專利名稱：表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的質(zhì)粒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的質(zhì)粒及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小菜蛾屬于鱗翅目菜蛾科，英文名:Diamondback moth ；學(xué)名-,Plutellaxy1ste I la (L.)，是世界性遷飛害蟲，主要為害甘藍、青花菜、白菜、油菜等十字花科植物。自1953年首次報道小菜蛾對DTT產(chǎn)生抗性以來，到目前為止，小菜蛾已對50多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，幾乎涉及到所有的防治用藥。精氨酸激酶(ArginineKinase, AK) (ATP: Argine N-phosphotransferase EC
2.7.3.3)屬于磷酸原激酶家族，廣泛存在于無脊椎動物及軟體動物中，類似于脊椎動物中的肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)，是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶(張元 臣等.煙夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表達分析[J]，昆蟲學(xué)報，54 ( 7):754-761.)。蘇云金芽孢桿菌(ifeci77i/5.thuringiensis,簡稱Bt)是一種分布廣泛地革蘭氏陽性芽孢桿菌，在芽孢形成期可產(chǎn)生具有殺蟲活性的伴胞晶體，且伴胞晶體(原毒素)對鱗翅目或雙翅目等多種昆蟲具有殺毒活性(Wight A P, Davis M E.Design and preparationof organic-1norganic hybrid catalysts[J].Chem Rev, 2002, 102(10): 3589-3614.)，是目前應(yīng)用最廣泛，研究最深入、生產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑。雖然Bt殺蟲劑具有對人畜安全無害、不污染環(huán)境，有一定的特異性和選擇性的殺蟲作用等優(yōu)點，但也存在穩(wěn)定性差、殘效期短、殺蟲譜窄等問題，嚴(yán)重影響了 Bt的實際應(yīng)用。這使得改造Bt成為一種必然?，F(xiàn)階段由于穿梭質(zhì)粒載體、整合載體、Bt轉(zhuǎn)座一解離載體等的成功構(gòu)建，已經(jīng)成功的將一些外源基因轉(zhuǎn)入到蘇云金芽孢桿菌中。但這些改造都集中在蘇云金芽孢桿菌本身改造，特別是對其毒蛋白的改造。RNA 干擾(即 RNAi)就是利用雙鏈 RNA (double strain RNA, dsRNA)介導(dǎo)相對應(yīng)的基因的沉默(Geley, S.，Muller C.RNA1: ancient mechanism with a promisingfuture.Exp Gerontol, 2004, 39 (7): 985-998)。它的干擾機制是 RNaseIII 核酶家族的成員Dicer酶特異性地與雙鏈RNA結(jié)合并將其剪切成23 nt大小的小分子RNA片段。雙鏈的小分子RNA片段隨后與RNA引起的沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex,RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，并在RISC的介導(dǎo)下與具有互補序列的mRNA結(jié)合，從而引起mRNA的降解。通過注射和喂食dsRNA試驗研究昆蟲的功能基因，發(fā)現(xiàn)一些基因的沉默對昆蟲的生長發(fā)育有顯著的影響。因此，利用RNAi效應(yīng)來抑制昆蟲中必需基因的功能進而導(dǎo)致其死亡，以保護植物免受害蟲的危害，這在理論上是可行的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可在蘇云金芽孢桿菌中表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的質(zhì)粒，為小菜蛾的控制提供新途徑。本發(fā)明的質(zhì)粒，是在質(zhì)粒pHT305a的及麗Y I和I酶切位點之間插入SEQ IDN0.1所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pHT305AKR。本發(fā)明還保護了所述的質(zhì)粒pHT305AKR構(gòu)建的工程菌。本發(fā)明還保護了所述的質(zhì)粒pHT305AKR構(gòu)建的蘇云金芽孢桿菌工程菌。本發(fā)明還保護了所述的蘇云金芽孢桿菌工程菌在制備Bt生物殺蟲劑中的應(yīng)用。

詳述如下:
所述的質(zhì)粒PHT305AKR中，外源基因為小菜蛾精氨酸激酶部分基因，核苷酸序列具體如 SEQ ID N0.4 所示。所述的質(zhì)粒PHT305AKR可在大腸桿菌中大量拷貝，可在蘇云金芽孢桿菌菌株中表達。用質(zhì)粒pHT305AKR作為質(zhì)粒構(gòu)建的工程菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。用質(zhì)粒PHT305AKR作為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建得到的表達基因dsRNA的質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述質(zhì)粒PHT305AKR中含有正向啟動子pro3a (+)和反向啟動子pro3a (-)；所述正向啟動子pro3 a (+)和反向啟動子pro3a (-)是蘇云金芽孢桿菌cry基因的啟動子，二者是反向互補序列；所述的正向啟動子pro3 a (+)序列如SEQ ID N0.2所示,所述的反向啟動子pro3a (-)序列如SEQ ID N0.3所示。用質(zhì)粒pHT305AKR作為出發(fā)質(zhì)粒獲得的新的質(zhì)粒并利用該新質(zhì)粒獲得的工程菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護一種利用所述的質(zhì)粒進行RNA干擾的方法，是將干擾的靶標(biāo)基因作為外源基因插入穿梭質(zhì)粒PHT305AKR的Sal I和Sph I酶切位點間，得到表達靶標(biāo)基因的dsRNA,使得相應(yīng)的靶標(biāo)基因沉默。本發(fā)明還保護一種利用所述穿梭質(zhì)粒pHT305AKR改造蘇云金芽孢桿菌而獲得的Bt生物殺蟲劑的方法。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
