專利名稱：一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)篩選到一種可同時識別 N- (3-氧化十二燒酸基)-L-同型絲氛酸內(nèi)酷[N- (3-oxododecanoyI) -L-homoserinelactone, OdDHL]和 N- 丁酸高絲氨酸內(nèi)酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)的核酸適體及其應(yīng)用，即一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:銅綠假單胞菌(Pseudomonase aeruginosa, PA)是臨床上最常見的一種非發(fā)酵革蘭氏陰性致病菌。它對臨床上應(yīng)用的大部分抗生素都具有較強的耐藥性，而且其耐藥性的發(fā)展速度非?？欤瑯O易對新型抗生素產(chǎn)生耐藥性，這極大地影響了其感染的治療。研究表明，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的各種嚴重感染與其毒力因子的釋放密切相關(guān)，而銅綠假單胞菌的絕大部分毒力因子的表達都受其群體效應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing，QS)的正性調(diào)控。N-(3_氧化十二燒?；?-L_同型絲氨酸內(nèi)酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, OdDHL)和 N-丁酸高絲氨酸內(nèi)酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)分別是銅綠假單胞菌群體效應(yīng)系統(tǒng)的Ias和rhl信號途徑的信號分子。銅綠假單胞菌在生長過程中，不斷向細胞外分泌這兩種信號分子。當細菌周圍環(huán)境中的信號分子濃度達到閾值時，便可激活這兩個信號途徑，從而啟動銅綠假單胞菌毒力基因的表達，增強銅綠假單胞菌的致病性。研究發(fā)現(xiàn)，干擾銅綠假單胞菌的群體效應(yīng)系統(tǒng)可以抑制細菌毒力，降低其致病性，具有治療感染的作用。目前，國外已經(jīng)報道了一類可以與OdDHL結(jié)合的鼠源性單克隆抗體，親和力在5nM 150nM之間。這類抗體在體外實驗中可結(jié)合OdDHL分子，干擾銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而可抑制細菌毒力的表達。然而，這類抗體雖然具有治療銅綠假單胞菌感染的潛在價值，但是這種抗體只能結(jié)合OdDHL和BHL兩種分子中的一種，不能完全阻斷PA的QS系統(tǒng)的激活，因而阻斷PA毒力的表達的效果有限。此外，由于鼠源性抗體對人類來說是一種異種蛋白，如果直接將OdDHL的鼠源性單克隆抗體應(yīng)用于人體的治療，人體可產(chǎn)生針對鼠抗的抗體(人抗鼠反應(yīng))，從而與抗體結(jié)合并清除鼠抗，降低其的療效。而且，直接應(yīng)用鼠源性抗體還可能會誘發(fā)過敏反應(yīng)，對患者造成損傷。由此，鼠源性抗體需要通過人源化改造后才能應(yīng)用于人體，但是，鼠源性抗體的人源化改造是一個復(fù)雜、費時的過程，對技術(shù)要求相當高，而且在改造過程中容易導(dǎo)致抗體親和力降低，甚至完全喪失，這導(dǎo)致鼠源性抗體應(yīng)用于治療的開發(fā)逐漸被放棄。與抗體相比，核酸適體是通過體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化)從DNA/RNA文庫中篩選出來的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸片段(ssDNA或ssRNA)，它具有高特異性和親和力識別其靶標分子，一些與疾病密切相關(guān)的生長因子、酶、受體等物質(zhì)均能成為核酸適體的靶標，而且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此，亟需要研究和發(fā)展能夠特異性抑制銅綠假單胞菌毒性的核酸適體，從而為疾病治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的在于提供一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應(yīng)用，它能夠解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種易于制備、節(jié)約成本、安全性好的能夠與OdDHL和BHL均發(fā)生高親和力和高特異性結(jié)合的核酸適體，以及上述核酸適體在制備抑制銅綠假單胞菌毒性的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案:一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體，其特征在于:所述核酸適體的核苷酸序列為 GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。