3,5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氨?；?tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列和SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本發(fā)明還提供一種3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，其包含：(i)3，5-二氟代酪氨酸；(ii)本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3，5-二氟代酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
【專利說(shuō)明】3,5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供一種氨?；?tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本發(fā)明還涉及一種3，5_二氟代酪氨酸(簡(jiǎn)寫(xiě)為F2Y)翻譯系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配對(duì)將3，5-二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3，5_ 二氟代酪氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用這套翻譯系統(tǒng)和這種方法產(chǎn)生的含有3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)，例如，插入3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，以及插入3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)于許多生物現(xiàn)象的引發(fā)是很必要的，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、泛素(ubiquitin)介導(dǎo)的蛋白降解等過(guò)程。特別是酪氨酸磷酸化，作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶活性調(diào)控的一種主要方式，通常通過(guò)引發(fā)蛋白質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)而介導(dǎo)生長(zhǎng)因子、荷爾蒙和細(xì)胞因子等對(duì)細(xì)胞膜上受體的信號(hào)調(diào)控。然而，酪氨酸磷酸化在細(xì)胞的所有磷酸化修飾中所占的比例卻非常低。大概10%的細(xì)胞蛋白會(huì)受到磷酸化共價(jià)修飾，但每100次蛋白的磷酸化修飾中僅有I次酪氨酸基團(tuán)的修飾。與大部分細(xì)胞中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化水平相t匕，酪氨酸磷酸化的水平估計(jì)要低2000倍。正是由于細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的水平相當(dāng)?shù)停拍鼙ＷC細(xì)胞在內(nèi)外信號(hào)的刺激下，作出靈敏的反應(yīng)，所以研究酪氨酸的磷酸化對(duì)于細(xì)胞信號(hào)的調(diào)控和許多重要 生物現(xiàn)象的研究具有極為重要的意義，而對(duì)發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)的識(shí)別及磷酸化位點(diǎn)的鑒定對(duì)揭示細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控和藥物的作用位點(diǎn)起到非常重要的作用。
[0003]19F-NMR技術(shù)由于其化學(xué)位移范圍大、不易出現(xiàn)峰重疊及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，自上個(gè)世紀(jì)50年代出現(xiàn)以來(lái)，在分析光學(xué)異構(gòu)體、生命科學(xué)等研究中有其特殊意義。在體內(nèi)核磁共振技術(shù)中，19F-NMR與其他方法相比，在不損傷樣品的條件下，就可進(jìn)行實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)。近30年，引入氟代指示劑進(jìn)行體內(nèi)19F-NMR的研究，含氟生物活性物質(zhì)以及含氟材料的研究受到很大的重視，19F-NMR技術(shù)及其應(yīng)用發(fā)展起來(lái)。從近10年的情況來(lái)看，含氟生物活性物質(zhì)的研究以及在醫(yī)藥、農(nóng)藥和具有優(yōu)異性能的含氟材料的研究應(yīng)用受到很大的重視，這是近期19F-NMR研究發(fā)展的一個(gè)主要特點(diǎn)。
[0004]根據(jù)先前的報(bào)道，含有3，5-二氟代酪氨酸的肽段作為蛋白酪氨酸激酶的底物，其表現(xiàn)出了與相應(yīng)的含有酪氨酸的肽段作為底物類(lèi)似的效率，并且不會(huì)顯著影響蛋白酪氨酸磷酸酶的催化活性。因此本研究旨在通過(guò)遺傳密碼擴(kuò)展，用非天然氨基酸3，5_ 二氟代酪氨酸替代酪氨酸，使其作為氟代指示劑，從而可以通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)及量化酪氨酸磷酸化水平。同時(shí)，本研究現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內(nèi)位點(diǎn)特異性地定點(diǎn)插入蛋白質(zhì)的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質(zhì)翻譯組分，所述組分識(shí)別合適的選擇密碼子(selector codon)從而能在體內(nèi)多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相應(yīng)的特異性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該Ο-tRNA。這些組分不與宿主生物體內(nèi)的任何內(nèi)源性tRNA、氨?；?tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(yīng)(B卩，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對(duì)可能遺傳編碼大量結(jié)構(gòu)各異的非天然氨基酸。
[0005]本領(lǐng)域普遍知道利用適合于制備含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng)，例如產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，參見(jiàn)國(guó)際公布號(hào)WO 2002/086075，其發(fā)明名稱為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ；TO 2002/085923，其發(fā)明名稱為 “ IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;W0 2004/094593，其發(fā)明名稱為“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定點(diǎn)特異性插入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)及它們的產(chǎn)生和使用方法的其他討論還可參見(jiàn)Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) I:1-11(2002) ；ffang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66(2005) ；Xie 和Schultz, Methods36 (3):227-238 (2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion in ChemicalBiology9 (6):548-554(2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249(2006)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]1、技術(shù)問(wèn)題
