專利名稱：Sr48692在制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及SR48692在藥物和保健品制備領(lǐng)域的新用途。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)瘤是目前我國(guó)最常見的一種原發(fā)惡性腦腫瘤。據(jù)國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院統(tǒng)計(jì)資料顯示，膠質(zhì)瘤占顱內(nèi)腫瘤的35.269Γ60.96%，平均44.69%，且近年來發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)。由于膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)方式，與周圍的正常腦組織界限模糊，很難通過手術(shù)徹底清除。目前針對(duì)術(shù)后殘留的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，主要采用放療、化療等措施來加以殺滅，然而這些術(shù)后殘留病變對(duì)放療、化療等措施表現(xiàn)出顯著的抵抗性，往往導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，患者預(yù)后不佳。近10年來，盡管膠質(zhì)瘤的綜合治療如手術(shù)、放療、化療、生物治療等方面取得了一系列進(jìn)展，但治療效果尚不令人滿意，膠質(zhì)瘤患者的平均生存期仍然較短，2年生存率不足30%，5年生存率不足5%。因此，新的有效治療策略和治療藥物的研究將對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療產(chǎn)生積極影響。神經(jīng)緊張素(NTS)通過與神經(jīng)緊張素受體(NTSR)結(jié)合，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中起神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)的作用。SR48692是首個(gè)非肽類的神經(jīng)緊張素受體I (NTSRl)拮抗齊U，化學(xué)名為2- ([1- (7-氯-4-喹啉基)-5- (2，6- 二甲氧基苯基)-1H-吡咯-3-羰基]氨基)金剛烷-2-羧酸，目前作為一種科學(xué)研究試劑，主要用于探索大腦中NTS與其它神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)之間的相互作用。部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SR48692具有鎮(zhèn)靜、反藥物依賴和記憶減退的作用。既往研究還發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的前期臨床腫瘤模型中，SR48692具有一定的抗癌效果。但迄今為止 ，SR48692對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的作用仍然未知。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供SR48692在制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品中的應(yīng)用。腫瘤細(xì)胞的最主要特征是持續(xù)不斷地增殖和遷移。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)SR48692具有能夠抵抗惡性膠質(zhì)瘤的新功能，主要通過阻斷ERK和MET/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，在進(jìn)一步的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了上述結(jié)論，表明SR48692可以用于制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明公開了 NTSRl拮抗劑SR48692在藥物和保健品制備領(lǐng)域的新用途，不僅擴(kuò)大了 SR48692的應(yīng)用范圍，提高了其應(yīng)用價(jià)值，給惡性膠質(zhì)瘤的治療帶來了新的希望，還有助于進(jìn)一步開發(fā)新的藥物或保健品，以SR48692為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)修飾或改造，有望進(jìn)一步提高其活性或降低副作用。本發(fā)明受國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(N0.30901538)、國(guó)家自然科學(xué)基金青年-面上連續(xù)資助項(xiàng)目(N0.81270039)和家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(N0.20120014)資助。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明:
圖1顯示了 SR48692能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，A為CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果，B為BrdU標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果；圖中SR表示SR48692，*表示與對(duì)照組(control)比較 P < 0.01。圖2顯示了 SR48692能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，A為Transwell穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B為免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖中SR表示SR48692，NTS-NA表示NTS中和抗體，*表示與對(duì)照組比較P < 0.01 ;#表示與IOnM NTS組比較P < 0.01。圖3顯示了 SR48692在膠質(zhì)瘤原位接種的鼠模型上具有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和遷移的功能，A為小鼠生存曲線，B為死亡小鼠的大腦，C為死亡小鼠大腦的HE染色結(jié)果，圖中SR表示 SR48692。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖，對(duì)SR48692抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用及其效果進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、SR48692能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖
