專利名稱：一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法及其在促進(jìn)豬腸道健康中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在當(dāng)前，養(yǎng)豬業(yè)已成為關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要產(chǎn)業(yè)。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，仔豬是生長(zhǎng)發(fā)育最快、飼料利用率最高、開發(fā)潛力最大的一個(gè)階段，仔豬飼養(yǎng)的好壞直接影響豬整個(gè)飼養(yǎng)期的生產(chǎn)成績(jī)。然而，仔豬階段也是生存能力、生理機(jī)能最脆弱的階段，仔豬死亡率通常占整個(gè)飼養(yǎng)期死亡率的70%。仔豬成活率低和生長(zhǎng)緩慢是目前我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中面臨的主要問(wèn)題，提高仔豬飼養(yǎng)成績(jī)是保障養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展的關(guān)鍵。動(dòng)物腸道不僅是動(dòng)物體內(nèi)最大的消化吸收器官，是所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最終的吸收?qǐng)鏊?，同時(shí)也是體內(nèi)最大的免疫器官，仔豬腸道健康發(fā)育是快速生長(zhǎng)與高成活率的生理基礎(chǔ)。新生仔豬由于腸道處于快速發(fā)育之中，結(jié)構(gòu)與功能不完善，養(yǎng)分的消化吸收與免疫屏障功能有很大的局限性，難以適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境的變化，增加了飼養(yǎng)的困難。仔豬哺乳期間，初乳和常乳中都含有高水平的、可促進(jìn)腸道發(fā)育和成熟的生長(zhǎng)因子，如谷氨酰胺、表皮生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子和多胺等，斷奶后，這些因子消失，對(duì)腸細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞功能的發(fā)育產(chǎn)生不良影響。仔豬斷乳后由于受營(yíng)養(yǎng)、生理、環(huán)境和病原微生物等多種應(yīng)激因素的影響，導(dǎo)致腸道黏膜萎縮、腸道上皮完整性和腸道屏障作用被破壞以及腸道功能紊亂，引起消化不良、腹瀉、生長(zhǎng)抑制，甚至死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，斷奶仔豬腹瀉率一般在20% 30%，腹瀉死亡率占仔豬總死亡率的40%。因此，生產(chǎn)實(shí)際中迫切需要采取有效措施促進(jìn)仔豬腸道健康發(fā)育、改善消化吸收與免疫屏障功能。豬表皮生長(zhǎng)因子作為豬乳中含量較高的生長(zhǎng)因子之一，它對(duì)初生仔豬胃腸道發(fā)育有著極其重要影響。早期斷奶是縮短母豬生育周期的重要手段，而早期斷奶導(dǎo)致的斷奶應(yīng)激是影響早期斷奶仔豬生產(chǎn)性能的主要原因，通過(guò)在飼料中添加表皮生長(zhǎng)因子可以緩解斷奶應(yīng)激。盡管豬表皮生長(zhǎng)因子憑借其獨(dú)特的理化特性以及顯著的生理作用，作為飼料添加劑具有廣闊的發(fā)展前景，但是目前生產(chǎn)的豬表皮生長(zhǎng)因子都是從乳產(chǎn)品中獲得或利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所得，這兩種途徑都具有一定的局限性，從乳中分離豬表皮生長(zhǎng)因子的量有限，很難滿足市場(chǎng)需要，而利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的豬表皮生長(zhǎng)因子，由于宿主菌大腸桿菌的局限性不能直接作為飼料添加使用，存在著分離純化的難題，增加了添加成本，很難滿足市場(chǎng)需要，鑒于此本發(fā)明以公認(rèn)安全的微生物嗜酸乳桿菌為載體菌，構(gòu)建能夠表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌，并以此重組嗜酸乳桿菌作為飼料添加劑。該載體菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素的毒性 成分，并具有促進(jìn)動(dòng)物消化道益生菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌的繁殖，改善腸道環(huán)境，增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能等多種作用，已作為益生菌飼料添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。而所表達(dá)的豬表皮生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)損傷腸道上皮的修復(fù)，達(dá)到預(yù)防腹瀉的目的。因此開發(fā)仔豬用表達(dá)腸黏膜表皮生長(zhǎng)因子的重組益生菌，在飼料業(yè)與養(yǎng)豬業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究尚屬空白。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的腸道損傷而不能有效修復(fù)，現(xiàn)有技術(shù)不足而無(wú)法解決的現(xiàn)狀，提供一種重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法及用途，研發(fā)一種能夠促進(jìn)仔豬腸道粘膜損傷修復(fù)的重組嗜酸乳桿菌。本發(fā)明的重組嗜酸乳桿菌既具有嗜酸乳桿菌對(duì)腸道微生態(tài)環(huán)境的維護(hù)功能，又可以發(fā)揮重組表皮生長(zhǎng)因子對(duì)豬腸道損傷的修復(fù)功能，達(dá)到治療仔豬因各種因素導(dǎo)致的腸道損傷繼而引起的腹瀉，增加仔豬的存活率，解決生豬養(yǎng)殖過(guò)程中的瓶頸問(wèn)題。