1、本發(fā)明利用平滑末端隨機連接和限制性內(nèi)切酶酶切得到了可表達精氨酸激酶基因的dsRNA的質(zhì)粒。2、本發(fā)明提供的質(zhì)粒不僅實現(xiàn)了在蘇云金芽孢桿菌表達dsRNA的研究，為把RNAi技術(shù)應(yīng)用于蘇云金芽孢桿菌基因的功能鑒定和蘇云金芽孢桿菌功能基因組的研究提供強有力的手段，也可以利用宿主細菌合成dsRNA，降低了獲得dsRNA的成本。3、本發(fā)明為蘇云金芽孢桿菌的改造提供了新的思路，為提高蘇云金芽孢桿菌生物殺蟲劑的殺蟲效果，研制蘇云金芽孢桿菌生物農(nóng)藥開拓了一個新的方向。4、本發(fā)明通過研究小菜蛾精氨酸激酶基因的RNAi方法和效果，為小菜蛾的控制提供新途徑，也為RNAi理論和技術(shù)在害蟲控制提供借鑒，開創(chuàng)害蟲控制的新領(lǐng)域。


圖1為pHT305a的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為pHT305AKR的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為正向啟動子、反向啟動子和目的基因片段的電泳示意圖；泳道1: pro3a( + )，泳道 2:AK 片段,泳道 3 -.pro3a (_)。圖4為RNA電泳圖；其中泳道1:工程菌，泳道2:原始菌。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述具體實施中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述具體實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。酶切所用的限制性內(nèi)切酶、酶連接所用的T4連接酶、PCR所用的Taq酶均購自TAKARA公司，膠回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒和PUM-T載體試劑盒均購自Bio Teke公司，動物組織總RNA提取試劑盒和培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄用的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自invitrogen公司，出發(fā)載體pHT305a(結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)由福建農(nóng)林大學(xué)重點實驗室關(guān)雄老師所贈，氨芐青霉素(以下簡寫為Amp)購自生工生物工程有限公司，紅霉素(以下簡寫為Erm)購自Solarbio公司。實施例1、質(zhì)粒pHT305AKR構(gòu)建
一、蘇云金芽孢桿菌基因的啟動子片段的制備
1.1提取質(zhì)粒pHT305a
取含有質(zhì)粒pHT305a菌株的單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含有50ng/ml Amp和50ng/mlErm)中過夜培養(yǎng)，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1002)提取質(zhì)粒pHT305a。1.2 PCR擴增蘇云金芽孢桿菌cry III A基因的pro3 α (+)啟動子片段
以質(zhì)粒pHT305a為模板，設(shè)計一對弓I物(兩個弓I物V端分別弓I入BamH I和Sph I酶切識別序列和保護堿基)。上游引物OlF:5' -GTCTGGATCCGAAATTAGTTATACAAGCATT-3 ;(下劃線為及麗Y I識別序列)；
下游引物 OlR:5' - ACATGCATGCTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3 ;(下劃線為 5^1 識別序列)。用上述引物進行PCR，得到1072bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收?；厥债a(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。1.3 cry III A基因的pro3 α (+)啟動子片段的酶切
將pro3a (+)啟動子片段用I和5於I內(nèi)切酶進行雙酶切反應(yīng)(37°C 6小時)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，即為酶切后的基因的ρΓ03α (+)啟動子片段。1.4 PCR擴增蘇云金芽孢桿菌cry III A基因的pro3 α㈠啟動子片段
以質(zhì)粒pHT305a為模板，設(shè)計一對引物(兩個引物5 ^端分別引入I和I酶切識別序列和保護堿基)。上游引物-TGCACTGCAGGAAATTAGTTATACAAGCATT-3 ;(下劃線為 I識別序列)；
下游引物 021^:5' -AGATGTCGACTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3 ;(下劃線為 I 識別序列)。用上述引物進行PCR，得到1072bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收?；厥债a(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。1.5 cry III A基因的pro3 α (-)啟動子片段的酶切
將pro3a (-)啟動子片段用I和I內(nèi)切酶進行雙酶切反應(yīng)(37°C 6小時)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，即為酶切后的基因的ρΓ03α (-)啟動子片段。二、小菜蛾精氨酸激酶基因片段的制備
2.1提取小菜蛾總RNA
