南方紅豆杉ssr-pcr反應(yīng)體系及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明建立并優(yōu)化了南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系。通過對南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系的影響因素（引物、dNTP、Taq?DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多個水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗，篩選出各反應(yīng)因素的最佳水平，建立了南方紅豆杉SSR-PCR?20μL最佳反應(yīng)體系：引物2μM、dNTP?40μM、Taq?DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA?75ng。該體系的建立能很好地滿足南方紅豆杉基因組DNA擴(kuò)增要求，并為南方紅豆杉的SSR分子標(biāo)記及遺傳多態(tài)性分析奠定了一定基礎(chǔ)。
【專利說明】南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系及其 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei )為裸子植物亞門（Cymmospermai ) 松杉綱（Coniferopside)紅?杉目（Taxales)紅?杉科（Taxaceae S. F. Gery)紅?杉屬 (Taxus Linn.)植物，是中國紅豆杉屬植物中分布最為廣泛的一個種，自然分布于亞熱帶各 省區(qū)。紅豆杉樹皮中因含有抗癌藥物成分紫杉醇導(dǎo)致其被大量砍伐或破壞，現(xiàn)已處于瀕危 狀態(tài)，在1999年我國國務(wù)院公布的《國家重點保護(hù)植物名錄(第一批)》中被列為國家一級 保護(hù)植物。南方紅豆杉材質(zhì)優(yōu)異，是高檔珍貴用材，其紫杉醇含量雖稍低于喜馬拉雅紅豆杉 等，但因早期速生、生物收獲量大，適宜短周期作業(yè)而具有巨大的藥用開發(fā)利用價值。
[0003] SSR (簡單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星DNA，Simple Sequence Repeats或 Microsatellite DNAs)標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記 技術(shù)。與其它分子標(biāo)記相比，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記在鑒定上顯示了獨特的優(yōu)越 性：SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高；具有復(fù)等位基因的特性，提供的 信息量高；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；每個位點由設(shè)計的引物序列決定，便于不同實驗 室相互交流合作開發(fā)引物，獲得的資料能夠在不同的實驗室重復(fù)并共享；且操作簡便、穩(wěn)定 性、重復(fù)性好。已成為目前應(yīng)用最廣泛的第二代共顯性分子遺傳標(biāo)記。
[0004] 因此，建立一個穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好的南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步研 究南方紅豆杉遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供優(yōu)化的南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系及其應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系總 體積20uL，其中，上、下游引物各2μΜ、dNTP 40yM、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+1.0mM和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配制。
[0007] 其中，上游引物 F :5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下游引物 R : 5 ^ -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3 ^。
[0008] PCR 擴(kuò)增程序為：94°C 5min ;94°C 45s，56°C 45s，72°C 45s，35 個循環(huán)；60°C 30min〇
[0009] 其中，模板DNA的提取包括以下步驟：
[0010] (1)取-7(TC保存的南方紅豆杉嫩葉0· 5?lg，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液 氮研磨成粉末；
[0011] (2)將粉末快速轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，加入lmL 65°C預(yù)熱的CTAB提取液，充分混 勻，65°C水浴30?45min。其間不時搖動離心管使之混勻；
[0012] (3)取出離心管，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清到新離心管中；
[0013] (4)加入等體積的Tris平衡酚/氯仿/異戊醇（即Tris平衡酚、氯仿和異戊醇混 合液，其中，Tris平衡酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 :24 :1)輕輕地顛倒混勻，放置lOmin， 4°C 12000rpm 離心 lOmin;
[0014] (5)重復(fù)步驟（4);
[0015] (6)吸上清到新離心管中，加入2-3倍體積的_20°C預(yù)冷無水乙醇和1/10體積醋 酸鈉，混勻，_20°C放置30min以上，沉淀DNA ;
[0016] (7)4°C 12000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉淀兩次，自然風(fēng)干，加入300-500yL 去離子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ;
[0017] (8)溶解后的DNA再用氯仿/異戊醇（即氯仿和異戊醇的混合液，二者體積比為24: 1)抽提一次；
[0018] (9)沉淀用70%乙醇洗滌沉淀兩次，然后自然風(fēng)干后加入50 μ L去離子水；
[0019] (10) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，_20°C保存。
[0020] 本發(fā)明還提供所述SSR-PCR反應(yīng)體系在南方紅豆杉SSR分子標(biāo)記及輔助育種中的 應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明建立并優(yōu)化了南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系。通過對南方紅豆杉SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA)在多個水平上進(jìn)行優(yōu)化 試驗，篩選出各反應(yīng)因素的最佳水平，建立了南方紅豆杉SSR-PCR 20 μ L最佳反應(yīng)體系：弓丨 物2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+l. OmM和模板DNA75ng。該體系的建立能很好 地滿足南方紅豆杉基因組DNA擴(kuò)增要求，并為南方紅豆杉的SSR分子標(biāo)記及遺傳多態(tài)性分 析奠定了一定基礎(chǔ)。
[0022] 通過建立一個穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好的南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步研 究南方紅豆杉遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等奠定基礎(chǔ)，為開展植物分子輔助育 種、遺傳轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)基因等方面的研究提供有價值的理論依據(jù)，從而為科學(xué)制定南方紅豆 杉遺傳保育策略及種質(zhì)資源利用提供分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明提取樣品的總DNA檢測結(jié)果；其中，Μ為DL15000DNA Marker :從上 到下分別為 15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp，1-93 泳道為樣本。