本發(fā)明的目的可通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(I)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的獲得:提取豬下頜腺RNA，經(jīng)過(guò)RT-PCR得到cDNA，以此cDNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有Sac I和Xba I酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，上下游引物Pl和P2分別具有豬egf基因(Gene ID:X59516.1)的序列，采用PCR方法擴(kuò)增豬egf基因片段。將所擴(kuò)增的egf目的基因片段與克隆載體PMD18-T載體連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，并通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序分析驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pMD18T_egf，重組質(zhì)粒序列測(cè)定表明該質(zhì)粒具有豬egf的基因序列。
(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pMG36e_egf的構(gòu)建:將乳酸菌表達(dá)載體pMG36e和克隆質(zhì)粒pMD18T-egf用限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I進(jìn)行雙酶切，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和egf目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)紅霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，命名為pMG36e-egf，其具有豬egf的基因序列。
(3)重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建:采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pMG36e_egf轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態(tài)細(xì)胞中，利用紅霉素抗性進(jìn)行篩選，得到重組菌，命名為:NZ6092-egfo
(4)豬表皮生長(zhǎng)因子 在嗜酸乳桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá):將所構(gòu)建的重組嗜酸乳桿菌NZ6092-egf接種于含有100ug/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，摸索其誘導(dǎo)表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-page和Western Blot分析。誘導(dǎo)表達(dá)。得到大小為6Kda左右的蛋白條帶。
(5)基因重組菌的防腹瀉效果:將所構(gòu)建的基因重組嗜酸乳桿菌飼喂仔豬，觀察其防治仔豬腹瀉的效果。
一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的重組益生菌的用途，所述的表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的重組益生菌的應(yīng)用是通過(guò)飲水或飼料中添加，促進(jìn)豬胃腸道健康，防治仔豬腹瀉的發(fā)生，提聞生長(zhǎng)性能。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)細(xì)胞因子egf的重組益生菌，具有傳統(tǒng)益生菌無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。該重組益生菌既有嗜酸乳桿菌的改善腸道環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)；所表達(dá)的細(xì)胞因子egf又具有修復(fù)腸道損失的功效?？梢宰鳛橐环N新型的飼料添加劑。


圖1為豬egf基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳2為克隆載體pMD18T_egf酶切電泳3為表達(dá)載體pMG36e_egf酶切電泳4為誘導(dǎo)表達(dá)的egf的western-blot分析
具體實(shí)施例方式實(shí)施例參見(jiàn)附圖1-圖4，本發(fā)明所述表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌采用以下方法構(gòu)建:根據(jù)已公開的豬表皮生長(zhǎng)因子(egf)的基因序列及表達(dá)載體質(zhì)粒的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)含有特異酶切位點(diǎn)的引物；以豬下頜腺為材料，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有egf基因片段，并將其與表達(dá)載體質(zhì)粒pMG36e進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pMG36e_egf,通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行表達(dá)。并以所構(gòu)建的重組豬表皮生長(zhǎng)因子的嗜酸乳桿菌飼喂動(dòng)物，觀察其防治腹瀉的效果。本發(fā)明的所需的實(shí)驗(yàn)材料及具體實(shí)施方式
如下:一)實(shí)驗(yàn)材料(I)目的基因序列