所述核酸適體的應(yīng)用，其特征在于:用于干擾銅綠假單胞菌的群體效應(yīng)系統(tǒng)的Ias和rhl信號途徑，抑制群體效應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的毒素分泌以及生物膜的形成，抗銅綠假單胞菌感染。 所述核酸適體的篩選方法，其特征在于它由以下步驟構(gòu)成:1、OdDHL類似物與載體的偶聯(lián):OdDHL類似物與EDC分別溶于預(yù)冷的MES緩沖液中，配制成濃度均為20mg/ml的溶液。用MES緩沖液充分洗滌氨基化納米磁顆粒，然后加入等體積的上述兩種溶液，20°C反應(yīng)2h。在此條件下，OdDHL類似物通過其分子中的羧基與氨基化納米磁顆粒表面的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，使分子偶聯(lián)到氨基化納米磁顆粒的表面；偶聯(lián)結(jié)束后，用Tris-HCl緩沖液充分洗滌去除EDC及未偶聯(lián)的OdDHL類似物后，獲得的偶聯(lián)有OdDHL類似物的氨基化納米磁顆粒備用；2、隨機單鏈DNA文庫的設(shè)計:隨機單鏈DNA文庫是兩端為固定的引物序列、中間為35個堿基的隨機序列:5 ’ -GCAATGGTACGGTACTTCC- (N35) -CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3 ’，其中，N35 表示 35 個隨機核苷酸；3、核酸適體的篩選:3.1核酸適體與OdDHL類似物結(jié)合:3.1.1隨機單鏈DNA文庫的預(yù)處理:將步驟2設(shè)計的隨機單鏈DNA文庫于95°C變性5min后立即置于冰中l(wèi)Omin，然后用選擇緩沖液稀釋至所需體積；3.1.2隨機單鏈DNA文庫中單鏈DNA與OdDHL類似物的結(jié)合:將經(jīng)過預(yù)處理后的隨機單鏈DNA文庫與選擇緩沖液(含pH7.4的50 mmol/LTris-HCl 含 1% BSA、0.01% 鮭魚精 DNA、100 mmol/L NaClU mmol/L MgCl2,5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20 )混合后，加入到步驟I獲得的偶聯(lián)有OdDHL類似物的氨基化納米磁顆粒中，并于37°C緩慢顛倒混合溫育45min,在磁力架上靜置5min,再用洗漆緩沖液連續(xù)洗滌10次，去除未與靶分子結(jié)合及結(jié)合不牢固的單鏈DNA ；3.2 OdDHL 競爭篩選:向結(jié)合有核酸適體的納米磁性顆粒中加入20mg/ml的OdDHL溶液，使OdDHL與OdDHL類似物競爭性結(jié)合核酸適體，與OdDHL結(jié)合的核酸適體即進入溶液中；3.3單鏈DNA的制備:取步驟3.2所得的溶液作為PCR模版，用第一引物和生物素標記的第二引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行回收，然后加入到鏈親和素磁納米磁顆粒中，室溫下溫育30min后，上磁力架，去掉上清，向鏈親和素納米磁顆粒中加入200mol/L的氫氧化鈉溶液，使目的單鏈DNA脫離納米磁顆粒；然后在磁力架上靜置后，取上清，用200mmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8-7.2，所獲得的單鏈DNA即可用于下一輪篩選；3.4核酸適體與OdDHL類似物結(jié)合:將步驟3.3所獲得的核酸適體按照步驟3.1.2中所述方法與OdDHL類似物結(jié)合，并進行洗滌；3.5 BHL 競爭篩選:3.5.1向步驟3.4中結(jié)合有核酸適體的納米磁性顆粒中加入20mg/ml的BHL溶液，使BHL與OdDHL類似物競爭性結(jié)合核酸適體，與BHL結(jié)合的核酸適體即進入溶液中；3.5.2單鏈DNA的制備方法同3.3:3.5.3將所得ssDNA按照步驟3.1-3.3進行下一輪篩選；3.6反向篩選:為了除去文庫中可能存在的與氨基化磁珠本身結(jié)合的核酸適體，在每兩輪正向篩選之間，進行一次反向篩選:將經(jīng)過篩選后獲得的單鏈DNA加入到未與OdDHL類似物偶聯(lián)的氨基化納米磁顆粒中，于37°C緩慢顛倒混合溫育45min,使氨基化納米磁顆粒與核酸適體充分結(jié)合，然后在磁力架上靜置后，取上清，用上清進行下一輪篩選；3.7克隆測序:經(jīng)過上述多輪篩選后，將篩選所獲的PCR產(chǎn)物，克隆入T-A克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，取陽性克隆進行測序，制備核酸適體單鏈DNA并檢測親和力，最終獲得核酸適體。