專利名稱：一種基于核酸適體的可捕獲癌細胞的微流控芯片及其制備和癌細胞的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一種細胞分離技術(shù)，尤其涉及一種可用于癌細胞分離的微流控芯片和分離方法。
背景技術(shù)：
癌癥，亦稱惡性腫瘤，其是因控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。癌細胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分，嚴重威脅人類健康。癌細胞的捕獲，尤其是從原生癌細胞組織上脫落下來進入人體外周血液及組織中的循環(huán)癌細胞的捕獲，對于癌癥的早期診斷、治療效果的評估有極其重要的意義。在過去的幾十年間，人們開發(fā)了很多種用以捕獲癌細胞的技術(shù)，如:熒光免疫法、磁性免疫法等。然而，這些技術(shù)所需的儀器昂貴，操作方法復(fù)雜，推廣難度大。因此，開發(fā)一種小型、廉價、操作簡單的癌細胞捕獲儀器是非常有意義的。微流控芯片技術(shù)由于制作成本低、試劑消耗少、檢測速度快、功能集成度高等優(yōu)點越來越受到研究人員的關(guān)注。人們已經(jīng)逐步利用微流控芯片實現(xiàn)了對循環(huán)癌細胞的高通量篩選、計數(shù)以及表征等技術(shù)。Faley S等利用440個18 μ mX 18 μ mX 10 μ m的聚二甲基娃氧燒(Polydimethylsiloxane, PDMS)微結(jié)構(gòu)捕獲陣列成功地實現(xiàn)了對OM+T細胞的捕獲(Faley S，Seale K, Hughey J et al, Microfluidic Platform for Real-TimeSignaling Analysis of Multiple Single T Cells in Parallel, Lab on a Chip, 2008，8，1700-1712)。該設(shè)計側(cè)向2 μ m寬的微小狹縫使得PDMS在脫模時容易斷裂，另外芯片對細胞捕獲的選擇性不高，會將全血中的紅細胞、白細胞和癌細胞同時捕獲。這些方法基本上都是基于細胞大小等物理性質(zhì)、或是基于抗原抗體相互作用的識別分離，所以都沒能實現(xiàn)既有高效率、又有高特異性的捕獲。核酸適體(aptamer)是一種從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高親和性和高特異性地與靶標分子結(jié)合的單鏈寡核苷酸。1990年Gold研究組運用體外篩選技術(shù)獲得能與T4 DNA聚合酶特異性結(jié)合的RNA，并把該技術(shù)定義為指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)?；赟ELEX篩選獲得的核酸適體具有比抗體更好的化學(xué)性質(zhì)，能夠高效、特異地結(jié)合多種目標物質(zhì)，具有制備修飾簡便快速、穩(wěn)定性好、無毒性、無免疫原性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。Joseph A.Phillips等用核酸適體作為捕獲探針有效地實現(xiàn)了癌細胞的分離和富集(Joseph A.Phillips, Ye Xu, Zheng Xia et alEnrichment of cancer cells using aptamers immobilized on a microfluidic channelAnal.Chem.2009, 81，1033-1039)，但該方法由于芯片結(jié)構(gòu)簡單，不能很好地解決層流的影響，另外由于核酸適體預(yù)先固定在芯片上，其與細胞接觸幾率小，這使得低濃度下的捕獲效率不高。因此，迫切需要開發(fā)一種制作簡單、操作方便的細胞捕獲分選芯片，以期能夠?qū)崿F(xiàn)高效且高特異性地捕獲樣品中微量癌細胞的目標。