[0007]本發(fā)明提供一種氨?；?tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列 選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。這種氨?；?tRNA合成酶突變體能夠用3，5-二氟代酪氨酸(簡(jiǎn)寫(xiě)為F2Y)優(yōu)先氨?；c之配對(duì)的正交tRNA，從而在翻譯的氨基酸序列中插入F2Y。這是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)，本發(fā)明人還解析了它的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，相應(yīng)地，在本發(fā)明中將其命名為正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(F2YRS)。
[0008]在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3，5_ 二氟代酪氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用這種翻譯系統(tǒng)和這種方法產(chǎn)生的含有3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。
[0009]因此，本發(fā)明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3，5_ 二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入蛋白質(zhì)的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，并且提供利用該翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3，5-二氟代酪氨酸的方法。
[0010]本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的含有至少一個(gè)3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明人利用這種方法將3，5-二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，原核蛋白酪氨酸激酶Etk。通過(guò)本發(fā)明的方法得到的包含3，5_二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體蛋白可以作為氟代指示劑，從而通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)及量化酪氨酸磷酸化水平。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法也可以用于在蛋白酪氨酸激酶之外的多種蛋白中定點(diǎn)特異性插入3，5-二氟代酪氨酸，并不局限于該蛋白。2、技術(shù)方案
[0011]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)篩選，獲得一種正交氨?；?tRNA合成酶突變體，其為一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活性，在本發(fā)明中將其命名為正交3，5- 二氟代酪氨酸氨?；?tRNA合成酶(F2YRS)。同時(shí)，本發(fā)明人還解析了它的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。并且，本發(fā)明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研發(fā)了 3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)。
[0012]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，除了 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之外，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶”或“正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”還包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的保守性變體，只要所述保守性變體具有與SEQID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且還包括將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0013]并且，編碼本發(fā)明的正交3，5_ 二氟代酪氨酸氨?；?tRNA合成酶(F2YRS)的核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:3所示。
[0014]具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供在體內(nèi)(例如在宿主細(xì)胞內(nèi))識(shí)別選擇密碼子(selectorcodon)如琥珀終止密碼子(TAG)從而將非天然氨基酸3，5-二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入到多肽鏈中的3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)包含不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制相互作用的正交-tRNA (Ο-tRNA)和正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)配對(duì)。即，宿主細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶不會(huì)識(shí)別Ο-tRNA。類(lèi)似地，本發(fā)明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下不以可檢測(cè)水平地識(shí)別內(nèi)源性tRNA。利用所述翻譯系統(tǒng)能夠產(chǎn)生在翻譯過(guò)程中定點(diǎn)特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸的大量蛋白質(zhì)。
[0015]在一些方面中，本發(fā)明提供3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述翻譯系統(tǒng)包含:
[0016](a)非天然氨基酸，即3，5-二氟代酪氨酸，
