性，常常至少85%的序列相似性，90%的序列相似性，或至少95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性。
[0076]應理解，本發(fā)明涉及如SEQ ID N0.1、5和9所示的氨基酸序列的任何功能片段、衍生物或類似物。如本文所用，術語“功能片段”、“功能衍生物”或“功能類似物”指具有通過特定的功能分析所鑒定的生物功能或活性的氨基酸序列。更具體地，所述特定的功能分析是對本發(fā)明肽所影響的任何參數(shù)的分析，即葡萄糖耐量、血漿胰高血糖素水平、胰島素受體表達、GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達以及TNFa和IL-1 β的血清水平。
[0077]根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明分離的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC2、PRTlO或UZI#1。
[0078]在某些實施方案中，本發(fā)明的肽表達在人類白細胞和心臟中的至少一個。
[0079]“表達”在此解釋為將基因轉錄成mRNA和/或翻譯成多肽的過程。更具體地，當指在具體組織(tissue)或多組織(tissues)中肽的表達時,意思是所述轉錄物和/或肽以具有功能(即誘導相關作用)的顯著量進行表達。
[0080]根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明的分離多肽包含SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC3、PRT9或UZI#2。
[0081]在某些實施方案中，本發(fā)明的肽表達在人類的脾臟、睪丸、小腸、結腸和腎中的至少一個。
·[0082]根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明的分離多肽包含SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC4、PRTll或UZI#3。
[0083]在某些實施方案中，本發(fā)明的肽表達在人類脾臟、睪丸、結腸、小腸、白細胞、心臟、胎盤、肝臟、腎臟和胰腺中的至少一個。
[0084]在某些實施方案中，本發(fā)明的肽可以是類激素分泌肽。
[0085]如下列實施例所示，本發(fā)明的肽能夠進行下列中的至少一個:增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、增加胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、和減少TNFa的血清水平以及減少血清IL-1 β。
[0086]通常當使用時，術語增加、提高或增大涉及誘導在值、方法、現(xiàn)象或表型(指例如某些化合物的血清水平)上的增加、提高或增大。所述增加、提高或增大也可是至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、I1%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、約100%或甚至更多。
[0087]本文所用術語“抑制”意思是限制、阻礙、降低、減小或縮減方法、現(xiàn)象或表型至少約 1%-100%、約 5%-95%、約 10%-90%、約 15%_85%、約 20%_80%、約 25%_75%、約 30%_70%、約35%-65%、約40%-60%或約45%_55%。所述方法、現(xiàn)象或表型的限制、阻礙、降低、減小或縮減也可以是至少約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或約 100%。
[0088]因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的肽可有效治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病或代謝紊亂的發(fā)作。
[0089]在具體的實施方案中，本發(fā)明的肽有效治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或者任何包含所述代謝綜合征的病況的發(fā)作。更具體地，代謝綜合征或者任何包含代謝綜合征的病況可以是下列中的至少一種:異常脂蛋白血癥(高甘油三酸酯血癥、高膽固醇血癥、低HDL膽固醇)、肥胖、NIDDM (非胰島素依賴型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受損)、血液凝固、血纖維蛋白溶解缺陷和高血壓。
[0090]在其它實施方案中，本發(fā)明的肽能夠在需要其的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
[0091]在某些實施方案中，本發(fā)明的肽是免疫調節(jié)的。本文所用的術語“調節(jié)”或“調節(jié)的”，例如比如調節(jié)免疫反應或病況，其包括在某種條件下活性或反應相對于對照或活性或反應的正?；蚧€水平的增加或減小。其也可包括在通常增加或減小肽活性或反應水平的條件下維持活性或反應的水平。
[0092]在某些具體實施方案中，本發(fā)明的肽可調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡朝向抗炎性的Th2、Thl/Th3反應可特別 適用于具有不希望的非平衡促炎Thl反應的免疫相關疾病。例如，這種免疫相關疾病可以是自身免疫疾病、移植排斥病理和炎癥疾病。
[0093]本發(fā)明提供具有代謝調節(jié)性質的新型肽。因此應當理解，此外本發(fā)明也涉及本發(fā)明提供的核酸序列、以及編碼以上氨基酸序列的那些。
[0094]因此，在第二方面，本發(fā)明提供含有編碼多肽的序列的分離核酸分子，所述多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物和類似物。
[0095]如本文所用，術語“核酸”指核苷酸的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈，其是多核苷酸如脫氧核糖核酸(DNA)和在適當情況下的核糖核酸(RNA)。應當理解，所述術語也包括由核苷酸類似物制成的RNA或DNA的等同物、類似物以及適用于所述實施方案的單鏈(如正義或反義)和雙鏈多核苷酸。本文所用的術語DNA也包括cDNA，即通過反轉錄操作(RNA依賴的DNA聚合酶)從RNA模板產(chǎn)生的互補或拷貝DNA。
[0096]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的分尚核酸分子，其包含如SEQ ID N0.2所不的核酸序列、或任何其衍生物、突變體、片段或同系物，所述分離核酸分子編碼含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的多肽。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC2、PRT10或UZI#1。
[0097]根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明的分尚核酸分子，其包含如SEQ ID N0.6所不的核酸序列、或任何其衍生物、突變體、片段或同系物，所述分離核酸分子編碼含有如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列的多肽。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC3、PRT9或UZI#2。[0098]根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明的分離核酸分子，其包含如SEQ ID N0.9所示的核酸序列、或任何其衍生物、突變體、片段或同系物，所述分離核酸分子編碼含有如SEQ IDN0.10所示的氨基酸序列的多肽。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC4、PRT11或UZI#3。
[0099]根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，還提供分離的核酸分子，其僅由于遺傳密碼的簡并性而在密碼子序列中區(qū)別于SEQ ID N0.2、6和10中任一個所示的核酸分子。
[0100]由于遺傳密碼的簡并性質，很清楚多個不同的核酸序列可用于編碼本發(fā)明的氨基酸序列。應當理解，可將本發(fā)明的核酸序列中包含的密碼子優(yōu)化(密碼子優(yōu)化的)以在任何具體宿主細胞中表達，優(yōu)選在能夠大量表達所需肽的宿主細胞中，以及最優(yōu)選地以商業(yè)量表達所述肽。
[0101]術語“密碼子優(yōu)化的”指用于轉化各種宿主的核酸分子的基因或編碼區(qū)，其指在核酸分子的基因或編碼區(qū)中，密碼子的改變反映宿主生物的典型密碼子用法而不改變由所述DNA編碼的多肽。
