專(zhuān)利名稱(chēng)：一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種類(lèi)似于DNA天然復(fù)制過(guò)程的體外DNA擴(kuò)增的卓越方法。主要由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:即①雙鏈模板DNA經(jīng)高溫變性后解鏈成單鏈；②在DNA聚合酶的作用下，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合！③DNA模板-引物結(jié)合物，以脫氧核糖核苷酸(dNTP)為原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。PCR技術(shù)所涉及的應(yīng)用研究領(lǐng)域極為廣泛，如疾病診斷、生物多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因序列克隆、核酸序列測(cè)定、核酸序列體外突變，考古工作等。PCR技術(shù)也是指數(shù)富集的核酸適配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。利用SELEX技術(shù)可以從人工合成的隨機(jī)單鏈核酸序列文庫(kù)中篩選出能夠與靶分子高特異性、高親和性結(jié)合的核酸適配體(aptamer)。SELEX技術(shù)廣泛適用于各種無(wú)機(jī)、有機(jī)小分子,肽,蛋白質(zhì),糖和抗生素,甚至復(fù)雜細(xì)胞和組織的檢測(cè)。尤其，當(dāng)靶分子為HIV-1表面糖蛋白(gpl20) ,MUCl-多肽(乳腺癌、胃癌等其他癌癥的腫瘤標(biāo)記物)，白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)等與重大疾病相關(guān)時(shí)，SELEX技術(shù)將為重大疾病的診療、癌癥的早期診斷提供依據(jù)。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)了多種用于提高PCR效率和專(zhuān)一性的添加劑，其中常見(jiàn)添加劑包括:(1)有機(jī)小分子類(lèi)添加劑，二甲亞砜(Shen, ff.H.and Hohn, B.Trends Genet.,1992,8,227-227 ；Jensen, M.A., Fukushima, M.and Davis, R.ff.Plos One,2010,5)、甘油(Chakrabarti, R.and Schutt, C.E.Nucleic AcidsResearch,2001,29,2377-2381.)、三甲基甘氨酸一水合物(Pinto, A., Bermudo Redondo, M.C., Cengiz Ozalp, V.and0' Sullivan, C.K.Mol .Biosyst., 2009, 5, 548-553.)、甲酸胺(Sarkar, G., Kapelner, S.andSommer, S.S.Nucleic AcidsRes.，1990，18，7465-7465.)、氯化四甲基銨、7-脫氮 _2’_ 脫氧鳥(niǎo)苷(deaza-dGTP) (Musso, M., Bocciardi, R., Parodi, S., Ravazzolo, R.and Ceccherini,1.J.Mol.Diagn.，2006，8，544-550) ； (2)非離子添加劑，0.1-1 % 的曲通 X-100、吐溫 20、諾納德 P-40(NP-40) (Li, M.，Lin, Y.C.，Wu, C.C.and Liu, H.S.Nucleic AcidsRes.,2005,33.) ；(3)蛋白類(lèi)添加劑，牛血清蛋白(BSA)、T4噬菌體基因32編碼蛋白(一種單鏈DNA結(jié)合蛋白)(Kreader, C.A.Appl.Environ.Microbiol.，1996,62,1102-1106.)等。然而，已知的增強(qiáng)劑在其適用范圍上都有局限性。例如，二甲亞砜、一水合三甲基氨甘酸可抑制二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，因此適用于鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量高(大于等于55% )的模板。而當(dāng)模板的GC含量小于50%時(shí)，這些添加劑對(duì)PCR顯示抑制作用。一些非離子的添加劑可以穩(wěn)定聚合酶，阻止模板DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，從而增加產(chǎn)物的生成量，但是同時(shí)也造成了非特異擴(kuò)增。最常見(jiàn)的蛋白類(lèi)增強(qiáng)劑，BSA，在擴(kuò)增傳統(tǒng)DNA模板時(shí)可以提高DNA聚合酶的穩(wěn)定性，減少反應(yīng)物在管壁的吸附，但對(duì)于高GC含量的模板增強(qiáng)效果不佳。因此，迫切需要尋找新的PCR增強(qiáng)劑，可更多地適用于不同模板體系和復(fù)雜環(huán)境背景條件下的擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，找到一種普適性增強(qiáng)劑應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系中，提高PCR的效率和專(zhuān)一性。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其中，使用牛凝血酶蛋白作為添加劑。