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細胞捕獲效率高、制作工藝簡單、操作簡便、通用性強、成本低、能在全血中捕獲癌細胞的微流控芯片，還提供一種基于該微流控芯片的快速、準確的癌細胞的分離方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種基于核酸適體的可捕獲癌細胞的微流控芯片，所述微流控芯片由上層聚二甲基娃氧燒(Polydimethylsiloxane, PDMS)聚合物芯片和下層的玻片載體可逆封接而成，所述微流控芯片上設(shè)有進樣口和出樣口，所述PDMS聚合物芯片和玻片載體之間設(shè)有蛇形狀的細胞捕獲通道，所述細胞捕獲通道將所述進樣口和出樣口連通，所述細胞捕獲通道的內(nèi)上表面設(shè)有自上往下突出的魚骨形結(jié)構(gòu)，所述細胞捕獲通道的底表面為凹凸不平的玻片載體表面；所述細胞捕獲通道的底表面上固定有親和素。上述的微流控芯片中，所述凹凸不平的玻片載體表面是經(jīng)過氫氟酸腐蝕處理后成型得到。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種微流控芯片的制備方法，包括以下步驟:
(1)PDMS聚合物芯片:先用繪圖軟件繪制PDMS聚合物芯片掩膜版圖，并使用高分辨率激光打印機打印在透明膠片上制得光刻掩膜板，然后利用此光刻掩膜板并通過光刻工藝制作得到芯片模具；
(2)PDMS澆鑄:將PDMS前聚體與固化劑按常規(guī)質(zhì)量比(例如10: I)進行物理混合，充分攪拌，真空脫氣后澆鑄在上述步驟(I)制得的芯片模具上，烘干固化后冷卻，得到PDMS聚合物芯片；
(3)氫氟酸處理:將氫氟酸溶液均勻涂覆在一潔凈的玻璃表面，靜置一段時間(5s 5min)后用水洗凈，用氮氣吹干，得到玻片載體；通過采用氫氟酸腐蝕玻璃表面，能夠增大玻璃表面的粗糙度，提高細胞捕獲通道的底表面面積，進而提高親和素的修飾密度，進一步破壞層流增大細胞與基底的接觸幾率，達到增大目標細胞捕獲效率的目的；
(4)鍵合:將步驟(2)制得的PDMS聚合物芯片與步驟(3)制得的玻片載體加壓可逆鍵合，得到半成品；
(5)親和素的修飾:將含有親和素的磷酸緩沖液通過半成品的進樣口通入到半成品的細胞捕獲通道內(nèi)，使其在細胞捕獲通道中孵育，再用結(jié)合緩沖液沖洗，制得微流控芯片。上述的制備方法，所述步驟(2)中，烘干固化的溫度優(yōu)選為70°C 90°C，熱烘時間優(yōu)選為2 6小時。上述的制備方法，所述步驟(3)中，氫氟酸溶液的體積分數(shù)優(yōu)選為10% 40%。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種癌細胞的分離方法，包括以下步驟:
(I)向含有目標癌細胞的樣本中加入核酸適體溶液，將混合溶液置于冰上孵育；所述核
酸適體溶液中含有的核酸適體是可與目標癌細胞進行特異性反應(yīng)結(jié)合的核酸適體，該核酸適體一般選自DNA、RNA中的一種或多種,且在該核酸適體序列的3’端修飾有生物素；基于SELEX篩選獲得的核酸適體，具有比傳統(tǒng)的捕獲探針抗體更好的化學(xué)性質(zhì)，能夠高效、特異地結(jié)合多種目標物質(zhì)，具有制備修飾簡便快速、穩(wěn)定性好、無毒性、無免疫原性等優(yōu)點；
(2 )將步驟(I)中孵育后的混合溶液通入上述微流控芯片的進樣口中，使混合溶液在所述細胞捕獲通道內(nèi)流動，室溫下孵育，混合溶液中含有的目標癌細胞通過所述生物素與親和素的結(jié)合反應(yīng)，被捕獲到所述微流控芯片的玻片載體表面，混合溶液中的其他成分則通過所述出樣口流出，實現(xiàn)對目標癌細胞的分離。上述的分離方法中，所述目標癌細胞包括各種類型的癌細胞，優(yōu)選是指淋巴癌細胞、肺癌細胞或肝癌細胞；所述樣本甚至可以為復(fù)雜的人體全血樣本。通過采用本發(fā)明的分離方法對含目標癌細胞的樣本進行分離，這不僅為各種癌細胞的后續(xù)科學(xué)研究提供了手段和前提，而且借助熒光分析等現(xiàn)有技術(shù)可以有效實現(xiàn)對癌細胞的定性和定量檢測。