[0017](b)本發(fā)明的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和
[0018](c)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3，5-二氟代酪氨酸)，優(yōu)先氨?；?-tRNA。
[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子，優(yōu)選地為琥珀密碼子。更優(yōu)選地，本發(fā)明的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0020]所述系統(tǒng)中所用的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)即為本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的氨酰基tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0021] 在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明提供一種3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含:[0022](i) 3，5- 二氟代酪氨酸；
[0023](ii)本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶；
[0024](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0025](iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
[0026]優(yōu)選地，所述3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0027]該翻譯系統(tǒng)中的各種組分可以衍生自各種物種來(lái)源，例如，該翻譯系統(tǒng)中的各組分衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA (Ο-tRNA)為古菌來(lái)源的反密碼子突變?yōu)榕c琥珀密碼互補(bǔ)的酪氨酸t(yī)RNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，優(yōu)選地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于該系統(tǒng)的正交氨?；?tRNA合成酶可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列及該序列的保守變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于該系統(tǒng)的正交氨?；?tRNA合成酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:4所示。
[0028]在一些方面中，本發(fā)明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。在優(yōu)選方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。 [0029]在一些方面中，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相對(duì)應(yīng)的正交tRNA序列的宿主細(xì)胞。所用的宿主細(xì)胞不作具體限定，只要正交氨酰基-tRNA合成酶和正交tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中保留它們的正交性即可。例如，所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌。
[0030]本發(fā)明還提供產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法。所述方法利用上述3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述方法通常包括下述步驟:
[0031](a)提供含有以下組分的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)的步驟:
[0032](i)非天然氨基酸，即3，5- 二氟代酪氨酸；
[0033](ii)本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)；
[0034](iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用3, 5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA ;和
[0035](iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；
[0036](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3，5- 二氟代酪氨酸，在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程中，3，5- 二氟代酪氨酸氨酰化的正交RNA識(shí)別編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA上的選擇密碼子以及3，5_ 二氟代酪氨酸，從而介導(dǎo)3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。
[0037]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，適當(dāng)?shù)闹亟M載體的構(gòu)建和宿主細(xì)胞的篩選可以通過(guò)常規(guī)分子克隆技術(shù)和篩選技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
[0038]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在步驟(b)中，將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可以通過(guò)多種方式進(jìn)行，例如，將所述正交tRNA序列、編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列分別可操作性地連接到適當(dāng)?shù)妮d體中，再以任意次序或三者共同轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；或者，也可以將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地連接到一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中(兩種序列之間有或無(wú)適當(dāng)?shù)慕宇^連接)，將編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列可操作性地連接到另一種不同的適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將構(gòu)建好的兩種重組載體共同轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；或者，也可以將所述正交tRNA序列和編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列可操作性地連接到一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中(兩種序列之間有或無(wú)適當(dāng)?shù)慕宇^連接)，將編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地連接到另一種不同的適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將構(gòu)建好的兩種重組載體共同轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中?；蛘?，也可以將正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列以任意適當(dāng)?shù)捻樞蚩刹僮餍缘剡B接在一起，然后克隆到一個(gè)載體上，最后轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。上述克隆方案都是可行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要容易地進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