[0102]應當理解，本發(fā)明進一步包括本發(fā)明提供的核酸序列的任何衍生物、突變體、片段或同系物。具體地，可用于本發(fā)明方法、組合物和用途的核酸序列的類似物或同系物可包含至少一個突變、點突變、無義突變、錯義突變、刪除、插入或重排。
[0103]根據(jù)本發(fā)明的序列的核酸片段可包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少
6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少101、至少102、至少103、至少104或至少121個核酸、或甚至更多。
[0104]在第三方面，本發(fā)明提供核酸構建體，其包含如SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.6或SEQID N0.10中任一個所示的核酸序列、或任何其`衍生物、突變體、片段或同系物。所述構建體可選地進一步包含可操作地連接的調控元件。
[0105]如本文所用的“構建體”包括載體(vector)如質粒、病毒、噬菌體、整合DNA片段，以及其它運載體(vehicle)，其能夠使DNA片段整合入宿主基因組中。
[0106]此外，本發(fā)明也提供包含根據(jù)本發(fā)明的核酸構建體的表達載體。
[0107]表達載體通常是自我復制的DNA或RNA構建體，其含有所需基因或其片段、以及可操作連接的遺傳控制元件，遺傳控制元件在合適的宿主細胞中被識別并影響所需基因的表達。這些控制元件能夠在合適的宿主中影響表達。一般來說，遺傳控制元件可包括原核啟動子系統(tǒng)或真核啟動子表達控制系統(tǒng)。其通常包括轉錄啟動子、控制轉錄起始的可選操縱子、提高RNA表達水平的轉錄增強子、編碼合適核糖體結合位點的序列、RNA剪接點、終止轉錄和翻譯的序列等等。表達載體常含有允許載體不依賴宿主細胞進行復制的復制原點。
[0108]載體可額外地包括適當?shù)南拗莆稽c、用于篩選含有載體細胞的抗生素抗性或其它標志物。質粒是最常用的載體形式，但是提供等同功能以及是或成為本領域已知的其它形式的載體也適合用于此。參見例如Pouwels等人，Cloning Vectors:a LaboratoryManual (1985 和增補)，Elsevier, N.Y.;和 Rodriquez 等人(編)Vectors: a Survey ofMolecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988),其以參考并入本文。
[0109]在另一方面，本發(fā)明針對使用根據(jù)本發(fā)明的表達載體所轉化或轉染的宿主細胞。[0110]“細胞”、“宿主細胞”或“重組宿主細胞”是本文可互換使用的術語。應理解，這樣的術語不僅指具體的受試細胞，也指這種細胞的后代或可能的后代。由于突變或環(huán)境影響，某些修飾可發(fā)生在繼代中，所以實際上這樣的后代也許不與親代細胞相同，但是這樣的后代依然包括在本文所用術語的范圍內。
[0111]如本文所用的“宿主細胞”指通過重組DNA技術使用裸DNA或表達載體構建體對其進行重組轉化的細胞?？顾幮曰蚱渌蛇x擇的標志物旨在部分地促進轉化體選擇。此外，可選擇的標志物(如抗藥性標志物)的存在可用于阻止污染微生物在培養(yǎng)介質中繁殖。在需要誘導的表型來生存的條件下，通過培養(yǎng)細胞獲得這種轉化宿主細胞的純培養(yǎng)物。
[0112]使用本文所述的表達載體轉化或轉染本發(fā)明的宿主細胞以表達本發(fā)明的肽。如本文所用的“轉化”指這樣一種過程，其中由于細胞攝取外源DNA或RNA而改變了細胞基因型，以及例如轉化的細胞表達本發(fā)明肽的至少一種重組形式。術語“轉染”意思是:通過核酸介導的基因轉移將核酸如裸DNA或表達載體引入受體細胞。
[0113]在又一方面，本發(fā)明提供組合物，其包含至少一種分離的多肽、或編碼其的核酸序列，所述分離的多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物或類似物。所述組合物可選地進一步包含藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
[0114]在各種實施方案中，包含在本發(fā)明組合物中的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC2、PRTlO 或 UZI#1。
[0115]在一些實施方案中，包含在本發(fā)明組合物中的多肽包含如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC3、PRT9 或 UZI#2。
·[0116]在其它實施方案中，包含在本發(fā)明組合物中的多肽包含如SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。所述多肽是類激素蛋白，在本文中也稱為APC4、PRTll 或 UZI#3。
[0117]如實施例所示，本發(fā)明的肽以及因此還有包含其的組合物，可導致下列中的至少一種:增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平。能夠理解，本發(fā)明的肽和組合物賦予抗炎和代謝有利的作用。這種作用可特別適于治療或預防免疫相關代謝疾病，例如糖尿病和與代謝綜合征相關的并發(fā)癥。
[0118]為利用本發(fā)明的肽和組合物的有益效果，需要適于施用的組合物。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物是用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂、心臟疾病和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作的藥物組合物。
[0119]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的藥物組合物用于治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或者任何包含代謝綜合征的病況的發(fā)作。
[0120]在某些實施方案中，應注意到代謝綜合征或者任何包含代謝綜合征的病況可包括下列中的至少一種:異常脂蛋白血癥(高甘油三酸酯血癥、高膽固醇血癥、低HDL膽固醇)、肥胖、NIDDM (非胰島素依賴型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受損)、血液凝固、血纖維蛋白溶解缺陷和高血壓。[0121]更具體地，如本文所指“代謝紊亂”的實例是代謝綜合征。所述代謝綜合征特征在于在一個人中的一組代謝風險因素，包括:
[0122]腹部肥胖(在腹部和腹部周圍過多的脂肪組織)；致動脈粥樣硬化的血脂障礙(血脂疾病一高甘油三酸酯、低HDL膽固醇和高LDL膽固醇一其在動脈壁促進斑塊積累);升高的血壓；胰島素耐受或葡萄糖耐量不良；血栓前狀態(tài)(如血液中的高纖維蛋白原或纖維蛋白溶酶原激活抑制劑-1);以及促炎狀態(tài)(如血液中升高的C反應蛋白)。具有代謝綜合征的人處于冠狀動脈性心臟疾病和其它與在動脈壁的斑塊積累相關的疾病(如中風和外周血管疾病)以及2型糖尿病的增加的風險中。
[0123]如上述，代謝綜合征是醫(yī)學疾病的組合，當所述醫(yī)學疾病一起發(fā)生時增加發(fā)展為心血管疾病和糖尿病的風險。一些研究已顯示在美國的流行率據(jù)估計是人口的25%。如本文前述，對所述綜合征有許多不同醫(yī)學標準，但一般來說其可包括下列異常醫(yī)學參數(shù)中的一種或更多種:增加的中央型肥胖、血脂障礙(例如，如高甘油三酸酯水平和/或低HDL-C水平所示)、高血壓、高空腹血漿葡萄糖、微白蛋白尿和高hs-CRP水平。
[0124]還不完全了解代謝綜合征的復雜通路的確切機制。病理生理學極其復雜并且僅部分得到闡明。大多數(shù)患者年長、肥胖、久坐不動并有一定程度的胰島素耐受。壓力也可以是起作用的因素。最重要的因素是重量、遺傳、內分泌疾病如在生育年齡婦女中的多囊卵巢綜合征、衰老和久坐不動的生活方式，即身體活動少并且過量的熱量攝取。關于是否肥胖或胰島素耐受是代謝綜合征的原因或者其是更加深遠的代謝紊亂的后果仍有爭議。一些全身炎癥的標志物包括C反應蛋白常常增加，如血纖蛋白原、白介素6 (IL - 6)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)及其它。一些已指向各種原因，包括由膳食果糖所導致的尿酸水平增加。通常將發(fā)展內臟脂肪，在此之后內臟脂肪的脂細胞(脂肪細胞)增加TNF-a的血漿水平并改變一些其它物質(如脂連素、抵抗素、PA1-1)的水平。已證明TNF-a不僅導致產(chǎn)生炎癥細胞因子，而且可能通過與TNF-α受體相互作用觸發(fā)可導致胰島素耐受的細胞信號傳導。慢性炎癥有助于增加高血壓、動脈粥樣硬化和糖尿病的風險。
[0125]在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物適用于治療、改善、預防或推遲II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相`關病況的發(fā)作。世界衛(wèi)生組織識別三種主要形式的糖尿病:1型、2型和妊娠糖尿病(在孕期發(fā)生)，其具有不同原因和人口分布。雖然基本上所有形式都是由于胰腺的β細胞不能產(chǎn)生足夠的胰島素以阻止高血糖，但是原因不同。I型糖尿病通常由于胰腺β細胞的自身免疫破壞。2型糖尿病特征在于靶組織中的胰島素耐受，其導致需要異常高量的胰島素，并且當β細胞不能滿足這種需求時糖尿病發(fā)展。妊娠糖尿病與2型糖尿病相似之處在于其涉及胰島素耐受、妊娠期激素可在遺傳上傾向于發(fā)展成這種病況的婦女中導致胰島素耐受。