優(yōu)選的，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為:0.0074 u g/mL <牛凝血酶蛋白< 84ii g/mLo進(jìn)一步,對(duì)于簡(jiǎn)單線(xiàn)性模板L和G的聚合酶鏈反應(yīng),所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為2.5 ii g/mL。對(duì)于隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)的聚合酶鏈反應(yīng)，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為25 ii g/mL。對(duì)于隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng),所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為64 ii g/mL。對(duì)于人類(lèi)全基因DNA樣本的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為Iu g/mL至150 ii g/mL。對(duì)于血清樣本中乙肝病毒基因的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為84y g/mL。對(duì)于加入納米金的聚合酶鏈反應(yīng)，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為0.0074ii g/mL至0.74ii g/mL。對(duì)于加入氧化石墨烯的聚合酶鏈反應(yīng),所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為50 ii g/mL。優(yōu)選的，根據(jù)前述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其中，牛凝血酶蛋白通過(guò)吸附在納米金或氧化石墨烯的表面來(lái)消除其對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)的抑制。凝血酶是一種常見(jiàn)的絲氨酸蛋白，在水溶液中成為可溶性的單鏈纖維蛋白原，用于催化與凝血相關(guān)的生理反應(yīng)。利用SELEX技術(shù)，人們成功地從人工合成的隨機(jī)單鏈核酸序列文庫(kù)中篩選出能與凝血酶特異結(jié)合的高親和性核酸適配體。隨著特異性結(jié)合適配體的出現(xiàn)，凝血酶常作為模型蛋白，用于SELEX和蛋白檢測(cè)的方法學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)將牛凝血酶蛋白(TB)加入PCR體系中，可廣泛的應(yīng)用于多種擴(kuò)增環(huán)境中來(lái)提高低濃度的模板的PCR效率和阻止引物二聚體的形成，可以消除納米材料對(duì)PCR的抑制作用。特別是與目前最常用的蛋白類(lèi)PCR添加劑BSA相比，TB的用量?jī)H是BSA常規(guī)用量的十分之一或更少。對(duì)于相關(guān)研究領(lǐng)域有潛在生物重要應(yīng)用價(jià)值。將牛凝血酶蛋白(TB)作為一種普適性增強(qiáng)劑應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系中，可顯著提高PCR的效率和專(zhuān)一性。其特征在于作為PCR增強(qiáng)劑TB適用范圍廣，可應(yīng)用于增強(qiáng)低模板濃度下單鏈DNA、低模板濃度下單鏈DNA隨機(jī)序列文庫(kù)、復(fù)雜樣本中DNA序列的擴(kuò)增、高GC含量模板的擴(kuò)增以及有抑制劑存在條件下的擴(kuò)增，消除納米材料對(duì)PCR的抑制作用。此外，與常見(jiàn)的蛋白類(lèi)PCR增強(qiáng)劑牛血清蛋白(BSA)相比，TB的用量更少，通常比前者少一個(gè)數(shù)量級(jí)。本發(fā)明具有如下的技術(shù)效果:1、采用TB作為PCR增強(qiáng)劑，可廣泛應(yīng)用于提高低模板濃度下單鏈DNA、低模板濃度下單鏈DNA隨機(jī)序列文庫(kù)、復(fù)雜樣本中DNA序列的擴(kuò)增效率；2、采用TB作為PCR增強(qiáng)劑，可抑制不同擴(kuò)增體系中引物二聚體的形成；3、采用TB作為PCR增強(qiáng)劑，可消除納米材 料對(duì)PCR的抑制作用；4、本發(fā)明所使用的蛋白質(zhì)TB常規(guī)用量?jī)H是BSA常規(guī)用量的十分之一或更少，廉價(jià)易得。


圖1是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高低模板濃度下單鏈DNA序列(L和G)的擴(kuò)增效率的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高低濃度條件下隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)的擴(kuò)增效率的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖3是示出實(shí)時(shí)定量PCR中加入牛凝血酶蛋白(TB)提高單鏈隨機(jī)DNA文庫(kù)的擴(kuò)增效率的圖。圖4是示出實(shí)時(shí)定量PCR退火溫度曲線(xiàn)的圖。