[0039]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，為了避免宿主細(xì)胞對(duì)外源重組載體的“踢除”效應(yīng)，往往選擇用帶有不同抗生素標(biāo)記的載體來(lái)構(gòu)建需要共同轉(zhuǎn)化到同一宿主細(xì)胞中的核酸序列片段。對(duì)于適當(dāng)?shù)妮d體的選擇、重組載體的構(gòu)建、宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等等，都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，例如，可以參見(jiàn)美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版的分子克隆手冊(cè)。
[0040]在所述方法的一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過(guò)定點(diǎn)誘變使野生型氨?；?tRNA合成酶的氨 基酸結(jié)合口袋發(fā)生突變，選擇用所述非天然氨基酸(即3，5- 二氟代酪氨酸)優(yōu)先氨?；靓?tRNA的氨?；?tRNA合成酶突變體(即，本發(fā)明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述選擇步驟包括定點(diǎn)誘變后從得到的氨?；?tRNA合成酶分子庫(kù)進(jìn)行所述O-RS的正選擇和負(fù)選擇(參見(jiàn)下述實(shí)施例2)。在一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟還包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA為古菌來(lái)源的反密碼子突變?yōu)榕c琥珀密碼互補(bǔ)的酪氨酸t(yī)RNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。在這些方法中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟還包括提供含有所述翻譯系統(tǒng)所用的琥珀選擇密碼子的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸。
[0041]還可在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)施產(chǎn)生含有3，5_ 二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法。在這些情況中，提供的宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)(即，包含編碼本發(fā)明的O-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一個(gè)選擇密碼子的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸)，而在適宜的培養(yǎng)條件下(例如，在培養(yǎng)基中添加3，5-二氟代酪氨酸等)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞可導(dǎo)致在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3，5_ 二氟代酪氨酸。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)。
[0042]本發(fā)明還提供生產(chǎn)含有3，5- 二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突變體的方法，其利用上述產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法，其中所用的編碼原核蛋白酪氨酸激酶突變體的核酸序列在選定的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的選擇密碼子，在酪氨酸激酶的翻譯期間，3，5-二氟代酪氨酸定點(diǎn)插入到所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在選定位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突變體。
[0043]優(yōu)選地，本發(fā)明還提供生產(chǎn)含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體的方法，所述方法利用上述3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)進(jìn)行，所述方法通常包括下述步驟:
[0044](a)提供含有以下組分的3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)的步驟:
[0045]⑴3，5- 二氟代酪氨酸；
[0046](ii)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)；
[0047](iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3, 5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述Ο-tRNA ;和
[0048](iv)編碼所述原核蛋白酪氨酸激酶的核酸，例如，但不限于，SEQ ID N0:7，其中所述核酸含有所述Ο-tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；
[0049](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3，5-二氟代酪氨酸，在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)(即原核蛋白酪氨酸激酶)的翻譯過(guò)程中，3，5_ 二氟代酪氨酸氨酰化的正交RNA識(shí)別編碼酪氨酸激酶的mRNA上的選擇密碼子以及3，5- 二氟代酪氨酸，從而介導(dǎo)3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)插入所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定位置(即，所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸 位置)。