[0126]如果所述疾病沒有得到充分控制，糖尿病的急性并發(fā)癥(低血糖、酮酸中毒或非酮病的高滲性昏迷)可發(fā)生。嚴重的長期并發(fā)癥包括心血管疾病(雙重風險)、慢性腎衰竭、視網(wǎng)膜損傷(可導致失明)、(幾種類型的)神經(jīng)損傷以及微血管損傷，其可導致性無能和愈合不良。傷口特別是足的愈合不良可導致可能需要截肢的壞疽。
[0127]本發(fā)明人清楚與血糖升高相關的風險也關注實施方案，其中本發(fā)明的組合物含有至少一種肽、或者編碼所述肽的核酸序列、任何所述肽的組合或混合物或任何含有所述肽的組合物，所述肽包含如SEQ ID N0.1和9所示的序列、任何其片段、衍生物或類似物。這種增強葡萄糖代謝并增加葡萄糖耐量的組合物可導致血清葡萄糖水平的降低。
[0128]更具體地，所述組合物可以是用于治療、改善、預防或推遲心臟疾病發(fā)作的藥物組合物。心臟疾病是泛稱，其可與術語心臟的疾病以及心血管疾病互換使用。心臟疾病指抑制心臟正常功能的任何類型疾病。更具體地，含有心臟疾病的疾病在本文包括，而不限于冠狀動脈心臟病、心肌病、心血管疾病、缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓性心臟病、炎性心臟病和瓣膜性心臟病。
[0129]根據(jù)其它實施方案，所述藥物組合物在需要其的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
[0130]在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病的發(fā)作?！懊庖呦嚓P疾病”是這樣一種病況，所述病況通過激活或抑制免疫系統(tǒng)從而與受試者的免疫系統(tǒng)相關，或者所述病況可通過靶向受試者中免疫反應的某種成分得以治療、阻止或診斷，例如適應性或固有性免疫反應
[0131]免疫相關疾病的實例包括，而非限制于潰瘍性結腸炎、克羅恩病、腸易激病(IBD)、斑禿、紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、美尼爾氏病、抗磷脂綜合征、混合性結締組織病、自身免疫性愛迪生氏病、多發(fā)性硬化、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力、自身免疫性肝炎、尋常天皰瘡、白塞氏病、惡性貧血、大皰性類天皰瘡、多發(fā)性結節(jié)性動脈炎(Polyarthritisnodosa)、心肌病、多軟骨炎、口炎性腹瀉-皮炎、多腺體綜合征、慢性疲勞綜合征(CFIDS)、風濕性多肌痛、慢性炎性脫髓鞘性病、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、慢性炎癥性多發(fā)性神經(jīng)病、原發(fā)性丙球蛋白血癥、變應性肉芽腫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、瘢痕性類天皰瘡、銀屑病、CREST綜合征、雷諾氏現(xiàn)象、冷凝集素病、瑞特綜合征、風濕熱、盤狀紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、原發(fā)性混合(Essential Mixed)、冷球蛋白血癥結節(jié)病、纖維肌痛、硬皮病、格雷夫斯病、干燥綜合征、格林巴利綜合癥、僵人綜合征、橋本氏甲狀腺炎、高安氏動脈炎、特發(fā)性肺纖維化、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、葡萄膜炎、胰島素依賴型糖尿病(I型)、血管炎、·扁平苔蘚、和白癜風。可將本文所述的組合物和遞藥系統(tǒng)施用于受試者以治療或阻止疾病，所述疾病與關聯(lián)上述疾病的異?；虿幌Ｍ拿庖叻磻嚓P。
[0132]應理解，本發(fā)明的藥物組合物可進一步包括至少一種額外的治療劑。
[0133]根據(jù)某些實施方案，所述治療劑可以是免疫調節(jié)劑或代謝調節(jié)劑。更具體地，所述劑可以是抗炎劑、或者抗糖尿病劑。
[0134]術語“代謝調節(jié)劑”涉及在代謝過程情況中如糖酵解、葡萄糖異生、脂解、脂生成、氧化磷酸化、能量平衡、代謝信號傳導等，在某種情況下活性或反應相對于對照或活性或反應的正?；蚧€水平的增加或減小。其也可包括通常在增加或減小肽活性或反應水平的情況下維持活性或反應的水平。
[0135]如上述，因為本發(fā)明的肽出人意料地顯示出代謝和免疫調節(jié)作用，所以本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含至少一種分離的多肽、或編碼其的核酸序列以及藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑，所述分離的多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。
[0136]如本文所用的短語“藥物組合物”指制備一種或更多種本文所述的活性成分，以及其它化學組分，如生理上合適的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進將化合物施用于生物。[0137]如本文所用的術語“活性成分”指本發(fā)明的負責預期生物學作用的肽。應當理解，可將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸直接施用給受試者(作為藥物組合物或藥物組合物的部分)，在受試者中多核苷酸在靶細胞中被翻譯，即基因療法。因此，短語“活性成分”也包括這樣的多核苷酸。
[0138]如本文所用的“藥學可接受載體”包括任何和全部的溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑等等。這種用于藥物活性物質的介質和試劑的用途是本領域公知的。除非任何常規(guī)的介質或試劑與活性成分不兼容，其在治療組合物中的用途是預期的。
[0139]在載體與其它成分兼容以及對患者無害的意義上說，載體應是藥學上和生理上可接受的。制劑包括那些適合口腔的、直腸的、鼻的、或腸道外的(包括皮下的、肌肉內的、靜脈內的和真皮內)施用。所述制劑可常規(guī)地存在于單位劑型中，可通過任何藥劑領域公知的方法制備。所有這樣化合物的性質、可用性和來源以及施用，包括在受試者中產(chǎn)生所需作用所必須的有效量是本領域公知的，不需在本文進一步描述。
[0140]可適用于本發(fā)明的口服劑型的賦形劑包括，而非限制于粘合劑、充填劑、崩解劑和潤滑劑。適用于藥物組合物和劑型的粘合劑包括，而非限制于玉米淀粉、土豆淀粉、或其它淀粉、黃蓍膠或明膠、天然以及合成的樹膠如阿拉伯膠、海藻酸鈉、海藻酸、其它藻酸鹽、黃蓍膠粉、瓜爾膠、纖維素和其衍生物(例如乙基纖維素、醋酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯基吡咯燒酮、甲基纖維素、預膠化淀粉(pro-gelatinized starch)、輕丙基甲基纖維素、微晶纖維素、以及其混合物。
[0141]適用于本文公開的藥物組合物和劑型的填充劑的實例包括，而非限制于滑石、碳酸鈣(例如顆?；蚍勰?、微晶纖維素、粉狀纖維素、dextratre (無對應中譯文)、高嶺土、甘露醇、硅酸、山梨醇 、淀粉、預膠化淀粉、以及其混合物。本發(fā)明的藥物組合物和劑型中的粘合劑或填充劑通常占所述藥物組合物或劑型的約50至約99重量百分比而存在。
[0142]崩解劑可用在本發(fā)明的藥物組合物以及口腔或粘膜劑型中以提供暴露于水環(huán)境時崩解的片劑。含太多崩解劑的片劑可能在儲存時崩解，然而含太少的那些可能不以所需的比率或在所需情況時崩解。
[0143]因此，足量崩解劑應當用于形成本文所述的藥物組合物和固體口服劑型，所述足量崩解劑是既不太多也不太少以致于不利于改變所述活性成分的釋放。所用崩解劑的量基于制劑類型而變，并且其對本領域普通技術人員是容易辨別的。
[0144]可用在本發(fā)明的藥物組合物以及口腔或粘膜劑型中的崩解劑包括，而非限制于瓊月旨、海藻酸、碳酸鈣、Primogel、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、波拉克林鉀、羧甲淀粉鈉、玉米、馬鈴薯或木薯淀粉、其它淀粉、預膠化淀粉、其它淀粉、粘土、其它藻膠、其它纖維素、樹膠、以及其混合物。
