核酸適配體在識別并結(jié)合整合素α4中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)與臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及核酸適配體在識別并結(jié)合整 合素a4中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適配體（aptamer)是一類能與祀標物質(zhì)的特異性相互作用的單鏈DNA、RNA、 膚核酸或化學(xué)修飾的核酸序列，通常由15-80個核巧酸組成。核酸適配體可W形成特定的 S維結(jié)構(gòu)與祀標分子高親和力結(jié)合，如發(fā)卡、假結(jié)、G-四鏈體等結(jié)構(gòu)，高特異性地結(jié)合作用 是通過范德華力、氨鍵、靜電作用和疏水作用等分子間相互作用實現(xiàn)的。其具有親和力高、 特異性好、無免疫原性、易合成、改造與修飾、生物化學(xué)穩(wěn)定性好、能可逆變性與復(fù)性等特 性，所W被稱之為"化學(xué)抗體"。
[0003]核酸適配體可被應(yīng)用在一些疾病的診斷和檢測、藥物祀點定位、新藥研發(fā)和運輸 相關(guān)藥物分子等領(lǐng)域，目前，用于治療癌癥、艾滋病等疾病的核酸適配體也不斷涌現(xiàn)。例如， 由Eyetch/Pfizer開發(fā)的祀向VEGF的核酸適配體（商品名Macugen) 2004年已獲得抑A的 批準，成功地用于治療年齡相關(guān)的黃斑變性。近年提出的利用細胞-SELEX技術(shù)篩選特異性 核酸適配體，進而發(fā)現(xiàn)腫瘤標志物的方法具有好的應(yīng)用前景。但目前只有極少數(shù)成功的例 子，其中的瓶頸問題就在于位于細胞膜上的核酸適配體祀分子的純化/鑒定。
[0004] 整合素a4又稱CD49d，與整合素0 1亞單位（CD29)組成a4 0 1整合素。主要表 達于胸腺細胞、單核細胞、淋己細胞等，配體是VCAM-1和纖連蛋白，能為T細胞活化和增殖 提供協(xié)同刺激信號，參與淋己細胞間黏附W及白細胞向炎癥部位遷移，同時其也表達于一 些實體瘤表面。研究表明；血栓的形成、白細胞的轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移都與整 合蛋白的激活有關(guān)，其中，CD49d的異常表達與某些血液疾病的發(fā)病及預(yù)后有關(guān)，如CD49d 與慢性淋己細胞性白血?。ɑ痳oniclymphoidleukemia,化L)預(yù)后關(guān)系密，所WCD49d被 作為基于流式細胞儀分析慢性淋己細胞白血病的生物標志物。
[0005] 多發(fā)性硬化癥（M巧是一種常見的慢性、炎癥性、脫髓銷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，損 害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓銷質(zhì)，從而造成神經(jīng)功能缺損，該種損傷往往會導(dǎo)致嚴重殘疾。每 100000人中有2-150人發(fā)病，全世界有超過一百萬人受到該種疾病的困擾，種族和地理紳 度的不同其發(fā)病率也不同。那他珠單抗（化talizumab)是ELAN公司研究開發(fā)的人源化單 抗，作用祀點整合素a4, 2004年被美國抑A批準，2006年被歐盟EMA批準，目前已經(jīng)在加拿 大、瑞±、澳大利亞等65個W上國家被批準上市，商品名Tys油ri，主要用于多發(fā)性硬化癥 的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供核酸適配體或其衍生物的新用途。
[0007] 本發(fā)明提供了核酸適配體或其衍生物在識別并結(jié)合或輔助識別并結(jié)合整合素a4 中的應(yīng)用；
[0008] 或核酸適配體或其衍生物在制備識別并結(jié)合或輔助識別并結(jié)合整合素a4的產(chǎn) 品中的應(yīng)用；
[0009] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0010] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在識別并結(jié)合或輔助識別并結(jié)合活性整 合素a4中的應(yīng)用；
[0011] 或核酸適配體或其衍生物在制備識別并結(jié)合或輔助識別并結(jié)合活性整合素a4 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0012] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0013] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在檢測或輔助檢測與抗整合素a4的抗 體結(jié)合的物質(zhì)中的應(yīng)用；
[0014] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測或輔助檢測與抗整合素a4的抗體結(jié)合的 物質(zhì)的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0015] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0016] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在檢測或輔助檢測待測樣品是否含有整 合素a4中的應(yīng)用；
[0017] 或核酸適配體或其衍生物在檢測或輔助檢測待測樣品中整合素a4的含量中的 應(yīng)用；
[0018] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測或輔助檢測待測樣品是否含有整合素a4 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0019] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測或輔助檢測待測樣品中整合素a4的含量 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0020] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0021] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在制備診斷和/或治療多發(fā)性硬化癥的 產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0022] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述衍生物為如下（1)-(6)中任一所述的核酸適配體的衍生物：