[0050]本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的作為氟代指示劑的含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，在野生型原核蛋白酪氨酸激酶的574位引入3，5_ 二氟代酪氨酸，所述酪氨酸激酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:8。所述激酶突變體與野生型酪氨酸激酶一樣在適宜條件下可以進(jìn)行活性中心酪氨酸的自磷酸化，從而激活自身的蛋白激酶活性。
[0051]本發(fā)明還提供一種新穎的鑒定目標(biāo)蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的方法，所述方法包括利用本發(fā)明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)將所述目標(biāo)蛋白中推定進(jìn)行磷酸化的酪氨酸取代為3，5- 二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5- 二氟代酪氨酸的目標(biāo)蛋白突變體，利用該目標(biāo)蛋白突變體作為氟代指示劑，通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)3，5- 二氟代酪氨酸的磷酸化，從而鑒定所述酪氨酸位點(diǎn)是否是酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。
[0052]例如，已知原核蛋白酪氨酸激酶具有較低程度的自身磷酸化能力，目前尚沒(méi)有合適的技術(shù)能夠檢測(cè)并且量化其自身磷酸化水平。但是，利用本發(fā)明的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)將原核蛋白酪氨酸激酶活性中心574位酪氨酸殘基替換為3，5-二氟代酪氨酸，得到含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，再通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)并且量化該原核蛋白酪氨酸激酶突變體的自身酪氨酸磷酸化水平。該原核蛋白酪氨酸激酶突變體的酪氨酸磷酸化水平在一定程度上可以代表野生型原核蛋白酪氨酸激酶的自身磷酸化水平。此外，這個(gè)檢測(cè)結(jié)果也證明原核蛋白酪氨酸激酶活性中心574位酪氨酸是其自身酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。
[0053]因此，本發(fā)明提供下述:
[0054]1.一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0055]2.一種3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含:
[0056](i) 3，5-二氟代酪氨酸；
[0057](ii)第I項(xiàng)所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0058](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0059](iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
[0060]3.如第2項(xiàng)所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且所述翻譯系統(tǒng)還包含編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0061]4.一種宿主細(xì)胞，其包含編碼第I項(xiàng)所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相對(duì)應(yīng)的正交tRNA序列。
[0062]5.如第4項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。
[0063]6.一種產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟:
[0064](a)提供第2項(xiàng)所述的3，5_ 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含:
[0065](i) 3，5- 二氟代酪氨酸；
[0066](ii)第I項(xiàng)所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
[0067](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA ;和
[0068](iv)編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子；和
[0069](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3，5- 二氟代酪氨酸，在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸氨?；恼籺RNA識(shí)別編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA上的選擇密碼子以及3，5- 二氟代酪氨酸，從而介導(dǎo)3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在所選位置含3，5- 二氟代酪氨酸的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。
[0070]7.如第6項(xiàng)所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
[0071]8.生產(chǎn)含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體的方法，其利用第6項(xiàng)所述的方法，其中所用的編碼原核蛋白酪氨酸激酶突變體的核酸序列在選定的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的選擇密碼子，在激酶的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)插入到所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在選定位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體。
[0072]9.由第8項(xiàng)所述的方法獲得的含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:8。
[0073]10.一種鑒定目標(biāo)蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的方法，所述方法包括利用第6項(xiàng)的方法將所述目標(biāo)蛋白中推定進(jìn)行磷酸化的酪氨酸取代為3，5-二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5-二氟代酪氨酸的目標(biāo)蛋白突變體，利用該目標(biāo)蛋白突變體作為氟代指示劑，通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)3，5- 二氟代酪氨酸的磷酸化，從而鑒定所述酪氨酸位點(diǎn)是否是酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。
[0074]11.編碼第I項(xiàng)的正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0075]13.如第11項(xiàng)所述的核苷酸序列，其為SEQ ID NO:3。