[0145]可用在本發(fā)明的藥物組合物和劑型中的潤滑劑包括，而非限制于硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或Sterote (無對應中譯文)、礦物油、輕質礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、月桂基硫酸鈉、滑石、氫化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油)、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂、及其混合物。附加的潤滑劑包括，例如syloid (無對應中譯文)硅膠(AER0SIL200，由Baltimore, Md的ff.R.Grace C0.制造)、合成二氧化娃的凝聚型氣溶膠(由Plano, Tex的Degussa C0.銷售)、CAB-0-SIL03(Boston, Mass的Cabot C0.銷售的焦化二氧化硅產(chǎn)品)、以及其混合物。如果使用，通常以潤滑劑并入藥物組合物或劑型的低于約I重量百分比的量使用潤滑劑。也可使用助滑劑如膠態(tài)二氧化硅。
[0146]含有本發(fā)明肽的藥物組合物用于腸胃外施用、以及用于口服和局部應用，所述腸胃外施用即腹膜內(1.P)、皮下(s.c.)、肌內(1.m.)和靜脈內(1.v.)施用。用于腸胃外施用的組合物一般包括肽溶液或其溶解在可接受載體，優(yōu)選水性載體中的混合物?？墒褂酶鞣N水性載體，例如水、緩沖水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸等等。這些溶液無菌并提出不含顆粒物質。如近似生理條件所需的，所述組合物可包含藥學可接受的輔助物質，例如PH調節(jié)和緩沖劑、毒性調節(jié)劑等，如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉。本發(fā)明肽在這些制劑中的濃度可廣泛地變化，即按重量從少于約0.01%、通常至少約0.1%至多達5%，依照所選施用的具體模式，主要基于流體量和粘性進行選擇。
[0147]更具體地，包括本發(fā)明肽的可注射組合物可制備在水、鹽水、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、檸檬酸鹽緩沖鹽水等等中，并且可以可選擇地與非毒性表面活性劑相混合。在普通的儲存和使用條件下，這些制備可含有防腐劑以防止微生物生長。適合注射或輸注的藥物劑型包括無菌、水溶液或分散劑或含有活性成分的無菌粉末，其粉末適合臨時制備無菌可注射或可輸注(infusible)溶液或分散劑。優(yōu)選地，最終劑型是無菌液體且在制造和儲存條件下穩(wěn)定。所述溶液、懸浮液或分散液(dispersion)的液體載體或運載體可以是溶劑或液體分散介質，包括例如水、乙醇、如甘油、丙二醇、或液態(tài)聚乙二醇等的多元醇、植物油、無毒甘油酯、以及其適合的混合物。例如，通過形成脂質體、或在分散液的情況下通過保持所需顆粒尺寸、或者通過使用無毒表面活性劑來保持溶液、懸浮液或分散液的適當流動性。通過各種抗菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等可以實現(xiàn)預防微生物的作用?？砂ǖ葷B劑，如糖、緩沖液、或氯化鈉。通過在所述組合物中包括延緩吸收的試劑，如單硬脂酸鋁水凝膠和明膠，可以帶來可注射組合物的延遲吸收?？杉尤肴芙庑栽鰪妱?。
[0148]通過將所需量的本發(fā)明的肽并入具有如上列舉的各種其它成分的適當溶劑中、接著根據(jù)需要通過滅菌如過濾滅菌來制備無菌可注射組合物。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，制備方法包括真空干燥和凍干技術，其產(chǎn)生活性成分的粉末加上在預先無菌過濾的溶液中存在的任何·附加所需成分?？刹捎萌魏魏线m的滅菌方法，例如過濾滅菌如0.22微米過濾器或納米過濾，伽馬或電子束滅菌。
[0149]在各種實施方案中，將最終溶液調節(jié)至具有在約4和約9之間、在約5和約7之間、在約5.5和約6.5之間、或約6的pH。使用藥學可接受的酸、堿或緩沖液調節(jié)所述組合物的pH。
[0150]更進一步，本發(fā)明的組合物可存在于每劑量含有預定量的各種活性成分的單位劑型中。這樣的單位可適于提供0.l-100mg/Kg體重的本發(fā)明的肽。具體地，或0.1-1Omg/Kg、5_15mg/Kg、10-30mg/Kg、25-50mg/Kg、40-80mg/Kg 或 60-100mg/Kg。更具體地，所述有效劑量是約0.01至約100mg/Kg的肽、約0.1至約90mg/Kg、約0.3至約8mg/Kg、約0.4至約70mg/Kg、約 0.5 至約 60mg/Kg、約 0.7 至約 50mg/Kg、約 0.8 至約 40mg/Kg、約 0.9 至約 30mg/Kg、約I至約20mg/Kg,特別地約I至約10mg/Kg。這樣的劑量可以以單一劑量或者作為一些離散的劑量提供。當然，最終劑量將取決于待治療的疾病、施用途徑、以及患者的年齡、體重和情況，最終劑量將由醫(yī)生決定。[0151]如上述，除腸胃外途徑之外，本發(fā)明的組合物可適于通過任何其它適當途徑施用，例如通過口服(包括口腔或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口腔、舌下或經(jīng)皮)或陰道途徑。通過在藥劑領域任何已知的方法，例如將所述活性成分與載體或賦形劑聯(lián)合可制備這樣的制劑。
[0152]適合口服施用的藥物制劑可作為離散的單元存在，例如作為膠囊或片劑、粉末或顆粒、在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液、可食用泡沫或攪拌品(whip )、或水包油液體乳劑、或油包水液體乳劑。
[0153]適合經(jīng)皮施用的藥物制劑可作為離散的貼劑(patch)存在，所述離散貼劑意欲在延長的時間中保持與受試者表皮的緊密接觸。
[0154]適合局部施用的藥物制劑可配制為軟膏、霜劑、懸浮液、洗劑、粉劑、溶液、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。
[0155]為應用至眼睛或其它外部組織如口和皮膚，所述制劑優(yōu)選作為局部軟膏或霜劑應用。當所述活性成分配制在軟膏中時，其可與石蠟或與水混溶的軟膏基質一起采用?？蛇x擇地，所述活性成分可與水包油霜劑基質或油包水基質一起配制在霜劑中。
[0156]適合局部施用至眼睛的藥物制劑包括滴眼劑，其中所述活性成分溶解或懸浮在合適的載體、特別是水性溶劑中。
[0157]適合局部施用在口中的藥物制劑包括糖錠、錠劑(pastilles)和漱口水。
[0158]適合局部施用至皮膚的藥物制劑包括軟膏、霜劑、懸浮劑、糊劑、洗劑、粉劑、溶液、油劑、包囊凝膠、含 本發(fā)明肽的脂質體、任何含所述肽的納米粒子、或含所述肽的可噴氣霧劑或吸入劑。常規(guī)藥物載體，水性、粉或油性基質，增稠劑等等可以是必須或根據(jù)需要。術語“局部應用”或“局部施用”意為將軟膏、霜劑、潤膚齊?、香膏、洗齊?、溶液、油膏(salve)、軟膏(unguent)、或任何其它藥物形式應用到一些或全部的患者皮膚的皮膚部分,所述患者皮膚正在、或曾經(jīng)被、或顯示或曾顯示待治療病況中一種或多種癥狀的影響，例如糖尿病相關的皮膚損傷。
[0159]在某些實施方案中，用于治療皮膚疾病、特別是糖尿病相關皮膚潰瘍的本發(fā)明肽的施用可通過局部敷料進行。術語“敷料”意為傷口或手術位點的覆蓋物，通常包括布、織物、合成膜、紗布或等等。通常是含聚合物的基質覆蓋一塊區(qū)域的皮膚。敷料可或不可與皮膚緊密接觸。其可以是，例如布或紗布，或者其可以是印或噴涂在皮膚上的聚合物溶液，當溶劑干燥時和/或當聚合物交聯(lián)時所述聚合物在皮膚上固化。敷料也包括凝膠，通常是交聯(lián)水凝膠，其主要意欲覆蓋和保護傷口、手術位點等等。
[0160]適合直腸施用的藥物制劑可作為栓劑或灌腸劑存在。
[0161 ] 適合鼻施用的藥物制劑，其中所述載體是包含具有如在20至500微米范圍內的顆粒尺寸的粗粉的固體，其以吸鼻煙的方式施用，即從緊挨鼻子的所述粉末容器中通過鼻通道快速吸入。合適的制劑包括水性或油性的所述活性成分的溶液，所述合適的制劑中所述載體是液體，其作為噴鼻劑或滴鼻劑施用。
[0162]適合通過吸入施用的藥物制劑包括細粒粉塵或霧，其可通過各種類型的計量劑量的加壓氣溶膠、噴霧器或吹入器的方法生成。
[0163]適合陰道施用的藥物制劑可作為陰道栓劑、棉塞、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴
霧制劑存在。[0164]優(yōu)選的單位劑量制劑是那些如本文上述的含有活性成分的每日、每兩周、每周、每幾周或每月劑量或亞劑量、或其適當部分。
[0165]應理解，除以上特別提到的成分，考慮到所討論的制劑類型，所述制劑還可包含其它本領域常規(guī)試劑，例如適合口服施用的那些可包括調味劑。
[0166]在另一個方面，本發(fā)明提供用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作的方法。所述方法包括步驟:向需要其的受試者施用治療有效量的至少一種分離多肽、編碼其的核酸序列、任何其組合或混合物、或含有其的任何組合物，所述分離多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0167]如本文和權利要求所用的術語“治療”和“改善”意思是在患有病理疾病的患者中改善一種或更多種疾病活性的臨床指標?！爸委煛敝钢委熜蕴幚?。需要治療的那些是患有代謝或炎癥疾病的哺乳動物受試者。“患者”或“有需要的受試者”意為任何哺乳動物，為阻止、克服或減緩這種痛苦(infliction)需要對哺乳動物施用本發(fā)明肽或本發(fā)明的任何藥物組合物。也可施用本發(fā)明肽和組合物以延緩疾病的發(fā)作，也就是說本發(fā)明肽和組合物推遲疾病惡化或者使其進展減緩以使得疾病的臨床表征相對于沒有治療出現(xiàn)得更遲。