[0024] (1)將序列1所示的核酸適配體刪除或增加一個或幾個核巧酸，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[00巧](2)將序列1所示的核酸適配體進行核巧酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體 具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0026] (3)將序列1所示的核酸適配體的骨架改造為硫代磯酸脂骨架，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0027](4)由序列1所示的核酸適配體編碼的RNA分子，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體衍生物；
[0028] (5)由序列1所示的核酸適配體編碼的膚核酸，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0029] (6)將序列1所示的核酸適配體的一端或中間接上信號分子和/或活性分子和/ 或功能基團，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0030] 所述化）中的功能基團為生物素基團或巧光基團。
[0031] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端或3'端標記 巧光基團或生物素基團。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端標記巧光基團 或生物素基團。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述待測樣品為細胞；所述細胞具體為大鼠肺泡上皮細胞RAEC、人 胚胎肺纖維細胞MRC-5、人肺泡上皮細胞A549、人宮頸癌細胞化la、人肝癌細胞化h-7、人膀 脫癌細胞T24、人肝細胞癌細胞SK-Hep-1、人乳腺癌細胞MCF-7、人乳腺癌細胞MCF-7R、人卵 巢癌細胞SK0V-3、人白血病細胞K562、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人類上皮癌細胞A431、人 類T細胞白血病細胞化rkatE6-1、人回盲腸腺癌細胞肥T-8、人胚胎腎細胞肥K-293、人前 列腺癌細胞PC-3、人類T細胞淋己瘤化t-78或人結(jié)腸癌細胞LoVo。
[0034] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)品。
[0035] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為序列1所示的核酸適配體或其衍生物；所述產(chǎn)品 的用途為如下1)-6)中的至少一種：
[0036] 1)識別并結(jié)合或輔助識別并結(jié)合整合素a4;
[0037] 2)識別并結(jié)合或輔助識別并結(jié)合活性整合素a4;
[0038] 3)檢測或輔助檢測待測樣品的整合素a4的含量；
[0039] 4)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有整合素a4;
[0040] 5)檢測或輔助檢測與抗整合素a4的抗體結(jié)合的物質(zhì)；
[0041] 6)診斷和/或治療多發(fā)性硬化癥。
[0042] 上述產(chǎn)品中，所述衍生物為如下（1)-(6)中任一所述的核酸適配體的衍生物：
[0043](1)將序列1所示的核酸適配體刪除或增加一個或幾個核巧酸，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0044] (2)將序列1所示的核酸適配體進行核巧酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體 具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0045] (3)將序列1所示的核酸適配體的骨架改造為硫代磯酸脂骨架，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0046] (4)由序列1所示的核酸適配體編碼的RNA分子，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體衍生物；
[0047] (5)由序列1所示的核酸適配體編碼的膚核酸，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0048] (6)將序列1所示的核酸適配體的一端或中間接上信號分子和/或活性分子和/ 或功能基團，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0049] 所述化）中的功能基團為生物素基團或巧光基團。
[0050] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端或3'端標記 巧光基團或生物素基團。
[0051] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端標記巧光基團 或生物素基團。
[0052] 上述產(chǎn)品中，所述待測樣品為細胞；所述細胞具體為大鼠肺泡上皮細胞RAEC、人 胚胎肺纖維細胞MRC-5、人肺泡上皮細胞A549、人宮頸癌細胞化la、人肝癌細胞化h-7、人膀 脫癌細胞T24、人肝細胞癌細胞SK-Hep-1、人乳腺癌細胞MCF-7、人乳腺癌細胞MCF-7R、人卵 巢癌細胞SK0V-3、人白血病細胞K562、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人類上皮癌細胞A431、人 類T細胞白血病細胞化rkatE6-1、人回盲腸腺癌細胞肥T-8、人胚胎腎細胞肥K-293、人前 列腺癌細胞PC-3、人類T細胞淋己瘤化t-78或人結(jié)腸癌細胞LoVo。
[0053] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)核酸適配體Sgc-4e可W特異性識別并結(jié)合整合素a4,并利用核 酸適配體Sgc-4e與整合素a4的特異性結(jié)合作用建立了檢測整合素a4的方法。通過實驗 證明；本發(fā)明的核酸適配體Sgc-4e具有親和力高、特異性強、無免疫原性和無毒性等特點， 基于核酸適配體Sgc-4e建立的檢測整合素a4的方法可為治療多發(fā)性硬化癥提供了新的 策略。
【附圖說明】
[0054] 圖1為Sgc-4e-Bio提取的整合素a4蛋白代表性的多膚的ESI-MS和MS/MS圖譜。 圖1A為重型同位素標記的[M+2田"離子ESI-MS譜圖；圖1B為輕型同位素標記的[M+2田" 離子ESI-MS譜圖；圖1C為重型同位素標記的[M+2田"離子MS/MS譜圖，其中，R*表示重型 同位素標記的精氨酸；圖1D為輕型同位素標記的[M+2田"離子MS/MS譜圖。
[00巧]圖2為用Sgc-4e-FAM和anti-CD49d-PE或anti-CD29-陽抗體共染色的化rkat E6-1細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。其中，L45-FAM是巧光素標記的對照核酸序列；IgG-PE 是對照抗體。
[0056] 圖3為抗整合素a4抗體或核酸適配體Sgc-4e分別與野生型K562細胞或轉(zhuǎn)染后 穩(wěn)定表達整合素a4的K562細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。
[0057]圖