[0076]3、有益效果
[0077]本研究通過(guò)篩選得到了一種正交氨酰基-tRNA合成酶，并且，在此基礎(chǔ)上研發(fā)了3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)。通過(guò)該系統(tǒng)可以在目標(biāo)蛋白一例如，原核蛋白酪氨酸激酶Etk中定點(diǎn)特異性插入3，5- 二氟代酪氨酸，產(chǎn)生574位含有3，5- 二氟代酪氨酸的酪氨酸激酶突變體，將其作為氟代指示劑，從而可以通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)及量化酪氨酸磷酸化水平。
[0078]我們這種探測(cè)酪氨酸磷酸化水平的新方法與傳統(tǒng)方法相比有許多的優(yōu)勢(shì)。首先，可以直接檢測(cè)及量化目標(biāo)蛋白質(zhì)某一特定位點(diǎn)的酪氨酸磷酸化水平。其次，樣品可以隨時(shí)凍存，接著再進(jìn)行19FNMR光譜分析，這樣，可以最大限度地縮短樣品的制備時(shí)間，以便更精確地定量蛋白質(zhì)樣品的磷酸化水平。第三，由于19F的高靈敏度，相對(duì)于環(huán)境的化學(xué)位移各向異性以及19F-19F直接耦合的缺乏，單位點(diǎn)整合19F結(jié)合NMR分析可以更有效地用來(lái)闡明蛋白的動(dòng)態(tài)特性。最后，NM R研究可能有助于揭示真核和原核蛋白酪氨酸激酶活性狀態(tài)和非活性狀態(tài)的運(yùn)動(dòng)特性，以及這些狀態(tài)之間的動(dòng)態(tài)交換。這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使我們能夠獲得直接證據(jù)來(lái)證明并且量化原核蛋白酪氨酸激酶Etk活性中心磷酸化水平，而這在以前是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。并且，這種監(jiān)測(cè)酪氨酸激酶激活及活性的方法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，可以為酪氨酸激酶/底物蛋白相互作用的新型抑制劑篩選提供有效的途徑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0079]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0080]圖1是本發(fā)明的正交3，5- 二氟代酪氨酸氨?；?tRNA合成酶(F2YRS)的晶體結(jié)構(gòu)圖；
[0081 ] 圖2:圖2A是體外氨?；饔玫乃嵝阅蛩鼐郾０纺z電泳圖，圖2B是F2Y-綠色熒光蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖2C和圖2D是F2Y-綠色熒光蛋白的質(zhì)譜圖；
[0082]圖3是3，5- 二氟代酪氨酸(F2Y)(下圖)和o_磷酸_3，5_ 二氟代酪氨酸(pF2Y)(上圖)的19F-NMR譜圖；
[0083]圖4:圖4A是野生型原核蛋白酪氨酸激酶(Etk，泳道I)和Etk_574_F2Y (泳道2)的SDS-PAGE電泳圖，圖4B是Etk_574_F2Y和酪氨酸磷酸酶PTPlB的Western檢測(cè)圖(上圖是PTyr抗體，下圖是His抗體)，圖4C是Etk_574_F2Y磷酸化的19F-NMR譜圖，圖4D是Etk-574-F2Y脫磷酸化的19F-NMR譜圖；
[0084]圖5是正交tRNA、野生型酪氨酰tRNA合成酶、本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶、綠色熒光蛋白突變體、原核蛋白酪氨酸激酶突變體和蛋白酪氨酸磷酸酶的序列?！揪唧w實(shí)施方式】
[0085]以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0086]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得的分析純級(jí)別的試劑。
[0087]實(shí)施例1:0_磷酸-3，5- 二氟代酪氨酸(pF2Y)的化學(xué)合成
[0088]取IOOmM三氯氧磷、100mM3，5-二氟代酪氨酸(購(gòu)自上海吉爾生化公司)和500mM氫氧化鈉，溶解至5mL，然后室溫?cái)嚢鑜h。收集水相，通過(guò)HPLC分離純化得到白色粉末，產(chǎn)率10%。(YMC AA12S052503WT column, 12ml/min flow rate, froml0% to90% CH3CN,0.1%TFA (w/v) in water, over the course of 30 min).MS:m/z:298 [M+H] + ； IH-NMR (600MHz,D20):7.03 (d, 2H) 4.01 (dd, 1H) 3.21 (m, 2H)。
[0089]以上合成反應(yīng)所需化學(xué)試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自北京化工廠，均為分析純以上級(jí)別。
[0090]實(shí)施例2:進(jìn)化F2Y特異性氨酰基-tRNA合成酶
[0091]為了在基因中位點(diǎn)特異性插入F2Y，需要在所用的E.coli宿主細(xì)胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交對(duì)，這個(gè)正交對(duì)來(lái)源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥拍抑制酪氨酰 tRNA (MjtRNAaj/) / 酪氨酰 tRNA 合成酶(MjYRS，野生型，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2)對(duì)。MjYRS突變庫(kù)構(gòu)建在卡納霉素抗性pBK質(zhì)粒(購(gòu)自美國(guó)scr ipps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)中，位于該質(zhì)粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的啟動(dòng)子和終止子之間。所使用的合成酶突變庫(kù)為pBk-lib-jwl庫(kù)，該突變庫(kù)的構(gòu)建方法為:在MjYRS基因上挑選6個(gè)位點(diǎn)(Y32，Leu65，Phel08, Glnl09，Aspl58，和 Leul62)引入 NNK 突變(N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6 個(gè)位點(diǎn)(Ile63, Ala67,His70, Y114，Ilel59，Val 164)或隨機(jī)突變?yōu)?Gly 或保持不變(參見(jiàn) Xie，J.；Liu, ff.S.；Schultz, P.G.Angew.Chem.，Int.Ed.2007，46，9239-9242 ；Wang, JY.；Zhang W.；Song WJ ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010，132，14812-14818)。
