一種高效表達(dá)重組八因子的灌注培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高效表達(dá)重組八因子的灌注培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血八因子是目前治療血友病A (Hemophilia A, HA)的唯一治療方法，HA患者因 基因缺陷導(dǎo)致FVIII表達(dá)降低或功能缺陷，表現(xiàn)為凝血功能障礙和自發(fā)性出血。目前市售 有人血FVIII以及基因重組FVIII。但是人血FVIII產(chǎn)品仍然存在傳播不明血源性病原體 的可能，因此，在重組DNA技術(shù)的日益發(fā)展進(jìn)步下，重組FVIII產(chǎn)品越來(lái)越受到重視。
[0003] 重組FVIII是利用基因重組技術(shù)，將編碼FVIII蛋白的基因片段插入質(zhì)粒載體中， 而后將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)入能夠表達(dá)FVIII蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。由于FVIII蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因 此必須選擇哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞作為FVIII的表達(dá)載體。與細(xì)菌或酵母細(xì)胞不同，哺乳動(dòng)物 細(xì)胞具有翻譯后修飾功能，例如溶蛋白性裂解、糖基化作用、羥基化作用及硫酸鹽化作用， 這些功能是形成具有活性的FVIII蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)所必須的。但是由于FVIII是個(gè)特殊 的蛋白，糖基化比較復(fù)雜，蛋白不穩(wěn)定，在培養(yǎng)過(guò)程中受溫度等培養(yǎng)條件影響很大，為了在 發(fā)酵過(guò)程中保證rFVIII的濃度以及質(zhì)量，需要采用灌注培養(yǎng)的方式。
[0004] 灌注培養(yǎng)是指把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入生物反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的 過(guò)程中，不斷地將部分培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌入新的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)方式。連 續(xù)的灌注培養(yǎng)可以提供給細(xì)胞充分的營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)帶走代謝副產(chǎn)物，給細(xì)胞的生長(zhǎng)提供 優(yōu)良的環(huán)境，維持較高的細(xì)胞密度，使得細(xì)胞表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)，可以大幅度提高生產(chǎn)產(chǎn)率。
[0005] 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞灌注培養(yǎng)的核心技術(shù)是如果有效地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行截留，即在保證細(xì)胞密度 和活力的基礎(chǔ)上更換培養(yǎng)基。目前，常用的利用細(xì)胞截留裝置達(dá)到細(xì)胞灌注培養(yǎng)的方法主 要有：傾斜式重力沉降設(shè)備、離心細(xì)胞分離裝置、旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備（Spin filter)、聲頻灌 流裝置、中空纖維柱細(xì)胞截留裝置等。雖然能夠適用的方法種類(lèi)較多，但是這些方法均有非 常明顯的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中的各種方法均有非常明顯的缺陷。所以鑒于以上所述現(xiàn)有 技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種高效表達(dá)重組八因子的灌注培養(yǎng)方法，用于解決 現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。本發(fā)明所提供的高效表達(dá)重組八因子的灌注培養(yǎng)方法能夠同時(shí)充分發(fā) 揮截留方法和重組FVIII的灌注培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到提高并維持細(xì)胞生長(zhǎng)密度、延 長(zhǎng)生產(chǎn)周期、增加 FVIII的產(chǎn)量、并保證FVIII的質(zhì)量的效果。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種高效表達(dá)重組八因子 的灌注培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0008] 1)將重組FVIII細(xì)胞株的種子接種于反應(yīng)器中進(jìn)行批培養(yǎng)；
[0009] 2)當(dāng)培養(yǎng)體系中葡萄糖含量為0. 5-1. 5g/L時(shí)，使用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法進(jìn)入灌注 培養(yǎng)模式；
[0010] 3)當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞處于一個(gè)穩(wěn)態(tài)階段，使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法 同時(shí)進(jìn)行灌注培養(yǎng)，維持細(xì)胞密度在2-3*10 7個(gè)/ml。
[0011] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)重組FVIII細(xì)胞株的種類(lèi)和具體實(shí)驗(yàn)需求，選取合適的條 件對(duì)重組FVIII細(xì)胞株的種子進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)一步將擴(kuò)增所得的產(chǎn)物用于步驟1的接種過(guò) 程中。
[0012] 所述旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法具體指：將一個(gè)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器（旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備、Spin filter)按放在反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)軸上，進(jìn)行灌注培養(yǎng)。
[0013] 所述旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基從篩面通過(guò)，細(xì)胞位于篩面外，在旋轉(zhuǎn) 過(guò)濾籠內(nèi)有吸取管，能夠?qū)⒒\內(nèi)的培養(yǎng)液栗出，從而達(dá)到調(diào)整培養(yǎng)液參數(shù)的目的。
[0014] 所述使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法同時(shí)進(jìn)行灌注培養(yǎng)具體指：將一個(gè)旋 轉(zhuǎn)過(guò)濾器（旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備、Spin filter)按放在反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)軸上，同時(shí)在反應(yīng)器上 安裝聲頻灌流裝置，進(jìn)行灌注培養(yǎng)。
[0015] 所述使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法同時(shí)進(jìn)行灌注培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基 從篩面通過(guò)，細(xì)胞位于篩面外，在旋轉(zhuǎn)過(guò)濾籠內(nèi)有吸取管，能夠?qū)⒒\內(nèi)的培養(yǎng)液栗出，同時(shí) 基于聲頻引起細(xì)胞聚集的新型細(xì)胞截留裝置，是利用聲頻使細(xì)胞聚集后沉淀，促使胞液分 離，不僅截留效率高，而且不易堵塞，易于清洗和滅菌，而且在培養(yǎng)過(guò)程中，可以將部分細(xì)胞 碎片與上清液一起分離出反應(yīng)器。