[0168]以保護的方式來提供“預防處理”或“預防性處理”以抵御或防止某些事，特別是病況或疾病。
[0169]為實現(xiàn)這些治療目標，必須向患有所述疾病的受試者施用治療有效量的本發(fā)明組合物或肽。術語“有效量”或“足夠量”意思是實現(xiàn)所選結果所必須的量?！坝行е委熈俊比Q于疾病的嚴重性連同預防或治療目標、施用途徑以及患者的一般情況(年齡、性別、體重以及其它主治醫(yī)生已知的考慮)。
[0170]如本文所用，術語“疾病/紊亂(disorder)”指存在正常功能的干擾的情況。“疾病(disease)”是身體或心靈·的任何異常情況，其導致受影響的人或接觸他們的人不適、機能障礙、或悲痛。有時，所述術語廣泛使用以包括受傷、殘疾、綜合征、癥狀、偏差行為、以及結構和功能的非典型變化，然而在其它背景中這些可被視作可區(qū)別開的分類。應注意的是，術語“疾病”、“紊亂”、“病況”和“病”在本文中等同使用。
[0171]本發(fā)明涉及治療需要其的受試者或患者。“患者”或“有需要的受試者”意思是可被上述病況所影響、以及需要本文所述的治療方法的任何生物，其包括人類、馴養(yǎng)和非馴養(yǎng)的哺乳動物如犬和貓受試者、牛、猴、馬和鼠受試者、嚙齒動物、家禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖、魚和異國水族魚。應當理解，治療的受試者也可以是任何爬行類或動物園動物。更特別地，本發(fā)明的方法和組合物旨在哺乳動物?！安溉閯游锸茉囌摺币馑际切枰ㄗh療法的任何哺乳動物，包括人類、馬、犬和貓受試者，最特別地是人。應注意到，具體在非人類受試者的情況下，可使用經(jīng)注射、飲水、喂飼、噴霧、口腔喂食的施用和直接進入需要其的受試者的消化道來執(zhí)行本發(fā)明的方法。還應注意到，具體在對人類受試的情況下，對患者施用本發(fā)明的組合物包括自行施用和經(jīng)他人施用給患者。
[0172]術語“治療有效量”意欲指引發(fā)組織、系統(tǒng)、動物或人類的生物學或醫(yī)學反應的藥物量或藥劑量，其為研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)師或其它臨床醫(yī)生所尋找。
[0173]根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案，所施用的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。[0174]根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實施方案，所施用的多肽包含如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0175]根據(jù)本發(fā)明方法的又一個實施方案，所施用的多肽包含如SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0176]在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可導致下列中至少一種:增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平。
[0177]所施用的肽的凈效應是抗炎癥和抗糖尿病。
[0178]事實上，本發(fā)明方法可特別適合用于治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或任何含有代謝綜合征的病況的發(fā)作。
[0179]在某些實施方案中，應注意到代謝綜合征或任何含有代謝綜合征的病況可以是下列中的至少一種:異常脂蛋白血癥(高甘油三酸酯血癥、高膽固醇血癥、低HDL膽固醇)、肥胖、NIDDM (非胰島素依賴型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受損)、血液凝固、血纖維蛋白溶解缺陷和高血壓。
[0180]更具體地，本發(fā)明的方法可用于治療、改善、預防或推遲II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相關病況的發(fā)作。
[0181]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用治療有效量的至少一種肽，或編碼其的核酸序列、任何其組合或混合物、或含有其的任何組合物，所述肽包含如SEQ ID N0.1和9所示的序列、任何其片段、衍生物或類似物。在增強葡萄糖代謝和提高葡萄糖耐量中有效的這種方法可導致血清葡萄糖水平的降低。
[0182]應注意到，在本文中也稱`為APC2和APC4的這些肽在本發(fā)明中顯示通過心臟組織表達。此外，本發(fā)明的肽顯示下調葡萄糖水平。因為與心臟發(fā)作后不良預后相關的主要風險因子是高葡萄糖水平，使用本發(fā)明肽可以使心臟發(fā)作后的保護成為可能。因此，在更多具體實施方案中，本發(fā)明提供可適用于治療、改善、預防或推遲心臟疾病、特別是心臟發(fā)作的發(fā)作的方法。
[0183]在某些實施方案中，所述方法在需要其的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
[0184]因此，所述方法可適用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病的發(fā)作。
[0185]在某些具體實施方案中，本發(fā)明的肽可調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡朝向抗炎性的Th2反應。Thl/Th3反應可特別適用于具有不希望的非平衡促炎Thl反應的免疫相關疾病。例如，這種免疫相關疾病可以是自身免疫疾病、移植排斥病理學和炎癥疾病。
[0186]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括施用至少一種額外治療劑的步驟。
[0187]額外治療劑可以是任何抗炎劑，包括NSAID和留體劑、或是任何抗糖尿病劑。
[0188]在另一方面，本發(fā)明針對至少一種分離多肽、或編碼其的核酸序列在制備組合物中的用途，所述分離多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物。所述組合物適用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作。
[0189]根據(jù)各種實施方案，在制備所述組合物中所用的多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0190]根據(jù)一些實施方案，在制備所述組合物中所用的多肽包含如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0191]根據(jù)某些實施方案，在制備所述組合物中所用的多肽包含如SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0192]如實施例所示，使用本發(fā)明的多肽所制備的組合物可導致下列中的至少一種:增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平。
[0193]根據(jù)具體實施方案，使用本發(fā)明的多肽所制備的組合物用于治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或者任何包含代謝綜合征的病況的發(fā)作。
[0194]在某些實施方案中，應注意到代謝綜合征或任何含有代謝綜合征的病況可以是下列中的至少一種:異常脂蛋白血癥(高甘油三酸酯血癥、高膽固醇血癥、低HDL膽固醇)、肥胖、NIDDM (非胰島素依賴型糖尿病)、IGT (葡萄糖耐量受損)、血液凝固、血纖維蛋白溶解缺陷和高血壓。
[0195]在具體的實施方案中，使用本發(fā)明的多肽所制備的組合物用于治療、改善、預防或推遲II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相關病況的發(fā)作。
[0196]因此，在很多實施方案中，本發(fā)明的用途在于至少一種本發(fā)明所用的肽、或編碼所述肽的核酸序列、任何所述肽的組合或混合物、或含有所述肽的任何組合物用于制備組合物，其中所述肽可包含如SEQ ID N0.1和9所示的氨基酸序列(分別對應肽APC2和APC4)、任何其片段、衍生物或類似物。增強葡萄糖代謝和增加葡萄糖耐量的這種組合物可導致血清葡萄糖水平的降低。應注意，本發(fā)明還包括本發(fā)明任何肽的功能片段的用途。功能片段的非限制性實例可包括SEQ ID N0.13、14和15的肽，其分別是SEQ ID N0.1、5和9的肽的功能片段。
[0197]更具體地，根據(jù)某些·實施方案，根據(jù)本發(fā)明的用途制備的組合物可有效作為藥物組合物用于治療、改善、預防或推遲心臟疾病的發(fā)作。