豬表皮生長(zhǎng)因子EGF的基因序列來(lái)自于NCBI Genebank中。(2)載體Nisin誘導(dǎo)性表達(dá)載體pMG36e購(gòu)自湖南瀛潤(rùn)生物科技有限公司。pMD18-T克隆載體購(gòu)自Takara生物科技有限公司。(3)菌株大腸桿菌DH5a購(gòu)自Takara生物科技有限公司，受體菌嗜酸乳桿菌NZ6092購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。二)實(shí)施方案1、豬表皮生長(zhǎng)因子EGF基因的獲得以報(bào)道的豬表皮生長(zhǎng)因子的基因序列(GeneID:X59516.1)為模板，設(shè)計(jì)合成含有Sac I 和 Xba I 酶切位點(diǎn)的 h下游引物 Pl:5~GGAGCTCCGAATAGTTACTCTGAAT~3 (Sac I),如 SEQID N0.2 和 P2:5~TATCTAGACGCAGCTCCCACCATTT~3 (Xba I)，如 SEQID N0.3 ;提取豬下頜腺RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增豬egf基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后回收PCR產(chǎn)物。將所擴(kuò)增回收的egf目的基因片段與克隆載體PMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，酶切鑒定正確后重組質(zhì)粒命名為pMD18T-egf。同時(shí)將重組質(zhì)粒送往北京奧克生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。2、重組表達(dá)載體的pMG36e的構(gòu)建將乳酸菌表達(dá)載體pMG36e和克隆質(zhì)粒pMD18T_egf用限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和egf目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)紅霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)。鑒定正確后的重組質(zhì)粒，命名為pMG36e-egf，其具有豬egf的基因序列。
3、表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建
采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pMG36e_egf轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態(tài)細(xì)胞中，電擊條件為電壓2.5KV，電阻400 Ω，電容25 μ F。利用紅霉素抗性進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序(北京奧科生物科技有限公司)驗(yàn)證后重組菌命名為:NZ6092-egf。
4、豬表皮生長(zhǎng)因子在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS、Western Blot分析
挑取重組菌NZ6092_egf接種于含有100 μ g/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)物以3%的比例轉(zhuǎn)接于500mL含紅霉素MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600=0.5 0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑nisin，使其終濃度為5ng/mL，繼續(xù)培養(yǎng)3_5小時(shí)。重組菌裂解后經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析證明目的基因得到正確表達(dá)。重組菌經(jīng)nisin誘導(dǎo)后，在6Kda左右處出現(xiàn)一特異性蛋白條帶，與預(yù)期的大小一致。凝膠經(jīng)薄層掃描分析顯不，目的蛋白約占受:體菌總蛋白的8%。
5、表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的防腹瀉效果
以本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌菌液(含重組嗜酸乳桿菌103億/kg)與二氧化硅按照體積重量比1:50在37°C下混合制成重組嗜酸乳桿菌飼料添加劑進(jìn)行斷奶仔豬試驗(yàn)。試驗(yàn)選用6.23±0.17kg 21日齡斷奶的杜長(zhǎng)大仔豬48頭，隨機(jī)分為兩組，每組分三個(gè)重復(fù)(欄)，每欄8頭。兩組基礎(chǔ)日糧一致，試驗(yàn)組添加0.05%的重組嗜酸乳桿菌飼料添加劑，空白對(duì)照組未加重組嗜酸乳桿菌飼料添加劑。
三)實(shí)驗(yàn)效果
1、豬表皮生長(zhǎng)因子EGF基因的RT-PCR擴(kuò)增
提取豬下頜腺RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增豬egf基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約為150bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果如圖1所示。
2、克隆質(zhì)粒pMD18T_egf的酶切鑒定
克隆載體用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示酶切出大小2800bp左右的載體片段和大小約為150bp的目的基因片段，酶切結(jié)果表明克隆質(zhì)粒構(gòu)建正確。鑒定正確后重組質(zhì)粒命名為pMD18T-egf。酶切結(jié)果如圖2所示。
3、豬表皮生長(zhǎng)因子egf的序列測(cè)定
將酶切鑒定正確的克隆載體送往北京奧科生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)得，結(jié)果表明該質(zhì)粒具有豬egf的基因序列，序列如SEQ ID N0.1所不。
4、表達(dá)質(zhì)粒pMG36e_egf的酶切鑒定
表達(dá)質(zhì)粒用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示酶切出大小3600bp左右的載體片段和大小約為150bp的目的基因片段，酶切結(jié)果表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。鑒定正確后重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pMG36e-egf。酶切結(jié)果如圖3所示。