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:1、本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選到一種能夠與OdDHL和BHL高親和力結(jié)合的核酸適體，該核酸適體能同時結(jié)合OdDHL和BHL，因而具有高效干擾銅綠假單胞菌的群體效應(yīng)系統(tǒng)，抑制銅綠假單胞菌毒力基因的表達的作用。由于干擾細菌群體效應(yīng)系統(tǒng)并不具有殺菌或者抑菌的作用，不對細菌的生長產(chǎn)生選擇壓力，因此，本發(fā)明的核酸適體既具有抗銅綠假單胞菌感染的潛力，又不存在誘發(fā)耐藥性的風(fēng)險。2、核酸適體僅需要通過簡單的PCR技術(shù)即可大量制備，與抗體相比，核酸適體的生產(chǎn)過程更加簡單，成本更低，無明顯的毒性及過敏源性，而且核酸適體是一種DNA分子或者經(jīng)過修飾后的RNA，其理化性質(zhì)相當穩(wěn)定，無需特殊條件即可以穩(wěn)定保存。另一方面，單克隆抗體的分子量為160KD,而核酸適體的分子量介于4.95KD-29KD之間，在相同質(zhì)量的情況下，核酸適體捕獲的靶分子較抗體多，治療效果可能會更好，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)核酸適體具有明顯的毒性或過敏源性，因而，本發(fā)明的核酸適體完全可以替代抗體，可用于制備抑制銅綠假單胞菌毒性的試劑，其具有極佳的臨床治療應(yīng)用前景。


:圖1為OdDHLS的核磁共振氫譜圖。圖2為OdDHLS的核磁共振碳譜圖。圖3為OdDHLS在MES緩沖液(ρΗ5.0)中的穩(wěn)定性。

圖4為OdDHLS在Tris-HCl緩沖液(ρΗ7.4)中的穩(wěn)定性。
圖5為SPR檢測核酸適體與OdDHLS的親和力。圖6為熒光競爭法檢測核酸適體對OdDHL (A)和BHL (B)親和力。圖7為核酸適體抑制LasB毒素分泌的作用。
具體實施方式
:以下通過實施例對本發(fā)明進行進一步描述。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例:一種可同時識別N-(3_氧化十二烷?；?-L-同型絲氨酸內(nèi)酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, OdDHL)和 N- 丁酸高絲氨酸內(nèi)酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)的核酸適體的核苷酸序列為:GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA (SEQ ID NO:1)。所述核酸適體的篩選方法:1.主要試劑及緩沖液:1.1 OdDHL 類似物(OdDHL surrogates, OdDHLS)本發(fā)明選用的OdDHLS 為:7-oxo_7-[[(3S)-2-oxo-3-pyrrolidinyl]amino]-Heptanoic acid，是由上?？苿偎幬镅邪l(fā)有限公司合成。OdDHL和BHL購自sigma-aIdrich。OdDHLS 的化學(xué)式如下:
權(quán)利要求
1.一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體，其特征在于:所述核酸適體的核苷酸序列為 GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。
2.—種權(quán)利要求1所述可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體，其特征在于:它用于干擾銅綠假單胞菌的群體效應(yīng)系統(tǒng)的Ias和rhl信號途徑，抑制群體效應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的毒素分泌以及生物膜 的形成，抗銅綠假單胞菌感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應(yīng)用。OdDHL和BHL分別是銅綠假單胞菌群體效應(yīng)系統(tǒng)的las和rhl信號途徑的信號分子，這兩個信號途徑的激活可啟動銅綠假單胞菌毒力基因的表達。本發(fā)明采用競爭法篩選出一種可高親和力結(jié)合OdDHL和 BHL的核酸適體。該核酸適體具有干擾銅綠假單胞菌的群體效應(yīng)系統(tǒng)，抑制銅綠假單胞菌毒力基因的表達的潛力。本發(fā)明的核酸適體與OdDHL和BHL結(jié)合的親和力與抗體相當，而且制備過程更加簡單、更易于操作，且成本更低。
文檔編號C12N15/115GK103173452SQ20131002497
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者趙祖國, 吳淑慶, 楊在明 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院