[0198]在其它實施方案中，使用本發(fā)明的多肽制備的組合物在需要其的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
[0199]根據(jù)一個實施方案，使用本發(fā)明的多肽制備的組合物用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病的發(fā)作。
[0200]在某些具體實施方案中，本發(fā)明的肽可調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡朝向抗炎Th2、Thl/Th3反應可特別適用于具有不希望的非平衡促炎Thl反應的免疫相關疾病。例如，這種免疫相關疾病可以是自身免疫疾病、移植排斥病理和炎癥疾病。
[0201]根據(jù)各種實施方案，使用本發(fā)明的多肽制備的組合物可進一步包括至少一種額外治療劑。
[0202]在還一方面，本發(fā)明提供分離的多肽，其用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病和代謝紊亂中至少一種的發(fā)作。所述多肽包含如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.5或SEQ IDN0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0203]本發(fā)明也提供方法，所述方法用于增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平中的至少一種，所述方法包括如下步驟:向需要其的受試者施用治療有效量的至少一種分離多肽、編碼其的核酸序列、任何其組合或混合物或者包含其的任何組合物，所述分離多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
[0204]在具體實施方案中，所述方法用于增強葡萄糖代謝。
[0205]在另一具體實施方案中，所述方法用于增加葡萄糖耐量。
[0206]在又一實施方案中，所述方法用于增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達。
[0207]在再一實施方案中，所述方法用于減少TNFa的血清水平。
[0208]在還一實施方案中，所述方法用于減少IL-1 β的血清水平。
[0209]如公開和描述的，應理解本發(fā)明不限于本文公開的具體實施例、方法步驟和組合物，因為這樣的方法步驟和組合物可有些變化。也應理解，因為本發(fā)明的范圍將只通過隨附權利要求和其等同物加以限制，所以本文使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的而不意圖限制。
[0210]必須注意，除非上下文另外清楚指出，在本說明書和隨附權利要求中所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復數(shù)對象。
[0211]通過本說明書以及其后的實施例和權利要求，除非上下文另外需要，詞語“包含(comprise)”以及變體如“包括(comprises)”和“含有(comprising)”將理解為暗示包括所述整數(shù)或步驟或一組整數(shù)或步驟，但是不排除任何其它整數(shù)或步驟或一組整數(shù)或步驟。
[0212]下列實施例代表本發(fā)明人在實施本發(fā)明方面時所采用的技術。應理解，雖然這些技術是用于本發(fā)明實施的優(yōu)選實施方案的示例，本領域技術人員根據(jù)本公開將認識到可進行許多修改而不離開本發(fā)明的精神和預期范圍。
·[0213]實施例
[0214]MM
[0215]D(-)甘露醇(Prod: 291484B，BDH 實驗室供應)
[0216]PCR 裝置(MyCycle, BioRad, CA,美國)
[0217]TNFa 和 IL-1 β ELISA(BioPlex Pro-小鼠糖尿病試劑盒 cat#: 171-F7001M 和小
[0218]鼠 Thl/Th2 試劑盒 cat#: 171-F7001M, BioRad, CA,美國)
[0219]血糖儀(Accucheck,Roche)
[0220]RNA-Save (cat#: 01-891-1B，Biological Industries,以色列).[0221]RNeasy mini 試劑盒(cat#:74106，Qiagen)用于 RT-PCR 的 EZ 第一鏈 cDNA 合
[0222]成的試劑盒(cat#:20-800-50，BiologicalIndustries,以色列)
[0223]GoTaq Green Master Mix(Cat#M7122, Promega)
[0224]PBS (目錄號 02-023-5A，Biological industries)
[0225]Maxisorp96 孔板(目錄號 4424O4, NUNC, F96Maxisorp).[0226]Tff-20 (目錄號 0777-1L, Amresco)
[0227]BSA (目錄號 160069，MP biomedicals,)
[0228]羊抗兔HRP綴合抗體(目錄號7074，Cell signaling)
[0229]TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，辣根過氧化物酶底物，目錄號ES001-500ML，
[0230]Millipore)
[0231 ] H2SO4 (目錄號 5552540，F(xiàn)rutarom)
[0232] 方法[0233]分子生物學通用方法
[0234]因為一些分子生物學領域的方法是本領域技術人員所公知的，所以不在本文詳述。這樣的方法包括PCR、cDNA表達、人類細胞的轉染等等。描述這樣方法的教科書是，例如 Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, ISBN:0879693096;F.M.Ausubel (1988)Current Protocols in MolecularBiology, ISBN:047150338X, John Wiley&Sons, Inc。此外，因為一些免疫學技術是本領域技術人員所公知的，所以不在本文所述的每個例子中詳述，例如Western印跡。參見，例如 Harlow 和 Lane(1988)Antibodies:a laboratory manual, Cold Spring HarborLaboratory。
[0235]動物和治療方案
[0236]從Harlan Biotech (耶路撒冷，以色列)購買20只7周齡C57B1/6雄性小鼠(每個實驗)。所有小鼠都在公司設施的動物設施房間里飼養(yǎng)。給予小鼠標準實驗采食和任意的飲水，并保持12小時光/暗循環(huán)。依照以色列當局對動物實驗的《Care and Use ofLaboratory Animals))指南以及經(jīng)過當局具體審批進行全部動物實驗。
[0237]ELISA通用規(guī)程
[0238]通過使用與易于分析的酶相偶聯(lián)的抗體或抗原，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)將抗體的特異性與簡單的酶敏感性分析相結合。ELISA可提供抗原或抗體濃度的有用測量。ELISA是五步程序:1)用稀釋在PBS中的抗原包被微量滴定板的孔，在4°C孵育并洗滌；2)用BSA/FCS封閉所有未結合的位點以阻止假陽性結果，在PBS中孵育I小時，并洗滌；3)將抗體加至孔中，孵育I小時并洗滌；4)加入與酶綴合的抗人類IgG，孵育I小時并洗滌；5)使底物與酶反應以產(chǎn)生有色產(chǎn)物，因此表明陽性反應。
[0239]FACS 規(guī)程`
[0240]洗滌細胞，在冰冷的PBS、10%FCS、1%疊氮化鈉中將懸浮液調至1_5χ106細胞/ml的濃度。加入0.1-10 μ g/ml的一級標記的抗體。如果必要，在3%BSA/PBS中制備稀釋液。在室溫或4°C孵育懸浮液至少30分鐘,然后通過在400g離心5分鐘并重懸于500 μ I至Iml的冰冷PBS、10%FCS、1%疊氮化鈉中洗滌細胞3次。使用流式細胞儀分析細胞。
[0241]ELISA 程序
[0242]通過將標準蛋白在PBS中進行系列稀釋制備2000pg/ml至31pg/ml的校正曲線。在37°C浴中迅速解凍樣本。70 μ I —式兩份的每個血液樣本(未稀釋)和70 μ I —式三份的標準樣本上樣于Maxisorp96孔板中，并在4°C搖動孵育過夜。隨后移除液體并使用多頭移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗滌板4次。為封閉，在每個孔中上樣300 μ I的封閉緩沖液(在PBS中的5%BSA)，在室溫搖動孵育板I小時。隨后移除液體并使用多頭移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗滌板4次。為檢測，將特異性抗體在稀釋劑中(在PBS中