上述的癌細胞的分離方法，所述步驟(2)中，混合溶液優(yōu)選是以0.5 mL/h 3 mL/h的流速通入到微流控芯片的進樣口中；室溫下孵育的時間優(yōu)選為5min 15min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明的微流控芯片不僅制備方法快速，親和素固定方法簡單，而且通過將微流控芯片技術(shù)與核酸適體檢測技術(shù)結(jié)合，能根據(jù)不同的待檢癌細胞使用有針對性的核酸適體，檢測靈敏度更高，特異性更好。本發(fā)明制得的微流控芯片可用于從含有復(fù)雜細胞成份的樣本(例如全血或組織)中，進行細胞、尤其是癌細胞的捕獲和分離，具有操作簡便、集成度高的特點。由于微流控芯片的模具、芯片本身均可重復(fù)使用，且無需復(fù)雜的表面修飾過程，因此本發(fā)明產(chǎn)品的制備成本更低，具有更好的經(jīng)濟性和應(yīng)用推廣價值。


圖1為本發(fā)明實施例中微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為實施例中本發(fā)明癌細胞分離方法的目標癌細胞熒光捕獲結(jié)果。圖3為實施例中對照樣品癌細胞分離方法的目標癌細胞熒光捕獲結(jié)果。圖4為本發(fā)明實施例中微流控芯片的玻璃表面被氫氟酸腐蝕前表面形貌的掃描電鏡照片。圖5為本發(fā)明實施例中微流控芯片的玻璃表面被氫氟酸腐蝕后表面形貌的掃描電鏡照片。圖6為本發(fā)明實施例中對玻璃表面進行氫氟酸腐蝕處理后得到的目標細胞熒光捕獲結(jié)果圖。圖7為本發(fā)明實施例中未對玻璃表面進行氫氟酸腐蝕處理得到的目標細胞熒光捕獲結(jié)果圖。圖例說明:
1、進樣口 ；2、出樣口 ；3、細胞捕獲通道；4、PDMS聚合物芯片；5、玻片載體；6、親和素；
7、底表面。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。實施例:一種如圖1所示本發(fā)明的基于核酸適體的可捕獲癌細胞的微流控芯片，該微流控芯片由上層可透光透氣的PDMS聚合物芯片4和下層的玻片載體5可逆封接而成，微流控芯片上設(shè)有進樣口 I和出樣口 2，PDMS聚合物芯片4和玻片載體5之間設(shè)有蛇形狀的細胞捕獲通道3，細胞捕獲通道3將進樣口 I和出樣口 2連通，細胞捕獲通道3的內(nèi)上表面設(shè)有自上往下突出的魚骨形結(jié)構(gòu)，細胞捕獲通道3的底表面7為凹凸不平的玻片載體表面(參見圖1中的局部放大圖和圖4);細胞捕獲通道3的底表面上固定有親和素6。上述的微流控芯片中，凹凸不平的玻片載體表面是經(jīng)過氫氟酸腐蝕處理后成型得到。本實施例的微流控芯片的制備方法包括以下步驟:
(I )PDMS聚合物芯片:首先制作PDMS聚合物芯片模具，使用AutoCAD軟件繪制PDMS聚合物芯片掩膜版圖，并使用高分辨率激光打印機(分辨率12000 dpi)打印在透明膠片上制得光刻掩膜板，然后利用此光刻掩膜板(在中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所)并通過光刻工藝制作SU-8負性光刻膠芯片模具；
(2)PDMS澆鑄:將PDMS前聚體與固化劑(牌號:sygard184，美國道康寧公司的產(chǎn)品)按10: I質(zhì)量比進行物理混合，經(jīng)超聲 、充分攪拌，真空脫氣20min等步驟后澆鑄在上述步驟(I)制得的陽版芯片模具上，80°C熱烘2小時，自然冷卻，得到PDMS聚合物芯片4 ；
(3)氫氟酸處理:將體積分數(shù)為10%的氫氟酸溶液均勻涂覆在一潔凈的玻璃表面，自然處理60s后洗凈，用氮氣吹干，得到玻片載體5 ;氫氟酸處理前、后的玻璃表面分別如圖4和圖5所示；由圖4和圖5可見，處理前的玻璃表面相對平整，而處理后的玻璃表面則表現(xiàn)出明顯的凹凸不平；采用氫氟酸腐蝕玻璃表面，能夠增大玻璃表面的粗糙度，提高通道底部的表面積，提高親和素的修飾密度，進一步增加層流增大細胞與基底的接觸幾率，達到增大目標細胞捕獲效率的目的；
(4)鍵合:在無塵環(huán)境下將步驟(2)制得的PDMS聚合物芯片4從芯片模具上小心揭下，并將其與步驟(3)制得的玻片載體5分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后加壓可逆鍵合，得到半成品；