5、豬表皮生長(zhǎng)因子在乳酸乳球 菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS、Western Blot分析
重組豬EGF的嗜酸乳桿菌經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，得到大小約為6KDa的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析證明目的基因得到正確表達(dá)。結(jié)果如圖4所示。
6、表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的防腹瀉效果以本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌菌液進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響，飼養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表I。表I添加表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的重組益生菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的重組益生菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: (I)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的獲得:提取豬下頜腺RNA，經(jīng)過(guò)RT-PCR得到cDNA，以此cDNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有Sac I和Xba I酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，上下游引物Pl和P2分別具有豬egf基因(Gene ID:X59516.1)的序列，采用PCR方法擴(kuò)增豬egf基因片段。將所擴(kuò)增的egf目的基因片段與克隆載體PMD18-T載體連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，并通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序分析驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pMD18T_egf，重組質(zhì)粒序列測(cè)定表明該質(zhì)粒具有豬egf的基因序列。
(2 )重組表達(dá)載體pMG36e-egf的構(gòu)建:將乳酸菌表達(dá)載體pMG36e和克隆質(zhì)粒pMD18T-egf用限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I進(jìn)行雙酶切，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和egf目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)紅霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，命名為pMG36e-egf，其具有豬egf的基因序列。
(3)表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建:采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pMG36e-egf轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態(tài)細(xì)胞中，利用紅霉素抗性進(jìn)行篩選，得到重組菌,命名為:NZ6092-egf。
(4)豬表皮生長(zhǎng)因子在嗜酸乳桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS、WesternBlot分析:挑取重組菌NZ6092-egf接種于含有100ug/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達(dá)。得到大小為6Kda左右的蛋白條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的重組益生菌的用途，其特征在于:所述的表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子基因的重組益生菌通過(guò)飲水或飼料中添加，促進(jìn)豬胃腸道健康，防治仔豬腹瀉的發(fā) 生，提高生長(zhǎng)性能。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法及用途，根據(jù)已公開的豬表皮生長(zhǎng)因子的基因序列及表達(dá)載體質(zhì)粒特點(diǎn)，設(shè)計(jì)含特異酶切位點(diǎn)的引物；以豬下頜腺組織為材料，通過(guò)RT-PCR獲得含有豬表皮生長(zhǎng)因子基因的片段，將其與乳酸菌表達(dá)載體質(zhì)粒pMG36e進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pMG36e-egf，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入嗜酸乳桿菌內(nèi)，得到表達(dá)豬表皮生長(zhǎng)因子的重組嗜酸乳桿菌，在乳鏈菌肽(nisin)的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析證明目的基因得到正確表達(dá)。該重組菌用于防治腹瀉的發(fā)生，改善豬的腸道健康，提高生長(zhǎng)性能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103146738SQ20131003883
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者侯永清, 吳濤, 竇茂鑫, 趙迪, 丁斌鷹 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院, 武漢泛華生物技術(shù)有限公司