0.05%Tff-20, 0.1%BSA)按1:250稀釋，在每個孔中上樣100 μ I的檢測抗體，并在室溫搖動孵育2小時。隨后移除液體并使用多頭移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗滌板4次。將羊抗兔HRP綴合抗體在稀釋劑中按1:200稀釋，在每孔中上樣100 μ I的HRP綴合物，并在室溫搖動孵育30分鐘。隨后移除液體并使用多頭移液器用PBS中的300 μ 10.05%Tff-20洗滌板5次。為顯色，將100 μ I的TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，辣根過氧化物酶底物)加至每孔，并孵育直至藍色顯色。為終止顯色，加入50 μ 12Ν H2S04。在微量板閱讀器中在450nm處確定吸光度。
[0243]葡萄糖耐量實驗
[0244]在實驗的末期(兩周)進行葡萄糖耐量實驗(GTT)。在實驗施用前，使小鼠饑餓過夜。腹膜內注射葡萄糖(1.P.) (2g/Kg體重)，在時間點O分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘測量血液葡萄糖水平。通過使用標準血糖儀取樣尾靜脈血，確定血液葡萄糖。
[0245]血漿胰高血糖素分析
[0246]刺破小鼠尾靜脈，使用標準血糖儀分析血液葡萄糖。
[0247]胰島素受體和GLUT-4PCR分析
[0248]處死小鼠并解剖。取15_20mg合適組織并將其穩(wěn)定在RNA-Save中。使用RNeasy小量試劑盒從所述組織中提取RNA。使用22G的針和注射器進行均化。為RT-PCR，使用EZ第一鏈cDNA合成試劑盒從所述RNA中制備cDNA。使用GoTaq Green Master Mix并使用適當?shù)囊?40循環(huán)，退火溫度:62°C)進行樣本的PCR。
[0249]血清TNF α和IL-1 β分析
[0250]從每只小鼠中抽血并分別收集在1.5ml管中。在室溫中30分鐘至I小時后，在4°C以300G離心凝結的血15分鐘。將上清收集在新的1.5ml管中，并在300G再次離心15分鐘。將上清收集在新的1.5ml管中，并在-70°C冰凍用于后續(xù)分析。當用于分析時，所述血液管在室溫下在水浴中迅速解凍，隨后在4°C以13，000G離心10分鐘。根據(jù)Bio-Plex Pro分析說明手冊使用平 底的黑色板來分析樣本。
[0251 ]反轉錄酶 PCR (RT-PCR)
[0252]為建立分離的新型蛋白的表達模式，在各種組織中進行RT-PCR。應用的PCR條件是95°C下2分鐘，接著40個循環(huán):95°C下45秒、59°C下45秒以及72°C下5分鐘，并具有72 °C下5分鐘的末循環(huán)。
[0253]實施例1
[0254]分離APC_2cDNA
[0255]具有如SEQ ID N0.2所示的序列的cDNA，其編碼肽APC_2(具有如SEQ ID N0.1所示的序列)，使用購自Clonetech的人類cDNA文庫和此處如SEQ ID N0.3和4所示的引物將其擴增。
[0256]關于APC-2肽，其在本文也命名為Uz1-1，在氨基酸位置17和18之間確定p=0.760的最大切割位點可能性。
[0257]將PCR的產(chǎn)物測序。在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，并使用CyberGreen (Invitrogene)染色,使用BioRad ChemiDoc分析儀評估PCR產(chǎn)物的強度。結果表明APC-2在人類心臟和淋巴細胞中表達。
[0258]實施例2
[0259]APC-2改善葡萄糖耐量
[0260]將雄性C57B1/6小鼠分成4組，每組5只小鼠。對照組(組I)接受5%甘露醇IV(一周3次，每次200 μ L)。組II接受一周3次的APC2(0.25mg/Kg體重)劑量。組III接受一周3次的APC2 (1.5mg/Kg體重)劑量。組IV接受一周3次的APC2 (15mg/Kg體重)劑量。將小鼠治療2周。[0261]在實驗的末期，如方法部分所述施用葡萄糖耐量實驗(GTT)。在圖1中顯示GTT的結果?？梢郧宄吹?，APC-2以劑量依賴方式改善葡萄糖耐量，其中對1.5mg/Kg體重的APC2劑量觀察到最優(yōu)反應。
[0262]實施例3
[0263]APC-2減少血漿胰高血糖素
[0264]除GTT之外，如方法部分所述分析小鼠血漿胰高血糖素水平。如圖2所示，通過APC-2以劑量依賴的方式減少血漿胰高血糖素水平。
[0265]實施例4
[0266]APC-2在脾細胞中增加胰島素受體和GLUT-4表達
[0267]在實驗的末期，處死小鼠，從不同小鼠組中收集脾細胞，并分析HPRT (對照)、胰島素受體和GLUT4的RNA水平。在圖3A-3C中呈現(xiàn)這些Northern印跡分析的結果。如所示，在使用APC-2處理的小鼠中，胰島素受體和GLUT4兩者以劑量依賴的方式得以上調，其中在使用1.5mg/Kg體重處理的小鼠中觀察到最大誘導。
[0268]通過實施例1-4顯示的結果清楚地表明使用本發(fā)明的APC-2肽在治療葡萄糖代謝相關疾病上的可行性。
[0269]實施例5
[0270]分離APC_3cDNA
[0271]具有如SEQ ID N0.6所示的`序列且編碼肽APC-3 (具有如SEQ ID N0.5所示的序列)的cDNA，使用購自Clonetech的人類cDNA文庫和此處如SEQ ID N0.7和8所示的引物將其擴增。
[0272]關于APC-3肽，其在本文也命名為Uz1-2，在氨基酸位置18和19之間確定p=0.544的最大切割位點可能性。
[0273]將PCR產(chǎn)物測序。在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，并使用CyberGreen (Invitrogene)染色,使用BioRad ChemiDoc分析儀評估PCR產(chǎn)物的強度。結果表明APC-3在人類脾臟、睪丸、小腸、結腸和腎臟中表達。
[0274]實施例6
[0275]APC-3 減少 TNF α 和 IL-1 β
[0276]將雄性C57B1/6小鼠分成4組，每組5只小鼠。對照組(組I)接受5%甘露醇IV(一周3次，每次200 μ L)。組II接受一周3次的APC3(0.25mg/Kg體重)劑量。組III接受一周3次的APC3 (1.5mg/Kg體重)劑量。組IV接受一周3次的APC3 (15mg/Kg體重)劑量。將小鼠治療2周。
[0277]在實驗的末期，在小鼠血漿中測量TNFa和IL_1 β，結果分別顯示在圖4A和4B中?？梢郧宄吹?，APC-3以劑量依賴方式都減少了炎性細胞因子的水平，其中對1.5mg/Kg體重的APC3劑量觀察到最優(yōu)反應。
[0278]因此，很明顯地APC3可下調促炎細胞因子(體現(xiàn)在可觀察到的血清IL-1 β和TNF-a減少上)，因為熟知高IL-1 β與糖尿病相關，所以APC3可用于治療自身免疫疾病尤其是糖尿病。
[0279]實施例7
[0280]分離APC_4cDNA[0281]具有如SEQ ID N0.10所示的序列且編碼肽APC_4(具有如SEQ ID N0.9所示的序列)的cDNA，使用購自Clonetech的人類cDNA文庫和此處如SEQ ID N0.11和12所示的引物將其擴增。
[0282]關于APC-4肽，其在本文也命名為Uz1-3，在氨基酸位置20和21之間確定p=0.731的最大切割位點可能性。
[0283]將PCR產(chǎn)物測序。在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，并使用CyberGreen (Invitrogene)染色,使用BioRad ChemiDoc分析儀評估PCR產(chǎn)物的強度。結果表明APC-4在人類脾臟、睪丸、結腸·、小腸、白細胞、心臟、胎盤、肝臟、腎臟和胰腺中表達。
【權利要求】
1.一種分離的多肽，其包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列、及任何其片段、衍生物或類似物。
2.根據(jù)權利要求1所述的分離的多肽，其包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
3.根據(jù)權利要求1所述的分離的多肽，其包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
4.根據(jù)權利要求1所述的分離的多肽，其包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
5.一種含有編碼多肽的序列的分離的核酸分子，所述多肽包含如SEQ ID N0.USEQ IDN0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物和類似物。
6.根據(jù)權利要求5所述的分尚的核酸分子,其包含如SEQID N0.2所不的核酸序列或任何其衍生物、突變體、片段或同系物，其中所述核酸分子編碼含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的多肽。
7.根據(jù)權利要求5所述的分尚的核酸分子,其包含如SEQID N0.6所不的核酸序列或任何其衍生物、突變體、片段或同系物，其中所述核酸分子編碼含有如SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列的多肽。
8.根據(jù)權利要求5所述的分尚的核酸分子,其包含如SEQID N0.9所不的核酸序列或任何其衍生物、突變體、片段或同系物，其中所述核酸分子編碼含有如SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列的多肽。