(5)親和素的修飾:將含有l(wèi)mg/mL親和素的磷酸緩沖液通過進樣口通入上述半成品的細胞捕獲通道內(nèi)，使其充滿細胞捕獲通道，并停留30s，再用結(jié)合緩沖液沖洗(含DPBS，4.5g/L 葡萄糖，5 mmol /T, MgCl2,0.1 mg/mL yeast tRNA, I mg/mL BSA, 10% FBS),制得微流控芯片成品。一種本發(fā)明的癌細胞的分離方法，其用到上述本實施例的微流控芯片，具體包括以下步驟:
(I)取適量人全血樣本，加入一定量的經(jīng)熒光染色標記的目標癌細胞(本實施例中選用CCRF-CEM人急性成淋巴細胞性白血病細胞)，向含有目標癌細胞的人全血樣本中加入核酸適體溶液(使其在混合樣本溶液中的濃度為I μ mol/L)，將混合溶液置于冰上孵育IOmin;本實施例中的核酸適體溶液中含有的核酸適體是可與目標癌細胞進行特異性反應(yīng)結(jié)合的核酸適體SgcS (通過SELEX技術(shù)篩選獲得，核苷酸序列如下)，且在該核酸適體序列的3’端修飾有生物素；該核酸適體序列為:
5’ -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGATTTTTTTTTT-3’ -biotin ；
基于SELEX篩選獲得的核酸適體，具有比傳統(tǒng)的捕獲探針(如抗體)更好的化學(xué)性質(zhì)，能夠高效、特異地結(jié)合多種目標物質(zhì)，具有制備修飾簡便快速、穩(wěn)定性好、無毒性、無免疫原性等優(yōu)點；
(2)將步驟(I)中孵育后的混合溶液通入上述微流控芯片的進樣口 I中，使混合溶液在其細胞捕獲通道3內(nèi)以2 mL/h的流速流動，在室溫下孵育7min，混合溶液中含有的目標癌細胞通過生物素與親和素的結(jié)合反應(yīng)，被捕獲到微流控芯片的玻片載體5的底表面7上，混合溶液中的其他成分則通過出樣口 2流出，實現(xiàn)對目標癌細胞的分離；3倍于樣本體積的沖洗緩沖液(含DPBS，4.5 g/L葡萄糖，5 mmol/L MgCl2)沖洗后在熒光顯微鏡下進行檢測和計數(shù)?？紤]到傳統(tǒng)方法是先將核酸適體溶液首先通入微流控芯片中，將其固定在微流控芯片細胞捕獲通道的底部，而本發(fā)明是先將核酸適體溶液與樣品進行均勻混合，使大量的核酸適體結(jié)合在目標癌細胞的表面，再通入微流控芯片后，癌細胞與芯片基底的親和素結(jié)合的面積與幾率會明顯提高，從而提高捕獲效率。基于此，選取一組相同樣品作為上述本實施例癌細胞分離方法的 對照，其分離過程與本實施例癌細胞的分離方法類似，但是在步驟
(I)中，不是先將核酸適體溶液與樣品混合孵育，而是采用先將核酸適體固定在微流控芯片的細胞捕獲通道3的底表面，再直接將樣品通入到微流控芯片的細胞捕獲通道3內(nèi)。本實施例上述的分離方法與對照樣品的目標癌細胞熒光捕獲結(jié)果分別如圖2和圖3所示。對比圖2和圖3可見，同樣的待測樣品，本發(fā)明方法分離出的癌細胞數(shù)量明顯多于對照樣品，SP本發(fā)明的分離方法相比對照樣品的方法具有更好的靈敏度，癌細胞的捕獲能力更強。基于此，另外選取A、B兩組相同樣品，同樣采用上述本實施例癌細胞分離方法進行分離，但是B組中使用的微流控芯片的玻片載體未經(jīng)過氫氟酸腐蝕處理，本實施例上述的芯片玻璃表面處理與對照樣品的目標癌細胞熒光捕獲結(jié)果分別如圖6和圖7所示。對比圖6和圖7可見，同樣的待測樣品，本發(fā)明對玻片載體進行處理后，癌細胞捕獲能力顯著增強，檢測靈敏度提高，且特異性好，模具可重復(fù)使用，無需復(fù)雜的表面修飾過程。
權(quán)利要求