[0092]通過(guò)正負(fù)篩選來(lái)進(jìn)化特異性識(shí)別F2Y的氨?；?tRNA合成酶。正篩選質(zhì)粒包含MjtRNAcu/, TAG突變的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，啟動(dòng)表達(dá)綠色熒光蛋白的琥珀突變的T7RNA聚合酶，四環(huán)素抗性基因。負(fù)篩選質(zhì)粒包含MjtRNAa/，在阿拉伯糖操縱子下的琥珀突變芽孢桿菌RNA酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。進(jìn)行3輪正負(fù)篩選:包含有正篩選質(zhì)粒的E.coli DH10B細(xì)胞作為正篩選寄主細(xì)胞。細(xì)胞電轉(zhuǎn)pbk-lib-jwl庫(kù)，SOC培養(yǎng)基(2%(W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母粉，0.05% (W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM 葡萄糖)在37°C培養(yǎng)I小時(shí)。之后換用極限培養(yǎng)基(GMML極限培養(yǎng)基的配方:M9鹽/甘油:764gNa2HP04.7H20或者 30g Na2HPO4,15g KH2PO4, 2.5g NaCl，5g NH4Cl, 50ml 甘油，高壓滅菌，pH7.0 ；1M MgSO4:高壓滅菌；50mM CaCl2:高壓滅菌；25mM FeCl2:過(guò)濾滅菌;0.3Μ亮氨酸:溶解于0.3Μ NaOH中，過(guò)濾滅菌；1L液體GMML培養(yǎng)基:200ml M9鹽/甘油，2ml MgSO4, 2mlCaCl2, 2ml FeCl2, Iml亮氨酸)洗兩次，鋪板固體極限培養(yǎng)基(在液體GMML培養(yǎng)基中加入500ml3%瓊脂粉，ImM F2Y，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四環(huán)素)，37°C培養(yǎng)60小時(shí)。收取細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，電泳分離，膠回收。然后，將經(jīng)過(guò)正篩選的pBK-lib-jwl轉(zhuǎn)化到包含負(fù)篩選質(zhì)粒的DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中。SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)I小時(shí)。之后涂板包含
0.2%阿拉伯糖(購(gòu)自sigma公司)的LB固體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl)。37°C培養(yǎng)8-12小時(shí)。共重復(fù)3輪。
[0093]最后一輪正篩選挑384個(gè)克隆，分別點(diǎn)板在含有ImM F2Y、氯霉素60，80，120，160 μ g/mL的GMML固體培養(yǎng)基上，及不包含F(xiàn)2Y、但包含氯霉素0，20，40，60 μ g/mL的GMML固體培養(yǎng)基。挑選在在ImM F2Y160 μ g/mL氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在OmM F2Y，濃度大于20 μ g/mL氯霉素培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。最終挑出I個(gè)克隆，插入3，5- 二氟代酪氨酸效率最高，測(cè)序表明，克隆所包含的氨?；?tRNA合成酶突變體(F2YRS)的氨基酸序列為 SEQ ID NO:4 所示，其中突變位點(diǎn)為 Tyr32Arg，Leu65Tyr, His70Gly, Phel08Asn,Glnl09Cys, Aspl58Asn 和 Leul62Ser。
[0094]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，除了 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之外，術(shù)語(yǔ)“正交氨酰基-tRNA合成酶”或“正交3，5- 二氟代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”還包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的保守性變體，只要所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且還包括將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0095]同時(shí)，本發(fā)明人還解析了 F2YRS的晶體結(jié)構(gòu)(圖1)，為F2YRS特異性整合F2Y提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0096]實(shí)施例3:體外氨基?；饔梅治?br> [0097]為了驗(yàn)證F2YRS在目標(biāo)蛋白中整合F2Y的高效性和保真度，我們進(jìn)行了體外氨基?；饔梅治?。取50mM氯化鈉，20mM氯化鎂，4mM 二硫蘇糖醇，2mM ATP, 10 μ M Tyr tRNA,3μΜ F2YRS和2mM酪氨酸或者F2Y，溶解于20mM，pH8.0的Tris緩沖液中，37°C孵育lh。反應(yīng)液進(jìn)行24h酸性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2A所示，F(xiàn)2YRS只能整合F2Y，而無(wú)法整合酪氨酸。
[0098]實(shí)施例4:表達(dá)F2Y-綠色熒光蛋白及質(zhì)譜鑒定
[0099]將正交tRNA (SEQ ID NO:1)和篩選出來(lái)的編碼F2YRS的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)構(gòu)建到pEVOL載體(購(gòu)自美國(guó)scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)上，編碼綠色熒光蛋白的核苷酸序列(151TAG) (SEQ ID NO:5)構(gòu)建到pET載體(購(gòu)自美國(guó)scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)上，然后共轉(zhuǎn)化到DHlOB細(xì)胞(購(gòu)自全式金公司)中。挑取單個(gè)克隆在37°C培養(yǎng)到0D_約等于1.2時(shí)，向LB培養(yǎng)基中加入ImM IPTG，0.02%阿拉伯糖(購(gòu)自sigma公司)及0.5mM F2Y培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照不加入F2Y。8小時(shí)之后，收菌，N1-NTA純化蛋白，并用SDS-PAGE電泳分析(圖2B)。
[0100]我們發(fā)現(xiàn)，只有在存在F2Y的培養(yǎng)基中才能純化出全長(zhǎng)的綠色熒光蛋白，這說(shuō)明篩選出來(lái)的F2YRS可以特異性的識(shí)別F2Y。在LB培養(yǎng)基中F2Y-綠色熒光蛋白的產(chǎn)率為60mg/L，而野生型綠色熒光蛋白的產(chǎn)率為100mg/L。為了檢測(cè)F2Y僅僅插入到綠色熒光蛋白的151位琥珀突變位點(diǎn)，我們對(duì)151-F2Y-綠色蛋白進(jìn)行了 ES1-TOF質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果分子量為27746Da(圖2C，D)，與計(jì)算的分子量27746Da吻合。
[0101]實(shí)施例5:表達(dá)F2Y-原核蛋白酪氨酸激酶突變體及酪氨酸磷酸化檢測(cè)
[0102] 我們選取原核蛋白酪氨酸激酶Etk的C末端胞漿區(qū)片段(451位-726位，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，用基因工程方法構(gòu)建了 Etk突變體，其中574位突變?yōu)門(mén)AG終止密碼子，然后用實(shí)施例4中的相同方法在Etk突變體的574位定點(diǎn)特異性插入F2Y，表達(dá)產(chǎn)生突變蛋白Etk-574-F2Y(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)，產(chǎn)率為12.5mg/L，而野生型Etk的產(chǎn)率為20mg/L(圖4A)。