通過CCK-8法和BrdU標(biāo)記法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261的增殖能力，了解SR48692對(duì)GL261增殖的影響。CCK-8法:將GL261細(xì)胞以 密度為2X IO3個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基100 μ 1，37°C培養(yǎng)過夜，次日將培養(yǎng)基更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，分為四組(實(shí)驗(yàn)組1、2、3和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，實(shí)驗(yàn)組I加入終濃度為5nM的NTS，實(shí)驗(yàn)組2加入終濃度為5nM的NTS和終濃度為5 μ M的SR48692，實(shí)驗(yàn)組3加入終濃度為5ηΜ的NTS和終濃度為10 μ M的SR48692，對(duì)照組加入用于配制SR48692溶液的溶劑DMS0，各組分別于處理后第0、24、48、72、96、120小時(shí)加入CCK-8溶液(Ce 11 Counting Kit_8)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)450nm處的吸光值(0D值)，繪制各組OD值隨時(shí)間的變化曲線(即細(xì)胞生長(zhǎng)曲線)，以檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。BrdU標(biāo)記法:將預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸包被的圓形玻片即爬片用75%乙醇消毒，自然晾干之后置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔底部，將GL261細(xì)胞以密度為2 X IO4 /ml接種于爬片上，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基100 μ 1，37°C培養(yǎng)過夜，次日將培養(yǎng)基更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，分為四組(實(shí)驗(yàn)組1、2、3和對(duì)照組)，實(shí)驗(yàn)組I加入終濃度為5nM的NTS，實(shí)驗(yàn)組2加入終濃度為5nM的NTS和終濃度為5 μ M的SR48692，實(shí)驗(yàn)組3加入終濃度為5ηΜ的NTS和終濃度為10 μ M的SR48692，對(duì)照組加入用于配制SR48692溶液的溶劑DMS0，處理48小時(shí)后各組加入終濃度為30 μ g/L的BrdU，37°C孵育40分鐘，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次(每次5分鐘)，加入4%多聚甲醛固定15分鐘，用含
0.3%Triton X-100的PBS洗滌3次以增加細(xì)胞膜通透性，再加入10%山羊血清室溫封閉30分鐘，PBS洗滌3次，再加入一抗即抗大鼠BrdU單抗(工作濃度1:100)，4°C孵育過夜，PBS洗滌3次，再加入二抗即Cy3標(biāo)記山羊抗大鼠抗體(工作濃度1:500)，室溫孵育2小時(shí)，PBS洗滌3次，再加入DAPI染液處理15分鐘，PBS洗滌3次，最后取出爬片，用抗熒光淬滅劑封于載玻片，在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)這四組爬片中10個(gè)20倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)每組的BrdU陽性率。結(jié)果見圖1。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，SR48692對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261的增殖具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)；在SR48692分別對(duì)GL261細(xì)胞處理24、48、72、96、120小時(shí)的情況下，相比于對(duì)照組，5 μ M和10 μ M濃度的SR48692均能夠明顯地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，而隨著SR48692濃度的增加，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制效果逐步增強(qiáng)(圖1Α)。BrdU標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)過5μΜ濃度的SR48692處理48小時(shí)后，BrdU陽性率明顯降低；經(jīng)過10 μ M濃度的SR48692處理48小時(shí)后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞無肉眼可見的BrdU陽性信號(hào)，表明10 μ M濃度的SR48692能夠明顯地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖(圖1Β)。二、SR48692能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移
通過transwell穿孔實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261的遷移能力，了解SR48692對(duì)GL261遷移的影響。Transwell穿孔實(shí)驗(yàn):設(shè)置實(shí)驗(yàn)組1、2和對(duì)照組，各組將GL261細(xì)胞以密度為