取小菜蛾幼蟲(來自本實驗飼養(yǎng)的品系)，使用動物組織總RNA提取試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP431)提取總 RNA。2.2反轉(zhuǎn)錄得到cDNA
使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將步驟2.1中得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2.3 PCR擴增目 的基因片段
根據(jù)小菜蛾AK全基因序列(GenBank:HQ327310.1 )，確定大小為325bp的基因片段。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計如下引物,并在其中一條引物的一端加上5於I酶切位點和保護喊基。上游引物-ACATGCATGCCCGCCAACGCTTGCCGCTT-3;(下劃線為 5於 I 識別序列)；
下游引物 031^:5' -TGGTACTTGGACGCCACCT-3 ;。用上述引物進行PCR，得到325bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收?；厥债a(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。2.4目的基因片段于PUM-T載體的連接
用PUM-T載體試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP6701)連接目的片段。2.5目的基因片段的酶切
將上述步驟2.4中用I內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)(37°C 6小時)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，即為酶切后的目的基因片段。三、載體骨架的制備
3.1提取質(zhì)粒pHT305a
取含有質(zhì)粒pHT305a菌株的單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含有50ng/ml Amp和50ng/mlErm)中過夜培養(yǎng)，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1002)提取質(zhì)粒pHT305a。3.2將質(zhì)粒pHT305a用BamH I內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)(30°C 6小時)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Teke膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，即為酶切后的載體骨架。四、質(zhì)粒pHT305AKR 構(gòu)建4.1將上述步驟一得到的酶切后的正向啟動子pro3a (+)片段與上述步驟二得到的酶切后的目的基因片段用T4連接酶進行連接(16°C 12小時)。酶連產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Teke膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，得到正向啟動子與目的基因片段的連接產(chǎn)物。4.2將上述步驟4.1中得到的連接產(chǎn)物用Sph I內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)(37°C 6小時)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收。4.3將上述步驟4.2得到的連接產(chǎn)物與載體骨架用T4連接酶進行連接(16°C 12小時)。酶連產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Teke膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，得到含有正向啟動子與目的基因片段的連接產(chǎn)物。4.4將上述步驟4.3中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，涂板，37°C過夜培養(yǎng)。4.5 挑取陽性克隆菌斑搖菌擴增，用Bio Teke的高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1002)提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，用01引物對和03引物對組合成的引物進行PCR擴增，得到2027bp的PCR產(chǎn)物。4.6提取上述步驟4.5中的質(zhì)粒用Pst I和Sal I內(nèi)切酶進行雙酶切反應(yīng)(37°C6小時)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Teke膠回收試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收，即為后續(xù)連接酶切后的反向啟動子pro3a (-)片段的載體骨架。4.7將上述步驟一得到的酶切后的反向啟動子pro3a (-)片段與上述步驟4.6得到的酶切后的載體骨架用T4連接酶進行連接(16°C 12小時)。4.8將上述步驟4.7得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，涂板，37°C過夜培養(yǎng)。4.9挑取陽性克隆菌斑搖菌擴增，用Bio Teke的高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1002)提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，用OlF和02R組成的引物對進行PCR擴增，得到2.5kb左右的PCR產(chǎn)物JfPCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物中含有如SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。質(zhì)粒pHT305AKR的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。實施例2、蘇云金芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建和應(yīng)用 一、質(zhì)粒提取