[0103]為了驗(yàn)證Etk活性中心的574位酪氨酸能否進(jìn)行自磷酸化，我們?nèi)⊥蛔兊鞍譋tk-574-F2Y，于 ρΗ8.5 的緩沖液(含有:20mM Tris, 20mM NaCl,2mM ATP 和 5mM MgC12)中25°C孵育30min。作為對(duì)照，我們往突變蛋白Etk_574_F2Y中加入0.125mg/mL蛋白酪氨酸磷酸酶PTPlB (通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法克隆表達(dá)而得到，或者也可以商購(gòu)獲得，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)進(jìn)行脫磷酸化，然后于ρΗ8.5的緩沖液(含有:20mMTris，20mMNaCl和ImM EDTA)中25°C孵育30min。孵育結(jié)束后，分別取少量混合液進(jìn)行Western驗(yàn)證，剩余樣品立刻凍干后進(jìn)行19F-NMR分析。同時(shí)，我們?nèi)2Y和實(shí)施例1中新合成的pF2Y進(jìn)行19F-NMR分析，作為驗(yàn)證F2Y是否磷酸化的對(duì)照。結(jié)果如圖3和圖4C，D所示，F(xiàn)2Y的19F化學(xué)位移為-133.lppm，而pF2Y為-126.7ppm(圖3)。圖4C和D顯示，僅含有Etk_574_F2Y的混合液分別在-122.3ppm和-134.5ppm處都出現(xiàn)了信號(hào)峰，而加入PTPlB的混合液，僅在-134.5ppm處出現(xiàn)信號(hào)峰，說(shuō)明Etk_574_F2Y的574位二氟代酪氨酸在緩沖液中發(fā)生了自磷酸化，這一結(jié)論與western的檢測(cè)結(jié)果完全一致(圖4B)。同時(shí)，通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，僅有3.8%的二氟代酪氨酸發(fā)生了磷酸化，這與先前報(bào)道中所稱的原核蛋白酪氨酸激酶活性中心的磷酸化水平很低也是一致的。
[0104]應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中 進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。
【權(quán)利要求】
1.一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQID NO:4所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
2.—種3，5- 二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含: (i)3，5-二氟代酪氨酸； (?)權(quán)利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA ;和 (iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
3.如權(quán)利要求2所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且所述翻譯系統(tǒng)還包含編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一種宿主細(xì)胞,其包含編碼權(quán)利要求1所述的正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列和相對(duì)應(yīng)的正交tRNA序列。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌細(xì) 胞。
6.一種產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3，5-二氟代酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟: (a)提供權(quán)利要求2所述的3，5-二氟代酪氨酸翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含: (i)3，5-二氟代酪氨酸； (?)權(quán)利要求1所述的正交氨?；?tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3，5- 二氟代酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA ;和 (iv)編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子；和 (b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3，5_ 二氟代酪氨酸，在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸氨?；恼籺RNA識(shí)別編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA上的選擇密碼子以及3，5- 二氟代酪氨酸，從而介導(dǎo)3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)特異性插入所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，產(chǎn)生在所選位置含3，5- 二氟代酪氨酸的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
8.生產(chǎn)含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體的方法，其利用權(quán)利要求6所述的方法，其中所用的編碼原核蛋白酪氨酸激酶突變體的核酸序列在選定的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的選擇密碼子，在激酶的翻譯期間，3，5- 二氟代酪氨酸定點(diǎn)插入到所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在選定位置含有3，5- 二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體。
9.由權(quán)利要求8所述的方法獲得的含有3，5-二氟代酪氨酸的原核蛋白酪氨酸激酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:8。
10.一種鑒定目標(biāo)蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的方法，所述方法包括利用權(quán)利要求6的方法將所述目標(biāo)蛋白中推定進(jìn)行磷酸化的酪氨酸取代為3，5_ 二氟代酪氨酸，由此得到含有3，5-二氟代酪氨酸的目標(biāo)蛋白突變體，利用該目標(biāo)蛋白突變體作為氟代指示劑，通過(guò)19F-NMR技術(shù)來(lái)檢測(cè)3，5- 二氟 代酪氨酸的磷酸化，從而鑒定所述酪氨酸位點(diǎn)是否是酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK104004723SQ201310056306
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月22日
【發(fā)明者】王江云, 李發(fā)慧, 李家松, 龔為民, 江歡歡 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所