[0016] 本發(fā)明所提供的灌注培養(yǎng)方法可使用各種市售的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備和/或聲頻 灌流裝置，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)反應(yīng)體系的具體參數(shù)選擇合適的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備和/ 或聲頻灌流裝置用于灌注培養(yǎng)。
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟1中，批培養(yǎng)的培養(yǎng)體系體積為4. 9-5. 1L。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟1中，接種后培養(yǎng)體系中的細(xì)胞密度為0. 6-1. 0*106個(gè)/ml。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)重組FVIII細(xì)胞株的種類(lèi)選擇合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行批培 養(yǎng)，在本發(fā)明一實(shí)施例中，批培養(yǎng)的具體條件為溫度37°C、pH 6.9、溶氧（D0)30-50%、初始 轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/min。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟2中，當(dāng)培養(yǎng)體系中葡萄糖含量為0. 8-1. 2g/L時(shí)，使用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾 灌注方法進(jìn)入灌注培養(yǎng)模式。
[0021] 優(yōu)選的，所述步驟2中，灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體系體積為4. 9-5. 1L。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟2中，灌注培養(yǎng)模式期間，保持葡萄糖含量在0. 8-1. 2g/L。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟2中，保持培養(yǎng)體系中的細(xì)胞密度在1-2*107個(gè)/ml。
[0024] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)體系和反應(yīng)情況選取合適的方法從培養(yǎng)體系中抽取 部分細(xì)胞，以是培養(yǎng)體系的細(xì)胞密度維持在目標(biāo)區(qū)間。
[0025] 優(yōu)選的，所述步驟2中，灌注培養(yǎng)模式的培養(yǎng)時(shí)間為10-15天。
[0026] 優(yōu)選的，所述步驟3中，灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體系體積為4. 9-5. 1L。
[0027] 優(yōu)選的，所述步驟3中，維持細(xì)胞密度在2. 0-3. 0*107個(gè)/ml。
[0028] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)體系和反應(yīng)情況選取合適的方法從培養(yǎng)體系中抽取 部分細(xì)胞，以是培養(yǎng)體系的細(xì)胞密度維持在目標(biāo)區(qū)間。
[0029] 優(yōu)選的，所述步驟3中，灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為多60天。
[0030] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)重組FVIII細(xì)胞株的種類(lèi)選擇合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行灌注 培養(yǎng)，在本發(fā)明一實(shí)施例中，灌注培養(yǎng)的具體條件為溫度37°C、pH 6. 9、溶氧（DO) 30-50 %。
[0031] 本發(fā)明第二方面提供所述高效表達(dá)重組八因子的灌注培養(yǎng)方法在凝血八因子制 備領(lǐng)域的用途。
[0032] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)反應(yīng)體系的具體情況選取合適的提純方法對(duì)步驟3的反 應(yīng)液進(jìn)行處理，制備獲得凝血八因子產(chǎn)品。
[0033] 如上所述，本發(fā)明所提供的高效表達(dá)重組八因子的灌注培養(yǎng)方法采用聲頻灌流方 法和旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注方法相結(jié)合灌流培養(yǎng)，先將擴(kuò)增所得的重組FVIII細(xì)胞株的種子接種并 進(jìn)行批培養(yǎng)，待反應(yīng)器內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗到一定水平（以檢測(cè)葡萄糖含量為衡量標(biāo)準(zhǔn)），先打 開(kāi)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備進(jìn)入灌注培養(yǎng)模式，而后到達(dá)一定細(xì)胞密度后再打開(kāi)聲頻灌流裝置進(jìn) 行雙系統(tǒng)灌注培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過(guò)程中不定期抽去部分細(xì)胞，使反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞保持一個(gè)合 適的細(xì)胞密度。本發(fā)明所提供的灌注培養(yǎng)方法取兩種細(xì)胞截留方式的長(zhǎng)處，互補(bǔ)不足之處， 發(fā)揮最大的灌流效率。在細(xì)胞增殖生長(zhǎng)期，先使用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備進(jìn)行灌注培養(yǎng)，可以避 免聲頻灌流裝置在低密度條件下將細(xì)胞過(guò)多的帶出反應(yīng)器中，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量有一個(gè)驟減的 過(guò)程。而后達(dá)到一定細(xì)胞密度后，打開(kāi)聲頻灌流裝置，可以同時(shí)利用兩個(gè)截留系統(tǒng)進(jìn)行灌注 培養(yǎng)，一方面有了旋轉(zhuǎn)過(guò)濾灌注設(shè)備，使得可以讓聲頻灌流裝置在有效范圍內(nèi)達(dá)到最優(yōu)的 灌注體積，并且增加了反應(yīng)器內(nèi)溶氧的傳遞；另一方面，培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，在聲 頻灌流裝置的作用下離開(kāi)反應(yīng)器，使得反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞活率處在一個(gè)較高的水平。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū) 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0035] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"這個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0036]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0037] 除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. ffassarman and A. P. ffolffe,eds. ),Academic Press,San Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] (I)細(xì)胞的接種
[0040] 細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇一支表達(dá)重組FVIII的細(xì)胞株