IX IO6個(gè)/ml鋪在Transwell小室底部的上室面(孔徑為8 μ m)，再將小室置24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用無血清DMEM/12培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后，實(shí)驗(yàn)組I加入終濃度為5nM的NTS和終濃度為5 μ M的SR48692，實(shí)驗(yàn)組2加入終濃度為5ηΜ的NTS和終濃度為2ng/ml的NTS中和抗體，對(duì)照組加入終濃度為5nM的NTS，處理3小時(shí)后取出小室，用棉簽反復(fù)擦拭除去小室上室內(nèi)的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定小室下室內(nèi)的細(xì)胞15分鐘，再用結(jié)晶紫染色液對(duì)小室下室內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行染色，最后取出小室在倒置顯微鏡下觀察拍照，染色細(xì)胞即代表發(fā)生遷移的細(xì)胞。劃痕愈合實(shí)驗(yàn):將GL261細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為三組(實(shí)驗(yàn)組1、2和對(duì)照組)，用含10%胎牛血 清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，將培養(yǎng)基更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后，實(shí)驗(yàn)組I加入終濃度為5nM的NTS，實(shí)驗(yàn)組2加入終濃度為5nM的NTS和終濃度為5 μ M的SR48692，對(duì)照組加入用于配制SR48692溶液的溶劑DMS0，各組在培養(yǎng)板底部用10 μ I槍頭劃痕，72小時(shí)后觀察劃痕愈合情況。免疫印跡實(shí)驗(yàn):將GL261細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，分為六組(實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4、5和對(duì)照組)，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，將培養(yǎng)基更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后，實(shí)驗(yàn)組I加入終濃度為5ηΜ的NTS，實(shí)驗(yàn)組2加入終濃度為IOnM的NTS，實(shí)驗(yàn)組3加入終濃度為IOnM的NTS和終濃度為5 μ M的SR48692，實(shí)驗(yàn)組4加入終濃度為5ηΜ的NTS和終濃度為2ng/ml的NTS中和抗體，實(shí)驗(yàn)組5加入終濃度為5nM的NTS、終濃度為5 μ M的SR48692和終濃度為2ng/ml的NTS中和抗體，對(duì)照組加入用于配制SR48692溶液的溶劑DMS0，培養(yǎng)一定時(shí)間后分別收集各組細(xì)胞，與pERKl/2抗體和ERK2抗體進(jìn)行免疫雜交，計(jì)算ERKl蛋白的磷酸化水平。結(jié)果見圖2。Transwell穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SR48692處理GL261細(xì)胞3小時(shí)的情況下，5 μ M濃度SR48692處理后的細(xì)胞穿過transwell微孔的數(shù)量比對(duì)照組多了 20%(圖2A)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GL261細(xì)胞經(jīng)過5 μ M濃度SR48692處理72小時(shí)后，劃痕基本上沒有發(fā)生變化，而對(duì)照組劃痕愈合情況良好，間距縮小了 47%。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GL261細(xì)胞中ERKl蛋白的磷酸化水平隨著SR48692的處理發(fā)生了顯著的下降(圖2Β)，ERKl蛋白是與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的Akt-MET通路的關(guān)鍵蛋白，其磷酸化水平下降直接抑制相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞遷移受到抑制。三、SR48692在膠質(zhì)瘤原位接種的鼠模型上具有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和遷移的功能 將C57小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。將所有小鼠顱內(nèi)原位注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261
(每只注射10萬個(gè)細(xì)胞)，3天后開始給予荷瘤小鼠腹腔注射給藥，低、中、高劑量藥物處理組分別按2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的劑量給予SR48692的DMSO溶液，對(duì)照組給予等體積的溶劑DMS0，連續(xù)給藥5天，此后每日觀察各組小鼠的生活狀態(tài)，記錄小鼠死亡時(shí)間，至最后I只小鼠死亡為止，繪制小鼠生存曲線。然后，將每只死亡小鼠進(jìn)行解剖，取出整塊大腦，肉眼觀察外觀，再進(jìn)行HE染色。結(jié)果見圖3。小鼠生存曲線顯不，5mg/kg、10mg/kg SR48692處理組小鼠的生存期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(圖3A)。 死亡小鼠的大腦外觀圖顯示，對(duì)照組小鼠的大腦出現(xiàn)水腫，而10mg/kg SR48692處理組小鼠的大腦界限清晰(圖3B)。HE染色結(jié)果顯示，5mg/kg、IOmg/kg SR48692處理組小鼠的大腦中膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和遷移均受到抑制(圖3C)。上述結(jié)果說明SR48692在膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型上也具有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和遷移的功能。最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.SR48692在制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗膠質(zhì)瘤是抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移 。
全文摘要
本發(fā)明公開了神經(jīng)緊張素受體1拮抗劑SR48692用于制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品的新用途，不僅擴(kuò)大了SR48692的應(yīng)用范圍，提高了其應(yīng)用價(jià)值，給惡性膠質(zhì)瘤的治療帶來了新的希望，還有助于進(jìn)一步開發(fā)新的藥物或保健品，以SR48692為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)修飾或改造，有望進(jìn)一步提高其活性或降低副作用。
文檔編號(hào)A23L1/29GK103156848SQ20131013114
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者易良, 龔雪陽, 崔紅娟, 許民輝, 徐倫山 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院