取含有質(zhì)粒PHT305AKR菌株的單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含有50ng/ml Amp和50ng/mlErm)中過夜培養(yǎng)，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP1002)提取質(zhì)粒pHT305AKR。二、蘇云金芽孢桿菌BMB171感受態(tài)制備
2.1將BMB171于30 0C，200r/min搖床過夜培養(yǎng)。2.2按1%接種量轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，30°C，220r/min培養(yǎng)至OD6tltl為1.2-1.5為止。2.3將步驟2.2中的培養(yǎng)液于冰上放置lOmin，轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷的大離心管，6000r/η η、4。。離心 lOmin。2.4棄去上清,加入IOml冰預(yù)冷的SG緩沖液,6000r/min、4°C離心IOmin,去上清。
重復(fù)3次。2.5用SG緩沖液從懸菌體，分裝于Ep管中，_80°C保存。三、工程菌構(gòu)建
3.1將5ul質(zhì)粒加入200ul BMB171感受態(tài)細胞中，混勻后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，冰上放置30min讓其徹底冷卻。3.2電轉(zhuǎn):電轉(zhuǎn)條件為2.5kv, 25uF, 200 Ω，電擊后冰浴5min。3.3復(fù)蘇:將電擊杯中的菌液轉(zhuǎn)至EP管中，并加入SOC培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)2h。3.4涂板:回收菌體，涂布于LB平板(含Erm和Amp)上，30°C倒置培養(yǎng)過夜。3.5挑取陽性克隆菌斑搖菌擴增，以菌落為模板，以引物對Ol和02組成的引物對進行菌落PCR驗證。用上述引物進行PCR，得到2497bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑(產(chǎn)品目錄:DP1602)進行純化回收?；厥债a(chǎn)物進行測序，測 序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。四、蘇云金芽孢桿菌工程菌的應(yīng)用
4.1提取重組菌株和原始菌株的總RNA。挑取陽性單菌落，于液體LB培養(yǎng)液中搖床過夜培養(yǎng)，利用養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒(產(chǎn)品目錄:DP430)提取工程菌總RNA。4.2將上述步驟4.1中提取得到的總RNA分別用核酸酶SI處理30min。4.3將上述步驟4.2中得到的酶處理產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖4所示，證明了本發(fā)明提供的質(zhì)?？蓪崿F(xiàn)在蘇云金芽孢桿菌中表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA。4.4喂食試驗
將蘿卜葉浸泡在4.1處理后的菌液中，然后放置在培養(yǎng)瓶中，飼養(yǎng)小菜蛾幼蟲。觀察其死亡情況。統(tǒng)計小菜蛾在第2天、第4天和第6天的死亡率，分別為70 %、82.22 %、97.78 %。說明改造后的工程菌具有明顯的殺蟲效果，為小菜蛾的控制提供新途徑。
權(quán)利要求
1.一種表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的質(zhì)粒，其特征在于:所述表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的質(zhì)粒是在質(zhì)粒pHT305a飽BamH I和I酶切位點之間插入SEQ IDN0.1所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pHT305AKR。
2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒PHT305AKR構(gòu)建的工程菌。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒PHT305AKR構(gòu)建的蘇云金芽孢桿菌工程菌。
4.如權(quán)利要求3所述的蘇云金 芽孢桿菌工程菌在制備Bt生物殺蟲劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的質(zhì)粒及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了質(zhì)粒pHT305AKR，是在質(zhì)粒pHT305a的BamHI和PstI酶切位點之間插入SEQIDNO.1所示的DNA得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒pHT305AKR不僅實現(xiàn)了在蘇云金芽孢桿菌表達dsRNA的研究，為把RNAi技術(shù)應(yīng)用于蘇云金芽孢桿菌基因的功能鑒定和蘇云金芽孢桿菌功能基因組的研究提供強有力的手段，也可以利用宿主細菌合成dsRNA，降低了獲得dsRNA的成本。本發(fā)明還為外源改造蘇云金芽孢桿菌，研制蘇云金芽孢桿菌生物農(nóng)藥提供了方向，具有廣闊的應(yīng)用前景。同時本發(fā)明為小菜蛾的控制提供新途徑，開創(chuàng)害蟲控制的新領(lǐng)域。
文檔編號C12N1/21GK103215299SQ20131013447
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者楊廣, 尤民生, 陳金芝, 徐秀鳳, 汪淑燕 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)