9.一種包含如SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.10中任一個所示的核酸序列、或任何其衍生物、突變體、片·段或同系物的核酸構建體，其中構建體可選地進一步包含可操作連接的調控元件。
10.一種包含根據(jù)權利要求9所述的核酸構建體的表達載體。
11.一種轉化或轉染有根據(jù)權利要求10所述的表達載體的宿主細胞。
12.—種含有至少一種分離的多肽、或編碼所述分離的多肽的核酸序列的組合物，所述分離的多肽包含如SEQ ID N0.USEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列以及任何其片段、衍生物或類似物，所述組合物可選地進一步包括藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
13.根據(jù)權利要求12所述的組合物，其中所述的多肽包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
14.根據(jù)權利要求12所述的組合物，其中所述的多肽包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
15.根據(jù)權利要求12所述的組合物，其中所述的多肽包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
16.根據(jù)權利要求12至15任一項所述的組合物，其中所述組合物導致下列中至少一種:增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平。
17.根據(jù)權利要求16所述的組合物，其中所述組合物是用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作的藥物組合物。
18.根據(jù)權利要求17所述的藥物組合物，其中所述組合物用于治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或者包含所述代謝綜合征的任何病況的發(fā)作。
19.根據(jù)權利要求17所述的藥物組合物，其中所述組合物用于治療、改善、預防或推遲II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相關病況的發(fā)作。
20.根據(jù)權利要求16所述的藥物組合物，其中所述多肽包含如SEQID N0.1和9中任一個所示的氨基酸序列，以及其中所述的增強葡萄糖代謝和增加葡萄糖耐量導致血清葡萄糖水平降低。
21.根據(jù)權利要求20所述的組合物，其中所述組合物是用于治療、改善、預防或推遲心臟疾病的發(fā)作的藥物組合物。
22.根據(jù)權利要求17所述的藥物組合物，其中所述組合物在有需要的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
23.根據(jù)權利要求22所述的藥物組合物，其中所述組合物用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病的發(fā)作。
24.根據(jù)權利要求17所述的藥物組合物，其中所述組合物進一步包括至少一種額外的治療劑。
25.一種用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作的方法，所述方法包括如下步驟:向有需要的受試者施用治療有效量的至少一種分離的多肽、編碼所述分離的多肽的核酸序列、任何所述分離的多肽的組合或混合物或者含有所述分離的多肽的任何組合物，所述分離的多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或 類似物。
27.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
28.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
29.根據(jù)權利要求25至28中任一項所述的方法，其中所述方法導致下列中的至少一種:增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNF α的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平。
30.根據(jù)權利要求25至29中任一項所述的方法，用于治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或者任何包含所述代謝綜合征的病況的發(fā)作。
31.根據(jù)權利要求25至29中任一項所述的方法，用于治療、改善、預防或推遲II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相關病況的發(fā)作。
32.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述多肽包含如SEQID N0.1和9中任一個所示的氨基酸序列，以及其中所述的增強葡萄糖代謝和增加葡萄糖耐量導致血清葡萄糖水平降低。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述方法用于治療、改善、預防或推遲心臟疾病的發(fā)作。
34.根據(jù)權利要求25至29中任一項所述的方法，其中所述方法在有需要的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
35.根據(jù)權利要求34所述的方法，用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病的發(fā)作。
36.根據(jù)權利要求25至35中任一項所述的方法，進一步包括施用至少一種額外的治療劑的步驟。
37.至少一種分離的多肽、或編碼所述分離的多肽的核酸序列在制備用于治療、改善、預防或推遲代謝紊亂和免疫相關疾病中至少一種的發(fā)作的組合物中的用途，所述分離的多肽含有如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列、以及任何其片段、衍生物或類似物。
38.根據(jù)權利要求37所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.1所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
39.根據(jù)權利要求37所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.5所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
40.根據(jù)權利要求37所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.9所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
41.根據(jù)權利要求37至40中任一項所述的用途，其中所述組合物導致下列中的至少一種:增強葡萄糖代謝、增加葡萄糖耐量、減少血漿胰高血糖素水平、誘導胰島素受體表達、增加GLUT-4葡萄糖轉運蛋白表達、減少TNFa的血清水平以及減少IL-1 β的血清水平。
42.根據(jù)權利要求41所述的用途，其中所述組合物用于治療、改善、預防或推遲代謝綜合征或者任何包含所述代謝綜合征的病況的發(fā)作。
43.根據(jù)權利要求41所述的用途，其中所述組合物用于治療、改善、預防或推遲II型糖尿病、I型糖尿病或任何糖尿病相關病況`的發(fā)作。
44.根據(jù)權利要求41所述的用途，其中所述多肽包含如SEQID N0.1和9中任一個所示的氨基酸序列，以及其中所述的增強葡萄糖代謝和增加葡萄糖耐量導致血清葡萄糖水平降低。
45.根據(jù)權利要求44所述的用途，其中所述組合物是用于治療、改善、預防或推遲心臟疾病的發(fā)作的藥物組合物。
46.根據(jù)權利要求41所述的用途，其中所述組合物在有需要的受試者中調節(jié)Thl/Th2、Th3細胞平衡。
47.根據(jù)權利要求46所述的用途，其中所述組合物用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病的發(fā)作。
48.根據(jù)權利要求37所述的用途，其中所述組合物進一步包括至少一種額外的治療劑。
49.一種用于治療、改善、預防或推遲免疫相關疾病和代謝紊亂中至少一種發(fā)作的分離的多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.9中任一個所示的氨基酸序列或任何其片段、衍生物或類似物。
【文檔編號】C12N15/12GK103857694SQ201280049380
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年8月6日 優(yōu)先權日:2011年8月8日
【發(fā)明者】T·山德勒, O·德偉瑞 申請人:兩合生物科技公司