1.一種基于核酸適體的可捕獲癌細胞的微流控芯片，所述微流控芯片由上層PDMS聚合物芯片和下層的玻片載體可逆封接而成，所述微流控芯片上設(shè)有進樣口和出樣口，所述PDMS聚合物芯片和玻片載體之間設(shè)有蛇形狀的細胞捕獲通道，所述細胞捕獲通道將所述進樣口和出樣口連通，所述細胞捕獲通道的內(nèi)上表面設(shè)有自上往下突出的魚骨形結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述細胞捕獲通道的底表面為凹凸不平的玻片載體表面；所述細胞捕獲通道的底表面上固定有親和素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述凹凸不平的玻片載體表面是經(jīng)過氫氟酸腐蝕處理后成型得到。
3.一種微流控芯 片的制備方法，包括以下步驟: (1)PDMS聚合物芯片:先用繪圖軟件繪制PDMS聚合物芯片掩膜版圖，并使用高分辨率激光打印機打印在透明膠片上制得光刻掩膜板，然后利用此光刻掩膜板并通過光刻工藝制作得到芯片模具； (2)PDMS澆鑄:將PDMS前聚體與固化劑按常規(guī)質(zhì)量比進行物理混合，充分攪拌，真空脫氣后澆鑄在上述步驟(I)制得的芯片模具上，烘干固化后冷卻，得到PDMS聚合物芯片； (3)氫氟酸處理:將氫氟酸溶液均勻涂覆在一潔凈的玻璃表面，靜置后用水洗凈，用氮氣吹干，得到玻片載體； (4)鍵合:將步驟(2)制得的PDMS聚合物芯片與步驟(3)制得的玻片載體加壓可逆鍵合，得到半成品； (5)親和素的修飾:將含有親和素的磷酸緩沖液通過半成品的進樣口通入到半成品的細胞捕獲通道內(nèi)，使其在細胞捕獲通道中孵育，再用結(jié)合緩沖液沖洗，制得微流控芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，烘干固化的溫度為70°C 90°C，熱烘時間為2 6小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，氫氟酸溶液的體積分數(shù)為10% 40%。
6.一種癌細胞的分離方法，包括以下步驟: (I)向含有目標癌細胞的樣本中加入核酸適體溶液，將混合溶液置于冰上孵育；所述核酸適體溶液中含有的核酸適體是可與目標癌細胞進行特異性反應(yīng)結(jié)合的核酸適體，且在該核酸適體序列的3’端修飾有生物素； (2 )將步驟(I)中孵育后的混合溶液通入權(quán)利要求1或2所述微流控芯片的進樣口中，使混合溶液在所述細胞捕獲通道內(nèi)流動，在室溫下孵育，混合溶液中含有的目標癌細胞通過所述生物素與親和素的結(jié)合，被捕獲到所述微流控芯片的玻片載體表面，混合溶液中的其他成分則通過所述出樣口流出，實現(xiàn)對目標癌細胞的分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的癌細胞的分離方法，其特征在于:所述目標癌細胞包括淋巴癌細胞、肺癌細胞或肝癌細胞，所述樣本為人體全血樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的癌細胞的分離方法，其特征在于:所述步驟(2)中，混合溶液是以0.5 mL/h 3 mL/h的流速通入到微流控芯片的進樣口中；室溫下孵育的時間為5min 15min0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于核酸適體的可捕獲癌細胞的微流控芯片，由上層聚合物芯片和下層玻片載體可逆封接而成，兩者之間設(shè)有細胞捕獲通道，通道底表面表現(xiàn)為凹凸不平；底表面上固定有親和素。微流控芯片的制備包括以下步驟先通過光刻制作芯片模具，再澆鑄得到聚合物芯片；玻片載體經(jīng)氫氟酸處理后與聚合物芯片鍵合；最后在細胞捕獲通道內(nèi)固定親和素制得微流控芯片。本發(fā)明的微流控芯片可用于癌細胞的分離，分離時先向樣本中加入修飾有生物素的核酸適體，孵育；將孵育后的混合溶液通入微流控芯片中，混合溶液中的目標癌細胞通過生物素與親和素的結(jié)合，實現(xiàn)對目標癌細胞的分離。本發(fā)明具有細胞捕獲效率高、操作簡便、通用性強、成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12M1/00GK103087899SQ20131001726
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者羊小海, 王青, 王柯敏, 趙慶 申請人:湖南大學(xué)