[0024] 圖2為本發(fā)明引物濃度對SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響；其中，Μ為DNA Marker，1? 5 引物濃度分別為 1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5μΜ。
[0025] 圖3為本發(fā)明dNTPs濃度對SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響；其中，Μ為DNA Marker，l? 5dNTPs 濃度分別為 10、20、30、40、50 μ Μ。
[0026] 圖4為本發(fā)明Taq DNA聚合酶濃度對SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中，Μ為DNA Marker， 1 ?5Taq DNA 聚合酶濃度分別為 0· 1、0· 25、0· 5、0· 75、L OU。
[0027] 圖5為本發(fā)明對SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響；其中，Μ為DNAMarker，1?5Mg2+濃度 分別為 〇· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5U。
[0028] 圖6為本發(fā)明模板DNA濃度對SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響；其中，Μ為DNA Marker， 1?5模板DNA濃度分別為65、70、75、80、85ng。
[0029] 圖7為本發(fā)明SSR-PCR引物對南方紅豆杉的個體擴(kuò)增結(jié)果。

【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0031] 實施例南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0032] 1材料與方法
[0033] 1. 1樣品材料
[0034] 由中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所邱德有教授提供的南方紅豆杉作為優(yōu)化實驗 材料。
[0035] 1. 2基因組DNA的提取
[0036] 用改良CTAB法提取基因組DNA。提取的總DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及 完整性，結(jié)果如圖1所述。核酸蛋白分析儀Nanodrop 8000測定結(jié)果顯示，A260/A280值位 于1. 7-1. 9之間。結(jié)果表明，用改良的CTAB方法提取，能夠得到高質(zhì)量的DNA，可直接用于 SSR-PCR 反應(yīng)。
[0037] 其中，模板DNA的提取包括以下步驟：
[0038] (1)取_70°C保存的南方紅豆杉嫩葉0. 5?lg，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液 氮研磨成粉末；
[0039] (2)將粉末快速轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，加入lmL 65°C預(yù)熱的CTAB提取液，充分混 勻，65°C水浴30?45min。其間不時搖動離心管使之混勻；
[0040] (3)取出離心管，4°C 12000rpm離心10min，取上清到新離心管中；
[0041] (4)加入等體積的Tris平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比25 :24 :1)輕輕地顛倒混 勻，放置 l〇min，4°C 12000rpm 離心 10min;
[0042] (5)重復(fù)步驟（4);
[0043] (6)吸上清到新離心管中，加入2-3倍體積的_20°C預(yù)冷無水乙醇和1/10體積醋 酸鈉，混勻，_20°C放置30min以上，沉淀DNA ;
[0044] (7)4°C 12000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉淀兩次，自然風(fēng)干，加入300-500yL 去離子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ;
[0045] (8 )溶解后的DNA再用氯仿/異戊醇(體積比24 :1)抽提一次；
[0046] (9)沉淀用70%乙醇洗滌沉淀兩次，然后自然風(fēng)干后加入50 μ L去離子水；
[0047] (10) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，_20°C保存。
[0048] 1.3 SSR-PCR 程序
[0049] PCR反應(yīng)在GeneAmp 9600 PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min， 94°C變性45s，56°C復(fù)性45s，72°C延伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)，最后60°C延伸30min。
[0050] 1.4 SSR-PCR 體系
[0051] 為得到擴(kuò)增穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好的SSR-PCR反應(yīng)體系，對影響PCR的5個主要因 素(模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和引物）分別進(jìn)行了單因子多水平的優(yōu)化實驗。 SSR-PCR反應(yīng)的主要因素水平見表1。
[0052] 表1 SRAP-PCR反應(yīng)的因素與水平
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系總體積20uL，其中，上、 下游引物各 2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA 聚合酶 lU、Mg2+l. OmM 和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配 制； 其中，上游引物 F:5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下游引物 R: 5' -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR-PCR反應(yīng)體系，其特征在于，PCR擴(kuò)增程序為：94°C 51^11;941：458,561：458,721：458,35個循環(huán)；6〇1：3〇11^11。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SSR-PCR反應(yīng)體系，其特征在于，模板DNA的提取包括以 下步驟： (1) 取-70°C保存的南方紅豆杉嫩葉0. 5?lg，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研 磨成粉末； (2) 將粉末快速轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，加入lmL 65°C預(yù)熱的CTAB提取液，充分混勻， 65°C水浴30?45min。其間不時搖動離心管使之混勻； (3) 取出離心管，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清到新離心管中； (4) 加入等體積的Tris平衡酚/氯仿/異戊醇輕輕地顛倒混勻，放置10min，4°C 12000rpm離心lOmin ;其中，Tris平衡酚、氯仿、異戊醇的體積比為25 :24 :1 ; (5) 重復(fù)步驟（4); (6) 吸上清到新離心管中，加入2-3倍體積的-20°C預(yù)冷無水乙醇和1/10體積醋酸鈉， 混勻，-20°C放置30min以上，沉淀DNA ; (7) 4°C 12000rpm離心10min，70%乙醇洗滌沉淀兩次，自然風(fēng)干，加入300-500yL去 離子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ; (8) 溶解后的DNA再用氯仿/異戊醇抽提一次；其中，氯仿、異戊醇的體積比為24 :1 ; (9) 沉淀用70%乙醇洗滌沉淀兩次，然后自然風(fēng)干后加入50 μ L去離子水； (10) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性，-20°C保存。
4. 權(quán)利要求1-3任一項所述SSR-PCR反應(yīng)體系在南方紅豆杉SSR分子標(biāo)記及輔助育種 中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099319SQ201310117573
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月7日
【發(fā)明者】付偉, 任鶴, 朱振營, 黃新 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院