圖5是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高人類(lèi)全基因樣本中性別基因的擴(kuò)增效率的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖6是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高HBV臨床樣本的擴(kuò)增效率和專(zhuān)一性的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖7是示出牛凝血酶蛋白(TB)消除納米金顆粒在全基因樣本中性別基因擴(kuò)增時(shí)的抑制作用的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖8是示出牛凝血酶蛋白(TB)消除氧化石墨烯(GO)對(duì)于單鏈DNA模板L和G在擴(kuò)增時(shí)的抑制作用的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖9是示出牛凝血酶蛋白(TB)在擴(kuò)增隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)時(shí)優(yōu)于牛血清蛋白(BSA)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖10是示出牛凝血酶蛋白(TB)在擴(kuò)增全基因模板中的性別基因時(shí)優(yōu)于牛血清蛋白(BSA)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖11是顏色反應(yīng) 顯示三種蛋白在模擬PCR體系中競(jìng)爭(zhēng)性吸附于納米金的圖。圖12是粒徑測(cè)量顯示三種蛋白在模擬PCR體系中競(jìng)爭(zhēng)性吸附于納米金的圖。
具體實(shí)施例方式表1:本發(fā)明中使用的核酸探針序列。
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，使用牛凝血酶蛋白作為添加劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為=0.0074 u g/mL彡牛凝血酶蛋白彡84y g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于簡(jiǎn)單線(xiàn)性模板L和G的聚合酶鏈反應(yīng),所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為2.g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)的聚合酶鏈反應(yīng)，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為25 ii g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為64 ii g/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于人類(lèi)全基因DNA樣本的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為Iu g/mL至150ii g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于血清樣本中乙肝病毒基因的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為84 ii g/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于加入納米金的聚合酶鏈反應(yīng)，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為0.0074 u g/mL至0.74y g/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，對(duì)于加入氧化石墨烯的聚合酶鏈反應(yīng)，所述牛凝血酶蛋白在反應(yīng)體系中的含量為50 ii g/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其特征在于，牛凝血酶蛋白通過(guò)吸附在納米金或 氧化石墨烯的表面來(lái)消除其對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)的抑制。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是采用牛凝血酶蛋白作為添加劑，應(yīng)用于多種類(lèi)型擴(kuò)增模板和擴(kuò)增環(huán)境中，以顯著提高聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的效率和專(zhuān)一性的方法。通過(guò)在PCR體系中添加適量牛凝血酶蛋白，可提高低模板濃度單鏈DNA模板、低模板濃度單鏈隨機(jī)序列DNA文庫(kù)、乙肝患者血清中乙肝病毒基因(HBV)、人類(lèi)全基因樣本中性別基因的擴(kuò)增效率和抑制引物二聚體的形成。此外，在有納米金、氧化石墨烯類(lèi)抑制劑存在的條件下，加入牛凝血酶蛋白，可消除抑制劑對(duì)于PCR反應(yīng)的抑制性作用。與目前最常用的蛋白類(lèi)PCR添加劑牛血清蛋白(BSA)相比，牛凝血酶蛋白的用量?jī)H是BSA常規(guī)用量的十分之一或更少。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103074329SQ20131004385
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者婁新徽, 張穎, 鄒如杏, 王文潔 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)